Нормативы биологической эффективности биоагентов (энтомофагов), стандарты и методики определения их качества (стр. 2 )

4) Сбор яиц златоглазки.

5) Инкубация яиц златоглазки.

6) Индивидуальное выращивание личинок.

7) Съем и сбор коконов златоглазки.

8) Размещение коконов в банки.

9) Воспроизводство биоматериала.

10) Хранение биоматериала до использования.

Получение маточной культуры златоглазки. Лабораторное разведение начинается с приобретения маточного материала из биофабрики или со сбора непосредственно в природе. Сбор златоглазки лучше всего производить в конце лета, отлавливая взрослых насекомых на светоловушки или путем кошения сачком по полевым культурам, где в массе имеется тля, или стряхивая в сачок с древесной растительности. Перед зимовкой взрослые особи встречаются на плодовых культурах, в садах и в парках, на деревьях и кустарниках, где обитают до ухода на зимовку в ноябре. Собранные во второй половине октября взрослые особи златоглазки уже начинают диапаузировать и менять свою окраску от интенсивно зеленой до бледно зеленой, а затем с понижением температуры они становятся желто-зелеными с коричнево-красными пятнами на теле.

Технологический процесс производства златоглазки. Имаго златоглазки фасуют в трехлитровые банки по 150 штук или в специальные садки по 3,5 тысяч имаго. Банки или садки помещают на стеллажи в термостатируемую комнату с регулируемым фотопериодом или климатический шкаф. Оптимальная температура содержания златоглазки 24-26°С, относительная влажность воздуха 65-70%. Ежедневно златоглазку подкармливают медом и автолизатом пивных дрожжей. В банки закладывают полоски темной хлопчатобумажной ткани. При выращивании златоглазки в банках через день полоски с отложенными на них яйцами златоглазки удаляются из банки и закладывают чистые полоски, с части полосок аккуратно ножницами срезают яйца златоглазки, остальные яйца представляют товарную продукцию. Срезанные яйца златоглазки смешивают с яйцами ситотроги в соотношении 5 мг ситотроги на 1 яйцо и в расчете 17-20 г яиц ситотроги, смешанных с яйцами златоглазки, засыпают на дозирующую плиту установки для дозирования корма. После засыпки дозы яиц вместе с кормом закрывают гексель крышкой. Гексели помещают в термостатируемую комнату с регулируемым фотопериодом при температуре 24-26°С их содержат в течение 15-17 дней. Через 7 дней после закладки вторично подкармливают дозой 17-20 грамм яиц ситотроги на 1 гексель. Через 15-17 дней открывают крышку гекселя. Собирают коконы златоглазки на установке для съема коконов и по 150 штук раскладывают в банки. Личинки, которые не успели окуклиться, раскладывают в пробирки по 1 штуке и подкармливают ситотрогой. После начала вылета имаго процесс воспроизводства повторяют. Один раз в 4-5 дней банки с имаго златоглазки меняют на чистые, так как личинки, отродившиеся из яиц, отложенных на стенках банок занимаются каннибализмом и поедают свежеотложенные яйца.

3 Разработка рекомендаций по содержанию и хранению биоагентов (трихограммы, бракона, златоглазки) против особо опасных вредных организмов в биолабораториях

3.1 Оптимальные условия для содержания и хранения трихограммы

Трихограмма относиться к насекомым, легко изменяющим свои качественные показатели в зависимости от условий содержания. Несоблюдение требуемых гигротермических условий, обязательности диапаузного развития в осеннее-зимний период, подкормки имаго, пассажа через природных хозяев и других условий технологии разведения приводят к ухудшению качественных показателей трихограммы, ее жизнеспособности.

Содержание при сменных температурах. Оптимальным условием для развития трихограммы определена температура 25ºС и относительная влажность воздуха 75%. Однако под влиянием разведения при константных условиях изменяются качественные и количественные показатели трихограммы и вырабатываются популяции паразита с узкой экологической пластичностью. «Изнеживание» трихограммы приводят к тому, что при выпусках на поля яйцееды оказываются слабо активными, плохо переносят сменные температуры дня и ночи, в результате чего сильно уменьшается эффективность биологической борьбы. Эту проблему можно решить содержанием паразитов в условиях максимально приближенным к природным. В трихограммных цехах биофабрик температуру днем необходимо поддерживать в пределах 25-30 оС, ночью около 16оС. Создание модернизированных биофабрик оснащенных кондиционерами и биоклиматическими камерами позволяют автоматически регулировать гигротермические условия и длину светового дня в трихограммном цехе. Это дает возможность правильно содержать трихограмму не только перед полевыми выпусками, но и на всем протяжении лабораторного разведения.

