Биосенсорные системы в медицине и экологии (стр. 5 )

Выделение газов [3]. Наиболее широкое распространение получили БСС для определения глюкозы в крови с помощью ферментативной реакции:

глюкоза + O2 + F => глюконовая кислота + H2O2 + F,

(15)

где F – фермент глюкозоксидаза (п. 3.2.3).

Для оценки активности фермента нитрогеназы используется ее свойство преобразовывать газ ацетилен в этилен.

Изменение кислотности. Газы, выделяемые в результате ферментативных реакций, при пропускании через водную среду могут изменять ее кислотность (п. 2.3.1).

Выделение тепла. Многие ферментативные реакции идут с выделением тепла [3]. Некоторые типы подобных реакций были указаны в п. 1.2.2. Наиболее простой подход использован в ферментных БХП, в которых фермент или иммобилизовали на поверхности устройства для измерения температуры или помещали в мембрану, надетую на это устройство.

Достоинством данных БХП было обеспечение возможности контроля тепловыделения в течение длительного времени, а также в проточных системах. Методы измерения тепла описаны в п. 3.4.

Электрокатализ. Некоторые ферменты проявляют активность в форме ускорения обмена электронами между субстратом и электродом. Транспорт электронов может происходить [7] несколькими путями:

а) за счет промежуточного низкомолекулярного переносчика электронов – медиатора, который сначала окисляется ферментом, а затем восстанавливается на электроде;

б) за счет биоэлектрокатализа – прямого переноса электронов ферментами.

В качестве медиатора в раствор фермента добавляют вещество – переносчик электронов (ферроцен) или белки – переносчики электронов (п. 3.2.5).

Биоэлектрокатализ был открыт в 1978 г. советскими учеными (, , и др.). Прямой перенос электронов возникает у ферментов: медьсодержащей оксидазы – лакказы, пероксидазы, гидрогеназы, катализирующих соответственно окисление веществ кислородом (п. 1.2.1), распад H2O2, присоединение групп водорода. Это свойство используется для преобразования продукта H2O2 в электрический ток на электроде.

Многие ферменты катализируют окисление сахаров, аминокислот с выделением H2O2. В этом случае фермент пероксидаза используется для трансформации концентрационного сигнала в электрический:

AH2 (белок, углевод) + O2 –® A + H2O2 (оксидаза),

(16)

H2O2 –® H2O + 2 e– (пероксидаза).

(17)

Цепь реакций позволяет измерять концентрацию сахаров и белков, участвующих в обмене веществ, по величине тока на электродах (п. 3.2.4, 3.2.5).

Биолюминесценция (БЛ). Способностью к БЛ обладают бактерии, грибы, моллюски, насекомые [9, 10,16]. Механизм световых реакций у разных видов включает окисление субстрата люциферина ферментом люциферазой (п. 1.1.3).

Выделено несколько типов ферментов FL, катализирующих реакции БЛ.

а) FL1 – люцифераза насекомых. Ее выделяют из светоизлучающих органов («лампочек») светляков. Реакция катализа проходит в присутствии АТФ – энергетического соединения, необходимого для дыхания (п. 1.2.2).

АТФ при реакции преобразуется в АМФ:

люциферин+ АТФ +F ®

®окисленный люциферин +АМФ +фотон + F L1.

(18)

При отсутствии АТФ биолюминесценция не наблюдается. На этом принципе основан самый чувствительный метод измерения АТФ, когда в изучаемый раствор добавляют люциферин и люциферазу, измеряя свечение.

б) FL2 – ферменты медуз. Из этих организмов выделяется способный к свечению белок фотопротеин. Он содержит связанный люциферин, который светится за счет окисления ферментом в присутствии ионов Ca2+. Белок под названием экворин добавляют в изучаемый объект и по свечению следят за динамикой свободного кальция.

в) FL3 – ферменты люминесцентных бактерий. Свечение бактерий катализируется бактериальной люциферазой. Очищенный фермент обладает способностью к свечению только в присутствии трех субстратов: кислорода (S1), альдегида (S2) и сложного белка (S3), играющего важную роль в аэробном дыхании. Добавляя в раствор постоянные концентрации двух субстратов и фермент – бактериальную люциферазу, по возникающему свечению обнаруживают наличие и концентрацию третьего субстрата.

