Опухолевые супрессоры и мутаторные гены (стр. 2 )

р53 дикого типа, в дополнение к латентной и стрессовой, может временно приобретать и так называемую мутантную конформацию, сходную с той, в которую молекула р53 необратимо переходит при онкогенных мутациях. Транзиторный переход р53 в мутантную конформацию происходит при воздействии определенных цитокинов и/или морфогенов (PDGF, тромбопоэтин, ретиноевая кислота и др.). Биологический смысл такого перехода пока неясен. Возможно, он заключается в полной инактивации рост-ингибирующих активностей р53 и/или изменении набора его генов-мишеней.

Таким образом, р53 играет важную охранную роль, являясь по образному выражению D. Lane, "стражем генома". Его повседневная функция заключается, по-видимому, в распознавании и исправлении ошибок, неизменно возникающих в ходе репликации ДНК. При массивных повреждениях ДНК, других внутриклеточных нарушениях или угрозе их возникновения происходит переключение функций р53 (Рис. 4): приобретая транскрипционные активности и изменяя экспрессию генов-мишеней, он вызывает либо остановку размножения аномальных клеток (временную, для устранения повреждений, или необратимую), либо их гибель (факторы, определяющие судьбу клетки при активации р53 будут рассмотрены ниже). В результате устраняется возможность накопления в организме генетически измененных клеток.

Механизмы активации р53 при стрессах и внутриклеточных повреждениях. Активация транскрипционных функций р53 наблюдается при самых разнообразных стрессах и внутриклеточных нарушениях: УФ - и g-облучении, присутствии в клетке разорванной ДНК, понижении внутриклеточного пула нуклеотидов, ингибировании ДНК - и РНК-полимераз, гиперэкспрессии онкогенов, вирусной инфекции, гипоксии, оксидативном стрессе, гипо - и гипертермии, различных нарушениях клеточной архитектуры (увеличении числа ядер, изменениях цитоскелета и адгезии) и т. д.

Ключевую роль в стабилизации белка р53 и повышении его транскрипционной активности играют изменения взаимодействия р53 с белком-ингибитором Mdm2, ген которого является потенциальным онкогеном. Белок Mdm2 связывается с N-концом молекулы р53 и, обладая активностями Е3 убиквитин-лигазы, стимулирует убиквитинизацию и, как результат, протеосомную деградацию белка р53. Поэтому, в норме уровень экспрессии р53 очень невелик, а время его жизни составляет всего около 30 минут. Кроме того, связываясь с N-концевым участком р53 в районе домена, взаимодействующего с базовыми факторами транскрипции, Mdm2 подавляет способность р53 транс-активировать гены-мишени.

A)

Б)

Рис. 4. Охранные функции р53.
А). Функции "латентной" и "стрессовой" форм р53.
Б) Факторы, вызывающие транскрипционную активацию р53, гены-мишени активированного р53 и вызываемые изменениями их экспрессии биологические эффекты.

При внутриклеточных нарушениях, в частности при повреждениях ДНК, происходит фосфорилирование р53 по сайтам (Ser15, Ser20, Ser33), расположенным в районе связывания с белком Mdm2. Такое фосфорилирование осуществляют специфические киназы (ATM, ATR, и их мишени - чекпойнткиназы CHK1, CHK2), которые активируются в ответ на разнообразные нарушения структуры ДНК (см. раздел 3.11.1). Кроме того, ATM фосфорилирует и белок Mdm2. В результате блокируется связывание р53 с Mdm2, что вызывает стабилизацию молекул р53 и повышение их транскрипционной активности. При некоторых других внутриклеточных изменениях, например при экпрессии в клетке активированных онкогенов RAS, также наблюдается нарушение взаимодействия р53 и Mdm2, но происходит оно из-за повышения экспрессии белка pARF, продукта альтернативной рамки считывания гена INK4a (см. раздел 3.4). Белок pARF обладает способностью связываться либо с N-концевым участком р53, либо с белком Mdm2, препятствуя, таким образом, их непосредственному взаимодействию друг с другом. Интересно, что ген MDM2 сам является транскрипционной мишенью активированного р53. В результате устанавливаются регуляторная петля, стимулирующая деградацию белка р53 после окончания действия факторов, вызывающих его фосфорилирование или связывание с белком pARF.