Повышение плодовитости и продолжительности жизни самок путем углеводной подкормки. Питание взрослых самок трихограммы углеводной пищей увеличивает их плодовитость в 1,5-2 раза, а продолжительность жизни до 10-15 дней. Это безусловно способствует более полной реализации потенциальной плодовитости самок. Для подкормки паразитов при лабораторном разведении, а также перед выпуском на поля в фазе имаго используют 20%-ный сахарный сироп. Он подается на ватных или поролоновых тампонах, располагаемый на верхней матерчатой крышке садков. Утреннюю подкормку сахарным сиропом чередуют с подачей воды вечером.

Хранение трихограммы, введение в диапаузу и реактивация. Кратковременное хранение активной трихограммы на преимагинальных стадиях (предкуколки и куколки) осуществляют при необходимости перед выпуском сроком до 1 месяца при температуре 3оС и влажности воздуха 80%. После 20 дней хранения при указанных условиях увеличивается смертность яйцееда.

Длительное хранение трихограммы (до 6 месяцев) в осенне-зимний период или с целью накопления в другие периоды года возможно в состоянии диапаузы. В лаборатории трихограмму вводят в диапаузу тремя способами:

1)  Заражение яиц ситотроги трихограммой проводится при 18-20оС в течение дня, ночью ее переносят в условия 10оС при 85-90% влажности воздуха. На следующий день заражение яиц производят снова при 18-20оС, после чего их помещают в камеры с температурой 10оС на 20-24 дня до образования предкуколки. В это время наступает почернение оболочки яйца.

2)  Заражение яиц ситотроги трихограммой производится при среднесуточной температуре 15оС и коротком световом дне (6-8 часов) или полной темноте.

3)  Яйца ситотроги однодневного возраста заражают трихограммой в течение 1-2 суток при 23-25оС, относительной влажности воздуха 70-80% и 16-часовом фотопериоде. Затем их переносят в камеры с той же влажностью, температурой 10оС и 12-часовым фотопериодом до начала почернения яиц.

Хранят диапаузирующую трихограмму в тех же условиях, что и активную. Следует учесть, что трихограмме свойственна также обязательная диапауза, которая продолжается в течение 2 месяцев. Поэтому вылет паразитов до истечения этого срока снижается, однако после диапаузы вылет повышается до 70-80%. Обязательное введение в диапаузу маточного материала трихограммы способствует получению жизнеспособных паразитов с высокой плодовитостью, высокой поисковой способностью и отсутствием деформированных особей.

Для реактивации (не ранее чем через два месяца) температуру повышают на неделю до 14-15оС, а затем до 22-25ºС). Лет реактивированной трихограммы начинается через 7-9 дней и продолжается примерно четыре дня.

3.2 Оптимальные условия для содержания и хранения бракона

Высокая пластичность бракона позволяет паразиту выдерживать константную температуру 35ºС и влажность воздуха 30-50%. Но оптимальным условием для максимальной плодовитости самок является температура 28-30ºС и относительная влажность воздуха 60-70%.

Хранение бракона – важный этап в процессе его накопления. Особей бракона, не участвующих в процессе дальнейшего размножения, следует хранить до их выпуска на поля в условиях, приближенных к природным.

Длительно хранить бракона в искусственных условиях можно в состоянии диапаузы, причем в той же фазе, что и в природе, учитывая, что насекомые готовятся к ней питаясь осенью белково-углеводной пищей. Свежевылетевших паразитов вводят в диапаузу при содержании их в течение 7 дней при 8-ми часовом фотопериоде, сменных дневных и ночных температурах и подкормке сахарным сиропом с автолизатом пивных дрожжей. После этого паразитов в стеклянных банках с гофрированной бумагой помещают на длительное хранение при 5ºС и относительной влажностью воздуха 70%. Насекомых периодически кормят сахарным сиропом, для чего их раз в две недели извлекают на 2-3 часа из холодильника и ставят в светлую комнату. Сохраняют только оплодотворенных самок, самцы практически полностью погибают.