Если в раствор вносят S2+S3+FL3, можно определять концентрацию О2 (S1) по свечению, интенсивность которого линейно зависит от концентрации О2 в диапазоне 10–8 – 10–6 моль/л.

Если внести в раствор S1+S3+F L3, то по возникновению люминесценции появляется возможность определять альдегиды (S2), к которым, например, относятся половые гормоны насекомых (ферромоны). Ими, например, самки ночных бабочек, привлекают к себе самцов. По свечению раствора удается изучать метаболизм гормонов у одной особи насекомого.

После внесения в раствор смеси S1+S2+FL3 образуется БХП для определения необходимых для люминесценции сложных белков (S3). Ими являются компоненты белков дыхательного цикла на основе витамина B2. Их концентрацию можно измерять по интенсивности свечения.

В свою очередь сложный белок S3 образуется из биологического окисленного кофермента дыхательного цикла (НАДН, п. 1.2.2), являющегося субcтратом S4 для ферментативных реакций окисления с участием фермента F1 – оксидоредуктазы. Добавляя эти ферменты, можно продолжить аналитическую цепочку, где место субстрата S3 займет S4:

S1+S2+S4 ® (при добавлении FL3, F1)  ® свечение

(19)

Биологическое окисление НАДН из исходного субстрата S5 (НАД) катализируется другим ферментом – F2 дегидрогеназой, что позволяет измерять уже ее активность по тому же свечению, а вместо S4 использовать S5:

S1 + S2+S5 (при добавлении FL3, F1, F2) ® свечение.

(20)

При всех достоинствах подобных анализов цепочки реакций следует учитывать их недостаток – на свечение будут влиять все нестабильности концентраций исходных субстратов и ферментов.

В России производится набор КРАБ (комплекс реактивов для анализа биолюминесценции), который применяется для биохимических измерений. Ферменты КРАБ выделены из биомассы светящихся бактерий.

Приборы для измерения БЛ приведены в п. 3.1.9, а характеристики люминесцирующих БО – в табл. 5.

Запуск и блокирование реакций. Эти тест-реакции наиболее широко используются в ферментных тест-методах, предназначенных для обнаружения анализируемого вещества.

В основу ферментных тест-методов положено свойство ионов металлов или органических токсикантов ингибировать (п. 1.1.3) процессы каталитического превращения веществ в присутствии биологических катализаторов-ферментов [37]. Принцип их действия можно рассмотреть на примере тест-полоски для определения фосфорорганических веществ [14].

Она представляет собой полоску фильтровальной бумаги, на одном из концов которой иммобилизован фермент ацетилхолинэстераза, участвующий в проведении нервных импульсов (п. 1.4.1). Другой конец этой полоски содержит субстрат (ацетилхолин), скорость каталитического гидролиза которого подавляется в присутствии фосфорорганических веществ. Вместе с субстратом наносится кислотно-основной индикатор.

Наличие вещества-ингибитора выявляют по окраске зоны индикации тест-полоски после того, как полоска складывается для совмещения пятен, содержащих субстрат и фермент, и на нее, например, выжимают сок анализируемого продукта. Если продукт содержит фосфорорганический пестицид, скорость ферментативной реакции понижается, приводя к уменьшению количества выделившийся при этом кислоты, что вызывает изменение окраски индикатора. По цветовой шкале на упаковке тест-полосок можно оценить экологическую чистоту продукта питания. Аналогичная структура тест-наборов для клинической химии [1, 14].