Важную роль в приобретении молекулами р53 конформации, способной транс-активировать гены-мишени, играют также модификации С-концевого участка, а именно ацетилирование его определенных аминокислотных остатков. При повреждениях ДНК и экспрессии активированного онкогена RAS эти события инициируются связыванием освобождающегося от Mdm2 N-концевого участка p53 с базальным фактором транскрипции р300/CBP, ацетилирующим сначала ингибиторный домен р53 по лизинам 373 и 382, а затем (после связывания р53 с респонсивными элементами) и белки хроматина в области генов-мишеней. Таким образом, последовательные пост-трансляционные модификации N-концевого и С-концевого участков р53 вызывают увеличение количества белка р53 в клетке, приобретение им способности связывать р53-респонсивные элементы и рекрутировать к генам мишеням базовые факторы транскрипции (компоненты комплекса TFIID РНК-полимеразы II и гистоновые ацетилазы p300/CBP, деконденсирующие хроматин), стимулируя тем самым транскрипцию их мРНК.

При некоторых стрессах, в частности при гипоксии, наблюдаются пост-трансляционные изменения р53, вызывающие его переход не к классической стрессовой конформации, а к ее варианту. Такой р53 не транс-активирует гены, содержащие р53-респонсивные элементы, но подавляет транскрипцию других генов-мишеней. Эта, так называемая репрессионная, форма также фосфорилирована по N-концу, но ее С-концевой участок не ацетилирован и связывает репрессионные комплексы Sin3/HDAC, вызывающие конденсацию хроматина генов-мишеней.

Гены-мишени р53 и их функции. В настоящее время, помимо Mdm2, обеспечивающего регуляцию самого р53 по принципу обратной связи (см. выше), идентифицировано более сотни генов, являющихся мишенями транскрипционных активностей р53. Они могут быть разделены на несколько групп, исходя из их физиологических функций (Рис. 4Б).

Первую группу составляют гены, продукты которых регулируют клеточный цикл. Важнейшим из них является белок p21Waf1/Cip1 - ингибитор циклинзависимых киназ из семейства Cip/Kip. Повышение его экспрессии вызывает остановку клеточного цикла в поздней фазе G1, что обусловливается связыванием им комплексов циклин Е/Сdk2, подавлением их способности фосфорилировать белки семейства рRb и освобождать транскрипционные факторы E2F (см. раздел 3.2.2). Дублирующим механизмом остановки перехода из G1 в S является подавление активированным р53 транскрипции гена DP1 - транскрипционного фактора, который связывается с E2F и образует активный комплекс, собственно и активирующий синтез продуктов, необходимых для входа в фазу S. Заслуживает также внимания способность р53 повышать экспрессию гена Siah1, продукт которого стимулирует деградацию b-катенина - транскрипционного фактора, активирующего транскрипцию гена циклина D и онкогена MYC (см. раздел 3.4.2), что вносит дополнительный вклад в индукцию остановки клеточного цикла в G1. Следует заметить, что р53 может подавлять активность Cdk2 не только в результате изменения своих транскрипционных функций, но и за счет белок-белковых взаимодействий, а именно непосредственного связывания циклина Н - компонента киназного комплекса CAK, осуществляющего активирующее фосфорилирование циклинзависимых киназ.