Хранение бракона с целью накопления его в летнее время возможно при содержании в холодильнике при температуре до 7ºС и относительной влажностью воздуха 70% в фазе имаго до 30 дней при дополнительном питании и фазе куколок до 15 дней. Кратковременное хранение без подкормки допускается до 10 дней, так как на 15 день смертность самок составляет 75%

3.3 Оптимальные условия для содержания и хранения златоглазки

У златоглазки обыкновенной яйца, личинки второго-третьего возрастов и предкуколки нормально развиваются при температуре 20-30ºС и относительной влажности воздуха 50-80%. Для личинок первого возраста оптимальны 25ºС и 80% влажности, для имаго 20ºС и 80% влажности воздуха.

В лабораторных условиях возможно хранение златоглазки во всех фазах, каждая из которых отличается определенной длительностью хранения. Наиболее подходящими являются диапаузирующие имаго, срок хранения которых составляет до 6 месяцев, срок хранения яиц до 10 дней, а личинок и куколок – 20 дней. Для хранения биоматериала можно использовать бытовые холодильники, холодильные камеры. Яйца, личинки и куколки златоглазки хранятся при температуре 4-8ºС и относительной влажности воздуха 50-90%.

Для успешного применения златоглазки важно располагать достаточным запасом хищника, чтобы при необходимости иметь возможность выпуска энтомофага на значительные площади. Для этого предлагается методика хранения златоглазки в различных фазах ее развития.

Хранение яиц. Оптимальными условиями для хранения яиц златоглазки является температура 5ºС и относительная влажность воздуха 80-90%. Для хранения пригодны только свежеотложенные яйца. В зависимости от фазы эмбрионального развития степень выживаемости яиц в процессе хранения изменяется. Наиболее приемлемо хранение, продолжительность которого не превышает 20 дней. За этот период 76-96% эмбрионов сохраняют жизнеспособность. Более длительное хранение практического значения не имеет, так как большая часть яиц за это время утрачивает жизнеспособность. Так, при хранении яиц в течение 30-35 дней гибнет 36-50% эмбрионов.

Хранение личинок. Как и яйца, личинки златоглазки непригодны для продолжительного хранения. При пониженных температурах 6-8ºС их хранят в течение 30-40 дней. Более пригодны для этой цели личинки первого возраста. Личинки второго и третьего возраста хранятся не более 20 дней. При более продолжительном хранении снижается их жизнеспособность.

Хранение коконов. Хранят только те коконы, в которых сформировались куколки, то есть через 7 дней после образования кокона. Коконы с несформировавшимся куколками даже при 10-дневном хранении погибают (30-36%). Куколок хранят при температуре 2ºС и относительной влажности воздуха 75%. Однако наибольшее влияние на их выживаемость оказывает продолжительность хранения, которая не должна превышать 10 дней. Более длительное пребывание в условиях пониженных температур приводит к значительной гибели насекомых. Так, при хранении в течение 20 дней жизнеспособность сохраняется лишь у 41-52% куколок.

Хранение взрослых репродуктивных особей. Лучшими условиями для хранения взрослых активных насекомых являются температура 4ºС и относительная влажность воздуха 70-90%. Взрослых златоглазок хранят в круглых садках-ситах или в стеклянных пол-литровых или литровых банках. Для увеличения общей полезной площади в банки помещают крестовину из листового картона, которая делит банку на 4 сектора.

Для хранения используют молодых насекомых (самцов и самок). В пол-литровую банку помещают до 200 насекомых, в банках большей емкостью количество их увеличивают в соответствии с объемом. Перед хранением насекомых кормят в течение 5-7 дней медом. В период хранения энтомофагов периодически (1 раз в 5 дней) подкармливают медом или сахарным сиропом. Это необходимо для поднятия плодовитости у самок. Такие условия позволяют обеспечить продолжительное хранение активных энтомофагов (выживаемость 85-90%) при удовлетворительной их репродуктивной способности.

Хранение диапаузирующих златоглазок. Златоглазка обыкновенная в жизненном цикле имеет имагинальную диапаузу, эту особенность используют при хранении насекомых. Для них предварительно создают условия (короткий день продолжительностью 10-12 ч в течение 22-34 дней), необходимые для индукции у хризоп диапаузы. Чтобы ускорить процесс ухода насекомых в состояние диапаузы, из их рациона в этот период исключают белковый корм и подкармливают только сахарным сиропом. В период диапаузы златоглазки не откладывают яиц. Внешне от активных хризоп они отличаются более светлой окраской тела. Хранят диапаузирующих златоглазок при пониженной положительной температуре 5ºС и относительной влажности воздуха 70%. Диапаузирующие насекомые более пригодны для хранения, чем активные энтомофаги. Даже через 150 дней после хранения выживает более 70% златоглазок, а из отложенных ими яиц отрождается до 93% жизнеспособных личинок. Реактивируются насекомые при световом периоде 16 часов.