Таблица 5

Состав и свойства светящихся смесей некоторых организмов [16]

Группа	Организм	Реагирующие соединители	Положение максимума интенсивности излучения (область)
I	Медуза (Aeguorera)	белок + Са++	синяя
II	Усоногие рачки (Balanoglossus biminiensis)	H2O2 + LH2 + E	голубая
III	Рыба (Apagon) Простейшие (Gonyaulax) Многощетинковый червь (Odontosylis) Ракообразные (Cypridina)	O2 + LH2 + E O2 + LH2 + E O2 + LH2 + E O2 + LH2 + E	460 синяя 510 460
IV	Грибы (Collibia и Armillaria) Гриб (Omphaly flavida)	O2 + LH2 + E+ДПН – Н или ТПН – Н O2 + LH2 + E+ ДПН – Н	530
V	Морские анютины глазки (Renilla Reniformis) Светящиеся насекомые	O2 + LH2 + E + АМФ O2 + LH2 + E + АТФ	синяя 562
VI	Бактерии (Ahromobacter и другие)	O2 +LH2+E+ФМН–	405
Моллюск фаллада (Pholas Dactylus)	О2 + ДПН – Н + Е + + ФМН – Н2	синяя
VII	Млекопитающие (приведены результаты первых исследований)	О2 + липиды О2 + жиры или жирные кислоты то же + адреналин то же + эргостерин то же + лецитин то же + аминокислоты	зеленая и красная синяя, зеленая, красная – – зеленая зеленая

LH2 – энергетический субстрат люминесцентной реакции, Е – катализатор (люцифераза), ДПН – Н – восстановленный дифосфопириннуклеотид.

АТФ – аденозинтрифосфат, АТМ – аденозинмонофосфат, ФМН – Н2 –

восстановленный флавинмононуклеотид, – альдегид.

Общий принцип большей части химических тест-методов заключается в использовании ферментных реакций с так называемыми хромогенными (цветообразующими) реагентами [38, 41]. Реакции проводят в таких условиях, чтобы можно было визуально зафиксировать их результат. Этим результатом могут быть интенсивность окрашивания, цвет бумажной полоски или длина окрашенной части индикаторной трубки с поглощающим веществом. Большинство используемых тест-методов служат измерительной БСС однократного применения.

Тест-системы являются одним из самых коммерчески выгодных товаров. Оборот фирм, торгующих ими, составлял в 1994 г. около $100 млн.

Организация цепи тест-реакций. Метаболические ферментные процессы в организме часто образуют цепи реакций (п. 1.1.3), которые могут использоваться в БХП как тест-реакции.

Если записать формулу цепи метаболизма:

S + F1 + K + I = P1 + F1 = P2 + F1 +F2,

(21)

где S – субстрат, F1 – фермент, катализирующий реакцию образования продукта P1, являющегося субстратом для ферментов до F2, катализирующего образование продукта P2, K – кофактор, I – ингибитор (п. 1.1.3), то можно решать следующие задачи:

выявлять субстрат-метаболит S; измерять активность ферментов по поглощению S или образованию P1 и P2; выявлять кофакторы K, запускающие работу фермента; выявлять ингибиторы I, подавляющие активность ферментов; выявлять цепочки взаимодействия ферментов.

В качестве примера можно привести другой БХП [7] на основе ацетилхолинэстеразы (F1) Для оценки активности этого важного фермента используется цепь реакций, приводящая к образованию пероксида водорода:

ацетилхолин (S) + I + F1 ® холин(P1) + уксусная кислота.

(22)

На следующем этапе фермент F2 холиноксидаза катализирует окисление P1.

холин (P1) + O2 + F2 ® H2O2 (P2) + оксихолин + F2.

(23)

Образование H2О2 будет зависеть от наличия ингибитора исходного фермента. Ингибиторами ацетилхолинэстеразы являются фосфорорганические или хлорорганические пестициды.

2.5.2. Ткани организмов

Растительные и животные ткани содержат специфические набо­ры ферментов, которые могут быть использова­ны как катализаторы соответствующих химических реакций [3, 33]. Каталитическими веществами богаты листья, цветки и плоды растений (структуры, связанные с ростом, репродукцией и накоплением питательных веществ), ткани печени, желудка, почек, слизистой оболочки животных.

Поэтому тканевые материалы успешно используют в качестве биокаталитических компонентов БХП. Ткани создают естественное окружение для требуемого фермента, в результате чего его активность стабилизируется. Во многих случаях тканевые БХП служат намного дольше, чем БХП на основе чистых ферментов. Тканевые материалы сохраняют специфичность фермента, в то время как выделенные ферменты в тех же условиях разрушаются.