Идентифицирован также ряд генов-мишеней р53, продукты которых вызывают остановку в фазе G2 (задержка в ней наблюдается в случае, когда р53 активировался уже после того как клетка прошла G1-чекпойнт, или в клетках с инактивированным G1-чекпойнтом). Активированный р53 подавляет функцию комплекса циклин B/Cdc2, играющего ключевую роль в переходе из G2 в митоз, по нескольким механизмам. Во-первых, он транс-активирует ген 14-3-3-s, белковый продукт которого связывает и секвестрирует комплексы циклин B/Cdc2 в цитоплазме, не давая возможности им попасть в ядро, где они и должны проявлять свою активность. Во-вторых, он транс-активирует ген GADD45, белковый продукт которого обладает способностью связывать Сdc2, разрушая таким образом комплексы циклин B/Cdc2. В-третьих, р53 репрессирует транскрипцию генов циклина B и Cdc2, что уменьшает синтез их продуктов. Следует заметить, что, как и в случае остановки клеточного цикла в G1, задержка в G2 при повреждениях ДНК наблюдается и в клетках с инактивированным р53: она происходит в результате подавления функции фосфатаз Cdc25 (Cdc25A при остановке в G1 и Cdc25C при остановке в G2), активирующих соответствующие цикдинзависимые киназы. Однако в клетках с нарушенной функцией р53 происходит лишь кратковременная задержка в чекпойнтах, а активация р53 обеспечивает длительную остановку клеточного цикла, предотвращающую размножение вплоть до исправления дефекта.

Следующая группа р53-регулируемых генов кодирует белки, индуцирующие апоптоз. При этом р53 контролирует синтез компонентов обоих основных путей индукции апоптоза: и митохондриального, и стимулируемого "рецепторами смерти". Так, он регулирует активность белков семейства Bcl2, репрессируя ген анти-апоптотического белка Bcl2 и активируя гены про-апоптотических белков Bax, Puma и Noxa. Повышение проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С и белка AIF достигается и транс-активацией гена p53AIP1 (его продукт локализуется в митохондриальной мембране и уменьшает мембранный потенциал) и гена PIG3 (кодирует оксиредуктазу, которая вовлечена в образование радикалов кислорода, повреждающих мембраны митохондрий и стимулирующих выброс их содержимого). Стимуляция апоптоза, запускаемого рецепторами смерти достигается транс-активацией генов двух из таких рецепторов - Fas и Killer/DR5 (рецептор для TRAIL). Еще одной такой мишенью является ген недавно идентифицированного белка Pidd, который содержит домен смерти и при гиперэкспрессии индуцирует апоптоз. Выявлены и другие р53-респонсивные гены (IGF-BP3, PAG608, p85, циклин G), продукты которых стимулирует апоптоз, однако механизмы их апоптогенного действия пока исследованы довольно плохо. Кроме того, р53 может индуцировать апоптоз и через другие механизмы, несвязанные с его способностью изменять экспрессию генов-мишеней. Так, мутантные р53, утратившие транскрипционную активность (в результате делеции С-концевого участка или мутаций в кодонах 22-23), сохраняют тем не менее способность индуцировать апоптоз в некоторых (но не во всех) типах клеток. Предполагается, что этот эффект обусловлен белок-белковыми взаимодействиями р53. Таким образом, при повышении функциональной активности р53 может происходить активация сразу многих путей индукции апоптоза, что, по-видимому, обеспечивает надежность его реализации.

Так как р53 контролирует активность генов, продукты которых способны вызвать как остановку клеточного цикла в различных его фазах, так и апоптоз, возникает вопрос, отчего зависит выбор судьбы клетки при активации р53. Выяснилось, что он определяется множеством факторов: гистогенетическим типом клеток (например, в нормальных фибробластах, как правило, наблюдается остановка клеточного цикла, тогда как в лимфоцитах - апоптоз), степенью активации р53 (с увеличением уровня его экспрессии повышается вероятность апоптоза), функциональной активностью сигнального пути pRb-E2F (в фибробластах c инактивированным pRb или гиперэкспрессированным E2F, наблюдается не остановка в G1, а апоптоз) и т. д. Недавно обнаружено, что еще одним фактором, определяющим выбор между остановкой клеточного цикла и апоптозом, является характер модификации самих молекул р53 и/или их белок-белковых взаимодействий. Так р53, фосфорилированный по Ser15/20 и ацетилированный по С-концу, способен транс-активировать ген p21Waf1/Cip1 и вызывать остановку в G1, тогда как дополнительное фосфорилирование по Ser46 придает ему способность транс-активировать наряду с геном p21Waf1/Cip1 и ген белка р53AIP1, а в этом случае уже наблюдается апоптоз. Причем вероятность фосфорилирования Ser46 повышается с увеличением интенсивности повреждений ДНК. Кроме того, способность р53 избирательно транс-активировать проапоптотические гены (BAX и др.) увеличивается при его связывании с белками семейства ASPP (ASPP1 и ASPP2), потеря экспрессии которых характерна для значительной части случаев рака молочной железы.