4 Стандарт и методика определения качества биоагентов (энтомофагов)

Решающее значение для эффективного подавления популяции вредителей имеет качество используемого биоагента, которое зависит как от исходной маточной культуры, так и от строгого соблюдения режима микроклимата при разведении, а также качества корма. Соблюдение стандартных показателей качества биоагентов позволяют поддерживать производство качественного биоматериала, следовательно их биологическую и экономическую эффективность. Для сохранения качественных показателей нарабатываемого биоматериала необходимо также проводить регулярное обновление популяции биоагентов и проведение пассажа через природного хозяина.

4.1 Стандарт и методика определения качественных показателей трихограммы

Основные стандартные показатели качества трихограммы: плодовитость самок, соотношение полов, выживаемость, количество деформированных особей, продолжительность жизни самок, зараженность яиц зерновой моли (ситотроги) трихограммой, количество яйцекладущих самок (таблица 1).

Таблица 1 - Стандартные показатели качества трихограммы, размножаемой на яйцах зерновой моли - ситотроги (Sitotroga cerealella Oliv.)*

№ п/п	Наименование показателя	Значение показателя
1	Установить видовую принадлежность (определение)	Trichogramma sp.
2	Зараженность яиц ситотроги трихограммой (не менее, %)	80
3	Выход имаго трихограммы из яиц ситотроги, т. е. выживаемость (не менее, %)	80-85
4	Соотношение полов (самцов и самок, не менее)	1:2
5	Продолжительность жизни самок (не менее, суток)	5
6	Плодовитость самок (количество яиц, не менее, штук)	30
7	Яйцекладущих самок (не менее, %)	90
8	Деформированные особи имаго (не более, %)	5

*Примечание: при соответствии вышеуказанным стандартным показателям качества, производимая партия трихограммы считается качественной.

Таблица 2 – Класс качества и расчетная биологическая эффективность трихограммы, %

Класс качества трихограммы	Расчетная эффективность трихограммы, %
I	свыше 78-80%
II	56-78%
III	33-56%
Нестандартная	ниже 33%

Зараженность яиц зерновой моли (ситотроги) трихограммой

Из анализируемой партии зараженных яиц зерновой моли отбирают пробу, состоящую примерно из 1000 яиц. Под бинокулярным стереомикроскопом с подсветкой (например, Микромед МС-2) на белой бумаге препаровальными иглами отделяют черные (зараженные) яйца от покрасневших (незараженных) яиц. Затем подсчитывают число незараженных яиц и определяют процент зараженности по формуле:

Х =*100%, (2)

где: Х – зараженность яиц зерновой моли, %;

А – общее число яиц;

В – число покрасневших (незараженных) яиц.

Выход имаго трихограммы из яиц ситотроги, т. е. выживаемость

Не из всех почерневших яиц ситотроги выходит трихограмма. По разным причинам часть трихограммы погибает на преимагинальных стадиях развития. Для подсчета выживаемости трихограммы, из числа зараженных яиц отобранных для определения зараженности яиц ситотроги отбирают 400 экземпляров и помещают их по 100 штук в пробирки, на которых отмечают номер партии и дату заражения. Пробирки закрывают плотной тканью и закрепляют резиновым кольцом. После естественной гибели всех особей трихограммы подсчитывают число вылетевших из яиц паразитов в каждой пробирке. Посчитывают процент выживаемости по формуле:

Х =, (3)

где: Х – процент выживаемости;

А1 …А4 – количество вылетевших особей в каждой пробирке.

Соотношение полов

На материале предыдущего анализа подсчитывают в каждой пробирке под бинокуляром количество самцов и самок. Различие между самцами и самками определяют по усикам. У самок они короткие, булавовидные, 5-члениковые, заканчивающиеся утолщенной булавой, покрыты короткими редкими волосками. У самцов усики продолговатые, на вершине неутолщенные, последние членики усиков слиты между собой, покрыты густыми длинными волосками.

После подсчета числа самцов и самок в каждой пробирке определяют общее соотношение полов путем деления большего количества особей по половой принадлежности к меньшему количеству:

где: А – общее количество самцов;

В – общее количество самок.