Селективность тканевых БХП иногда снижается за счет присутствия в тканях не одно­го, а нескольких ферментов. Однако влияние «лишних» ферментов в каждом конкретном случае можно исключить или значительно ослабить подбором рН, температуры среды либо с помощью соответствующих ингибиторов, кофакторов. Наличие в ткани разных ферментов позволяет в некоторых случаях использовать один БХП для измерения концентрации нескольких субстратов.

Для БХП используют гомогенаты (измельченные ткани, п. 2.4.2) или срезы тканей в питательной среде, фиксируя их в полупроницаемой пленке (например нейлоновой) на поверхности измерительного преобразователя – ИП (разд. 3). Иногда измельченные частицы включают в порошки, пасты, гели. В результате ферментативной реакции, протекающей в ткани, выделяются вещества, концентрация которых определяет величину выходного сигнала ИП, в качестве ко­торого чаще всего используется газочувствительный датчик (п. 3.2.4, 3.2.5). В гибридных БХП, кроме ткани, иммобилизованы еще и ферменты.

Тканевые БХП для отдельных веществ. В табл. 6 приведены примеры подобных БХП для определения различных веществ.

Зависимость скорости образования продукта от концентрации субстрата нелинейна, если количество фермента постоянно (п. 1.1.3). В табл. 6 приведен диапазон концентраций, при котором сохраняется линейная зависимость между концентрацией измеряемого и количеством выделяемого или потребляемого вещества в процессе ферментативной реакции. Время работы БХП – это время сохранения им линейного отклика на анализируемое вещество.

Таблица 6

Характеристика тканевых БХП [33]

Определяемое вещество	Биокаталитический материал / фермент	Вещество: выделение–В, потребление–П	Диапазон концентраций, Моль	Время анализа / долговечность БХП	Значение определяемого вещества
Мочевина	Мука из бобов канавалии мечевидной / уреаза	NH3 (аммиак, В)	–	– /94 дн	Болезни почек, диабет, болезни печени
	Кашица тычинок хризантемы / уреаза	NH3 (аммиак, В)	2´10–5... 3´10–4	–	отравления фосфором, мышьяком
Пируват	Срез кукурузного зерна / пируватдекарбоксилаза	CO2, В	–	–	Болезни печени, токсикозы, травмы черепа
Пероксид водорода	Лист капусты кольраби / пероксидаза	О2, В	4 ´10–5... 6 ´ 10–4	2 ... 6 с/ –	Контроль действия фармакологических
	Ткани корней хрена / пероксидаза	О2, В	2,5´10–5... 2,3´10–4	3 мин / 2 мес.	препаратов, генетические патологии
Катехол	Срез ткани картофеля / полифенолоксидаза	О2 , П	2,5´10–5... 2,3´10–4	3 мин / 3 мес.	Вещество, входящее в состав гормонов
	Ткань шпината / катехолоксидаза	О2 , П	2,0´10–5... 8´10–4	– / 18 дн	мозгового слоя надпочечников
Катехоламины	Ткань печени крысы / моноаминоксидаза	Аммоний, В	–	– / 20...25 дн	(адреналина и норадреналина)
Аскорбиновая кислота	Сок огурца / аскорбатоксидаза	О2 , П, вода В	2,5´10–4... 1,6´10–3	3 ... 6 мин / –	Витамин
Дофамин	Мякоть банана / полифенолоксидаза	О2, П	1,3´10–6... 9´10–5	12 с /10 дн	Вещество, дейсвующее на нервную систему
Тирозин	Срез сахарной свеклы / тирозиназа	О2, В		– /8 дн	Аминокислота гормонов (инсулина и др.)

Помимо приведенных примеров в литературе описан целый ряд биосенсоров на пероксид водорода с применением кожуры кабачка и огурца, сенсоры на аминокислоты, содержащие в качестве биокаталитического материала компоненты цветков растений (кашицу тычинок хризантемы, ткани цветка магнолии, срезы пестика, ткани семян петрушки). Тычинки, пестики, семена содержат ферменты, катализирующие соответствующие реакции. Проведены опыты с применением в качестве БХП чешуи рыбы для определения гормона норадреналина, ткани мочевого пузыря жабы для определения антидиуретического гормона.