Третьей большой группой генов-мишеней р53 являются гены, продукты которых регулируют морфологию и/или миграцию клеток (Рис. 4Б). Так, р53 транс-активирует гены обоих представителей семейства рассеивающих (Scatter) факторов - HGF/SF и HGF1/MSP, а также ген одного из членов семейства эпидермальных факторов роста HB-EGF (гепарин-связывающий EGF) (продукты всех этих генов являются одновременно и митогенами, и мотогенами). При этом, р53 транс-активирует также гены рецепторов этих факторов - HGF/SF-R (Met) и EGF-R. р53-респонсивными также являются гены хемокина фракталкина, гладкомышечного a-актина, коллагенов II1 и Vl1 типов, ингибитора плазминогена PAI-1. С другой стороны р53 репрессирует гены фибронектина и металлопротеиназы I типа. Физиологическое значение такой регуляции пока не установлено. Возможно, оно заключается, по крайней мере частично, в привлечении к клеткам с активированным р53 окружающих клеток определенных типов для ремоделирования/восстановления структуры ткани в месте возможного апоптоза. Не исключено участие такой регуляции и в процессах морфогенеза.

В особую группу генов-мишеней р53 можно выделить гены, контролирующие ангиогенез. Ключевую роль в неоангиогенезе играет VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor; стимулирует размножение и миграцию эндотелицитов), экспрессия которого повыщается при гипоксии или активации некоторых онкогенов. р53 репрессирует транскрипцию как гена VEGF, так и гена HIF-1 (Hypoxia Inducing Factor 1) - транскрипционного фактора, обеспечивающего повышение экспрессии VEGF и его рецепторов в ответ на уменьшение содержания кислорода (кроме этого HIF-1 изменяет экспрессию генов, контролирующих транспорт глюкозы и гликолиз, что обеспечивает адаптацию клеток к условиям гипоксии). Одновременно р53 может транс-активировать гены белков, ингибирующих ангиогенез - тромбоспондинов (Tsp)-1, -2 (связывая специфические рецепторы на поверхности эндотелиоцитов, они вызывают в них апоптоз) и BAI-1. Таким образом клетки с активированным р53 хуже переносят недостаток кислорода, перестают секретировать VEGF и начинают секретировать ингибиторы ангиогенеза, что препятствует образованию новых сосудов. Данные функции являются, по-видимому, еще одной составляющей опухоль-супрессирующего действия р53, так как они предотвращает адаптацию к гипоксии и прорастание сосудов в центр опухоли.

Выявлено еще несколько десятков генов-мишеней р53. Среди них следует отметить ген каталитической субъединицы теломеразы (TERT), который репрессируется р53 (таким образом, р53 участвует, по-видимому, и в обеспечении репликативного старения клеток. По-видимому, р53 принимает участие и в процессах созревания клеток, так как некоторые из транс-активируемых им генов кодируют белки репертуара той или иной дифференцировки (мышечная креатинкиназа и др.).