Плодовитость, продолжительность жизни и число яйцекладущих самок

Из производимой партии трихограммы берут пробу около 3500 зараженных трихограммой яиц ситотроги (или около 50 мг), помещают их в поллитровую банку и накрывают плотной тканью. Банку содержат при температуре 20-30ºС и относительной влажности воздуха 50-70%. Первыми начинают вылетать самцы, затем самки. Спаривание происходит в течение 3-5 часов после вылета. После спаривания отсаживают в 10 пробирок по одной самке. В каждую пробирку помещают тонкую полоску белой бумаги с наклеенными на нее свежеотложенными яйцами ситотроги из расчета 100-150 экземпляров. Пробирки закрывают тканью и затягивают резиновым кольцом. Ежедневно самок дважды в сутки подкармливают 20% сахарным сиропом, путем смачивания ватных тампонов. Ежедневно просматривают пробирки, отмечая погибших самок.

Среднюю плодовитость самок (P) трихограммы в партии определяют по формуле:

где: Е – количество отложенных яиц каждой самкой в отдельной пробирке;

n – общее количество самок.

Среднюю продолжительность жизни самок (L) определяют по формуле:

где: Dn – продолжительность жизни отдельной самки;

n – общее количество самок.

Процент яйцекладущих самок (F) вычисляют по формуле:

где: S – количество стерильных самок (то есть пробирка с самкой, где не произошло заражение яиц ситотроги);

n – общее количество самок.

Деформированные особи имаго трихограммы

Частично или полностью бескрылые особи трихограммы появляются в результате длительного разведения потомства исходной популяции, нарушения технологического режима размножения яйцеедов. Для определения процента деформированных особей в поллитровую банку помещают 1000 зараженных трихограммой яиц ситотроги. После полного вылета и естественной гибели паразитов отбирают произвольно 500 экземпляров, просматривают их под бинокуляром, отмечая отсутствие крыльев или их деформацию. Вычисляют процент деформированных особей по формуле:

Х=, (8)

где: Х – процент деформированных особей;

А – количество деформированных особей;

В – общее количество просмотренных особей.

4.2 Стандарт и методика определения качественных показателей бракона

Основные стандартные показатели качества бракона: размеры имаго и коконов, соотношение полов, плодовитость самок и их продолжительность жизни, выживаемость, деформированные имаго, особи бракона, получивших свое развитие на одной гусенице (таблица 3).

Таблица 3 - Стандартные показатели качества бракона, размножаемого на гусеницах большой вощинной огневки (Galleria melonella L.)*

№ п/п	Наименование показателя	Значение показателя
1	2	3
1	Установить видовую принадлежность (определение)	Braсon sp.
2	Длина тела самки (не менее, мм)	2,2-2,5
3	Длина тела самца (не менее, мм)	2,0-2,2
4	Длина кокона (не менее, мм)	3-3,6
5	Плодовитость самок (количество яиц, не менее, штук)	65
6	Продолжительность жизни самок (не менее, суток)	10
7	Отрождение имаго из коконов, т. е. выживаемость (не менее, %)	85
8	Количество бракона, получивших свое развитие на одной гусенице (не менее)	5
9	Соотношение полов (самцов и самок, не менее)	1:1
10	Деформированные особи имаго (не более, %)	5

*Примечание: при соответствии вышеуказанным стандартным показателям качества,

производимая партия бракона считается качественной.

Размеры бракона

Из размножаемой партии бракона отбирают произвольно 10 самок, 10 самцов и 10 коконов. Самок от самцов различают по морфологическим признакам. Размер самцов меньше, чем самок. Усики самки 16-17-члениковые, а у самцов 23-26-члениковые. У самок на конце брюшка внутри специального отростка имеется рыжевато-коричневый яйцеклад длиной до 1 мм. Затем под бинокуляром на масштабно-координатной бумаге измеряют размеры отобранных самок, самцов и коконов, затем подсчитывают средний размер.

Плодовитость самок

Из свежевылетевшей партии бракона через два дня после спаривания отбирают произвольно 10 самок, помещают их в отдельную пробирку по одной, закрывают тканью, закрепляют резиновым кольцом. Туда же закладывают по 5 гусениц большой вощинной огневки на гофрированной бумаге. Ежедневно подкармливают 20% сахарным или медовым сиропом. После того, как самка парализует гусеницы и отложит на них яйца, на 5-ый день самок переводят в другие пробирки, куда также закладывают по 5 гусениц на гофрированной бумаге. На 5-ый день снова переводят бракон в другие пробирки и повторяют процедуру до полной гибели самок. После этого подсчитывают общее количество отложенных яиц во всех пробирках и определяют среднюю плодовитость самок по формуле:

Х=, (9)

где: Х – средняя плодовитость самок;

А – общее количество отложенных яиц;

В – количество самок.

Продолжительность жизни самок