Последствия нарушений функции р53. Характерные для опухолевых клеток аномалии р53 отменяют или ослабляют все важнейшие функции опухолевого супрессора р53. Делеция обоих аллелей гена р53, т. е. его полная инактивация, вызывает ослабление G1- и G2-чекпойнтов клеточного цикла, подавление индукции апоптоза, уменьшение эффективности репарации ДНК, более эффективную адаптацию к гипоксии и стимуляцию неоангиогенеза, ослабление контроля за длиной теломер, ингибирование дифференцировки и другие характерные свойства неопластической клетки. Особо следует отметить возникновение в клетках с инактивированным р53 сильной генетической нестабильности, являющейся мотором дальнейшей опухолевой прогрессии. Потеря функциональной активности р53 значительно увеличивает темп появления размножающихся клеток с самыми разными генетическими аномалиями - измененным числом и перестройками хромосом, генными мутациями, амплификацией отдельных участков генома. Сходные последствия наблюдаются и при самых частых в новообразованиях человека аномалиях р53 - миссенс-мутациях, ведущих к синтезу неактивного белка, обладающего доминантно-негативным эффектом в отношении продукта неповрежденного аллеля. Следует заметить, однако, что степень проявления доминантно негативного эффекта мутантного р53 варьирует в зависимости от конкретной аминокислотной замены, типа клеток и ингибируемой функции р53 дикого типа. Поэтому нередко селективное преимущество получают клоны клеток, в которых в результате дополнительных генетических событий происходит делеция или мутация и второго аллеля гена р53. В то же время, опухолевые клетки, как правило, сохраняют экспрессию хотя бы одного мутантного аллеля гена р53. Очевидно, это связано с тем, что появляющиеся в результате миссенс-мутаций новые активности мутантных р53 вносят дополнительный вклад в повышение онкогенного потенциала клетки. Так, приобретая способность транс-активировать онкоген MYC, мутантный р53 вызывает, очевидно, более сильные нарушения регуляции клеточного цикла, чем те, которые наблюдаются при делециях гена р53. Новые активности мутантных белков р53 ответственны также за дополнительное ослабление индукции апоптоза и развитие устойчивости к действию химиопрепаратов. В основе подавления апоптоза лежит несколько механизмов: транс-активация мутантным р53 гена антиапоптотического белка Bag1 (член семейства Bcl2), способность мутантных р53 связывать и инактивировать гомолог р53, белок р73 (см. следующий раздел) и т. д. Возникновение устойчивости к определенным противоопухолевым цитостатикам может быть связано также со способностью некоторых мутантных р53 повышать транскрипцию гена MDR1 (Multi-Drug Resistance 1 - см. раздел XII.2.1.1) и гена дУТФ-азы, продукт которого блокирует действие 5-фторурацила и ряда других антиметаболитов. Следует заметить, что характерные для опухолей человека мутации дифференциально влияют на возникновение вышеуказанных активностей. Так, замены в кодонах 175 и 248 придают способность активировать ген дУТФ-азы, тогда как мутации в кодоне 273 не вызывают приобретения такого свойства. Поэтому, использование мутаций р53 в качестве критерия для предсказания чувствительности к той или иной химиотерапии может быть основано лишь на точной идентификации аминокислотных замен, а не на гистохимической детекции "нормального" или "мутантного" р53 с помощью конформационно-специфических антител. Таким образом, мутации и другие изменения активности р53 вызывают одновременное появление целого набора характерных свойств неопластической клетки, таких как понижение чувствительности к различным рост-супрессирующим сигналам (в том числе генерируемым перманентной экспрессией активированных онкогенов), иммортализация, повышение способности выживать в неблагоприятных условиях, генетическая нестабильность, стимуляция неоангиогенеза, блокирование клеточной дифференцировки и т. д. Это, очевидно, и является объяснением такой частой встречаемости мутаций р53 в самых разных новообразованиях - они позволяют за один шаг преодолеть сразу несколько этапов опухолевой прогрессии. Причем, мутации р53 могут являться как инициальным событием (синдром Ли-Фраумени) или детерминировать начальные этапы канцерогенеза, так и возникать и отбираться уже в ходе роста опухоли, обеспечивая приобретение новых агрессивных свойств и устойчивости к терапии.

Гомологи р53: р63 и р73

Недавно были обнаружены два гена, р63 и р73, продукты которых имеют достаточно высокую степень гомологии с белком р53 в участках транс-активационного, ДНК-связывающего и олигомеризационного доменов, но значительно отличающиеся от него по C-концу. Однако, в отличие от гена р53, кодирующего по существу один белковый продукт, подвергающийся, правда, самым разным пост-трансляционным модификациям, гены р63 и р73 продуцируют по несколько белков. Дело в том, что мРНК каждого из них может синтезироваться с двух промоторов и далее подвергаться альтернативному сплайсингу. В результате образуется по 6 изоформ белков р63 и р73, обладающие (ТА-формы) или не обладающие (ΔDN-формы) транс-активационным доменом. Причем формы, содержащие транс-активационный домен способны активировать р53-респонсивные гены и вызывать, в частности, апоптоз. Кроме того, ТА-формы р63 и р73 могут транс-активировать и ряд других генов, содержащих близкие по структуре респонсивные элементы, которые не являются, тем не менее, мишенями р53. В частности, они транс-активируют гены белков Jag1 и Jag2 - лигандов для рецепторов Notch, активация которых играет ключевую роль в выборе судьбы клетки при выборе направления ее дифференцировки. Существует еще ряд отличий между р53 и его гомологами. Так, если р53 экспрессируется в клетках практически всех тканей, то его гомологи экспрессируются только в некоторых типах клеток. Например, р63 преимущественно экспрессируется в эмбриональных клетках, а также стволовых и недифференцированных эпителиальных клетках взрослого организма, причем в виде транскрипционно-неактивных ΔDN-форм. Предполагается, что экспрессия ΔDN-форм р63 обеспечивает недифференцированное состояние клетки. При нокауте гена р63 у мышей наблюдается пренатальная или постнатальная гибель эмбрионов вследствие полного отсутствия кожи и других эпителильных тканей (предполагается, что это связано с преждевременной дифференцировкой стволовых клеток эпителия и исчерпанием их запаса к моменту рождения животных). Далее, если р53 активируется в ответ на самые разные стрессы, то его гомологи только на некоторые из них, причем за счет совершенно других механизмов. Наконец, если р53 выполняет функции опухолевого супрессора и для новообразований характерна его инактивация, то его гомологи не имеют таких функций. Об этом свидетельствует две группы фактов. Во-первых, у мышей гомозиготный нокаут гена р73 не вызывает повышения частоты возникновения опухолей (нокаут гена р63 не совместим с жизнью эмбрионов - см. выше). Во-вторых, в опухолях человека не выявляется потеря экспрессии или мутации генов р63 и р73. Наоборот, в них нередко отмечается повышение экспрессии этих белков, причем, как правило, транскрипционно-неактивных ΔDN-форм (т. е. р63 и р73 являются скорее протоонкогенами). В связи с этим приобретает популярность гипотеза, согласно которой ΔDN-формы белков р63 и р73 функционируют как природные ингибиторы р53, подавляющие его функцию по доминантно-негативному механизму. Действительно, их транскрипционно-неактивные тетрамеры могут конкурировать с р53 за места посадки на ДНК генов-мишеней, а мономеры/димеры - секвестрировать р53 путем связывания его молекул и образования неактивных комплексов. Это не исключает, однако, что при нарушениях функции р53 происходит активация транскрипционной функции его гомологов (показано, что р53 репрессирует транскрипцию гена р73), которая может частично компенсировать утрату функции р53 и обеспечивать, например, нормальное развитие мышей с гомозиготным нокаутом гена р53. Эти предположения, как и другие аспекты биологических функций гомологов р53, требуют дальнейшего исследования. Продукты гена INK4a - p16INK4a и pARF - регулируют активность pRb и р53 Следующим после р53 по частоте изменений в различных новообразованиях человека является ген INK4a, расположенный в коротком плече хромосомы 9 (сегмент 9р21). Его исключительной особенностью является одновременное кодирование двух негомологичных ядерных белков - p16INK4a и pARF (продукты альтернативных рамок считывания), каждый из которых выполняет супрессорные функции (Рис. 5).

Рис. 5. Ген INK4a кодирует два негомологичных белка, выполняющих разные функции.

p16INK4a связывает циклин-зависимые киназы Cdk4 и Cdk6 и препятствует образованию их функционально активных комплексов с циклинами D, которые, фосфорилируя pRb, инициируют вход в S фазу клеточного цикла. pARF обладает способностью стабилизировать и активировать белок р53, нарушая его взаимодействие с белком Mdm2 (см. раздел 3.3). Кроме того, у него выявлены и р53-независимые функции. Так, он может также непосредственно взаимодействовать с основной мишенью pRb - белком E2F и блокировать его активность. Кроме того, он понижает стабильность транскрипционного фактора HIF-1 (см. 3.3.2 и 3.5.3), связывая его a-субъединицу.

Активность p16INK4a и pARF повышается при экспрессии ряда вирусных (E1A) или клеточных (RAS, RAF, MYC и др.) онкогенов. Такой эффект обусловлен присутствием в гене INK4a респонсивных элементов для транскрипционного фактора E2F, активируемого многими онкогенами. Таким образом, нормальное функционирование продуктов гена INK4a эффективно предотвращает дальнейшее размножение клеток, в которых произошла активация какого-либо из представителей большой группы онкогенов. Кроме того, экспрессия p16INK4a повышается при образовании межклеточных контактов, что обеспечивает контактное торможение размножения клеток.

У трансгенных мышей с гомозиготной нокаутом гена INK4a, вызывающим потерю экспрессии обоих его белковых продуктов, наблюдается высокая частота возникновения в молодом возрасте различных новообразований, преимущественно фибросарком и лимфом (также как у мышей с инактивированным р53). Интересно, что практически такая же картина наблюдается и у мышей с перестройкой гена INK4a, приводящей к потере экспрессии только белка pARF. В отличие от этого у мышей, утративших экспрессию p16INK4a, но сохранивших экспрессию pARF, нет существенного повышения частоты возникновения опухолей (отмечается лишь редкое возникновение меланом, не наблюдаемое в родительских линиях мышей). В культурах in vitro мышиные фибробласты, не экспессирующие оба продукта гена INK4a, как и фибробласты, в которых инактивирован только pARF, легко трансформируются онкогенами семейства RAS. В то же время для Ras-индуцированной трансформации клеток, не экспрессирующих только p16INK4a, необходимо дополнительное действие кооперирующих онкогенов, таких как MYC или E1, подобно тому, как это наблюдается в случае нормальных клеток.

У людей герминальные мутации в одном из двух аллелей гена INK4a ассоциированы с наследственной предрасположенностью к развитию меланом кожи (синдром диспластических невусов). Часть из этих мутаций инактивирует только p16INK4a, не нарушая функцию pARF. В связи с этим предполагается, что синдром диспластических невусов связан с нарушением функции именно p16INK4a. В клетках наследственных и спорадических меланом обнаруживаются изменения обоих аллелей гена INK4a, т. е. данный ген ведет себя как классический опухолевый супрессор. Чаще всего вторая (соматическая) мутация представляет собой делецию гена INK4a, ведущую к инактивации как p16INK4a, так и pARF. Мутации, делеции и метилирование гена INK4a, вызывающие потерю экспрессии одного или обоих его белковых продуктов, часто наблюдаются не только в наследственных и спорадических меланомах, но и в большой группе других ненаследственных новообразований: раке поджелудочной железы, пищевода, желчных путей, мочевого пузыря, Т - и В-клеточных острых лимфолейкозах, мезотелиомах, анапластических астроцитомах, глиобластомах и др.

Опухолевый супрессор PTEN регулирует клеточный цикл и апоптоз, модулируя сигнальный путь PI3K-PKB/Akt

К опухолевым супрессорам, часто поражаемым в различных новообразованиях человека, относится и ген PTEN. Его герминальные мутации вызывают болезнь Коудена, заключающуюся в наследственном предрасположении к развитию гамартом, чаще всего в мозге, молочной и щитовидной железах. Инактивация PTEN характеризует также и значительную часть различных ненаследственных опухолей - глиомы, менингиомы, меланомы, раки почки, матки, молочной и предстательной желез. При этом на начальных стадиях заболевания выявляется, как правило, делеция только одного из аллелей гена PTEN, тогда как в опухолях, находящихся на поздних стадиях развития, чаще инактивированы оба аллеля. У трансгенных мышей с нокаутом одного аллеля гена PTEN отмечается развитие в молодом возрасте самых разных новообразований: аденокарцином кишечника, лейкозов, лимфосарком, герминальных опухолей и др.

Белковый продукт гена PTEN состоит из 403 аминокислот и имеет высокую степень гомологии с фосфатазами двойной специфичности (дефосфорилируют и тирозиновые, и серин/треониновые аминокислотные остатки). Его особенностью является способность дефосфорилировать не только белки, но и липиды, в частности фосфатидил-инозит(3,4,5)трифосфат (PIP-3) - важнейшую мишень фосфатидил-инозитид-3'-киназы (PI3K), участвующую в регуляции клеточного цикла и апоптоза. Именно эта активность белка PTEN ответственна, по-видимому, за его супрессорную функцию. Об этом свидетельствует в частности тот факт, что большинство мутаций, обнаруживаемых в опухолевых клетках, картируются в фосфатазном домене и отменяют дефосфорилирование PIP-3, ингибируя таким образом сигнальный путь PI3K-PKB/Akt. Так как онкоген PKB/Akt подавляет митохондриальный путь индукции апоптоза по нескольким механизмам (ингибирует Bad, активирует Bcl2 и т. д.), потеря функции PTEN делает клетки менее чувствительными ко многим апоптогенным стимулам. В клетках с инактивированным PTEN наблюдается также и стимуляция клеточной пролиферации (повышение экспрессии PKB/Akt увеличивает уровень циклина D). Восстановление функции PTEN в опухолевых клетках приводит, в зависимости от клеточного контекста, либо к апоптозу (рак простаты), либо к остановке клеточного цикла в G1 (глиобластома, рак почки). Следует заметить, что клетки глтобластомы и рака почки становятся при этом сенсибилизированными к действию дополнительных апоптогенных стимулов.

PTEN участвует, по-видимому, и в регуляции адгезии и миграции клеток. Его N-концевой домен гомологичен тензину - белку, взаимодействующему в фокальных контактах с актиновым цитоскелетом. Дефосфорилируя тирозиновые остатки киназы фокальных контактов FAK, PTEN может ингибировать образование фокальных контактов и распластывание клеток, а также их движение.

Е-кадгерин, АРС и аксин - супрессоры, контролирующие сигнальный путь β-катенин/Cdk/pRb

Наследственные и спорадические опухоли желудочно-кишечного тракта довольно часто ассоциированы с мутациями в генах Е-кадгерина, β-катенина, АРС и аксина (Табл. 1). Так, гемизиготные герминальные мутации Е-кадгерина обусловливают развитие наследственных форм рака желудка. Врожденные мутации одного из аллелей гена β-катенина или гена APC ведут к развитию семейного аденоматозного полипоза кишечника (у большинства пациентов наблюдаются мутации APC, реже встречаются мутации β-катенина). В основе онкогенного эффекта всех этих мутаций лежит повышение транскрипционной функции протоонкобелка β-катенина, вызывающего активацию циклинзависимых киназ и инактивирующего тем самым супрессорную функцию pRb (см. раздел 3.2.2). Такая функция β-катенина обусловлена его способностью транслоцироваться в ядро, связываться с транскрипционными факторами семейства TCF/LEF и активировать гены, имеющие в своем составе TCF/LEF-респонсивные элементы, в частности ген циклина D1 и онкоген MYC.