Клиническое значение полиморфизма генов цитокинов и гена гемохроматоза у больных хроническим гепатитом С (стр. 1 )

На правах рукописи

Абдуллаев Санджар Мухудинович

Клиническое значение полиморфизма генов цитокинов и

гена гемохроматоза у больных хроническим гепатитом С

14.00.05 – внутренние болезни

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва-2008

Работа выполнена в Московском Государственном Университете им. и ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им. Росздрава.

Научные руководители:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет им. Росздрава

Защита состоится «___»_____ 2008 года в __ часов __ мин. на заседании диссертационного 208.040.05 при ГОУ ВПО Московская медицинская Академия им. , строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. Москва, Нахимовский проспект.

Автореферат разослан «____»_____________2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Актуальность темы. Прогноз хронического гепатита С (ХГС), являющегося наиболее частой причиной развития цирроза печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) (Alberti A, Benvegnu L, 2004), а также ведущим показанием к трансплантации печени (Shiffman ML, Saab S., 2006), определяется темпом прогрессирования фиброза или развитием тяжелых внепеченочных проявлений и характеризуется значительными индивидуальными различиями (Benvegnù L, Gios M., 2004). Известно, что у 20-30% больных ХГС существует риск развития ЦП в течение 20-30 лет от момента инфицирования, и, в то же время, у значительной части пациентов с HCV-инфекцией формирования ЦП не происходит на протяжении всей жизни (, 2000; Thomson BJ, Finch RG., 2005). Гетерогенность клинических проявлений и темпов прогрессирования фиброза печени при ХГС обусловливают сложность определения индивидуального прогноза заболевания и выбора тактики ведения больных.

В исследованиях, проведенных за два десятилетия с момента идентификации HCV, было установлено, что помимо целого ряда хорошо известных вирусных и внешних факторов, несомненная роль в определении течения и исходов ХГС принадлежит факторам хозяина (, , 2000; Стоpожаков Г. И., , 2000; , , 2001; Alberti A., Vario A., 2005). Особое значение в работах последних лет отводится изучению генетического полиморфизма, играющего ключевую роль в определении индивидуальных особенностей ответа на один и тот же этиологический фактор (Bataller R., Brenner D. A., 2005). Среди генетических факторов хозяина у больных ХГС большинство исследований посвящено изучению однонуклеотидного полиморфизма (SNP) – наиболее распространенной формы индивидуальной генетической вариабельности. Однонуклеотидный полиморфизм в ряде случаев сопряжен с увеличением или уменьшением концентрации/активности продукта гена. Принимая во внимание решающее значение иммунных механизмов и интенсивности оксидативного стресса в прогрессировании фиброза печени и формировании ответа на противовирусную терапию (ПВТ), наиболее широко обсуждаемыми генами-кандидатами являются гены цитокинов и гемохроматоза (Bataller R., Brenner D. A., 2005). При этом считается, что доминирование провоспалительных цитокинов ассоциировано с быстрым прогрессированием фиброза и лучшим ответом на ПВТ, тогда как преобладание противовоспалительных – с медленным накоплением фиброза и более низкой эффективностью ПВТ (Cecere A, Marotta F, 2004; Neuman MG, Sha K., 2007).

В литературе представлено большое число исследований, посвященных поиску взаимосвязи между аллельными вариантами генов-кандидатов и темпами прогрессирования фиброза печени, а также со спонтанным клиренсом вируса и ответом на ПВТ (Powell E. E., Edwards-Smith C. J., 2000; Gewaltig J., Mangasser-Stephan K., 2002; di Giovine F. S., Takhsh E., 2005). Вместе с тем, до настоящего времени убедительные данные об ассоциации однонуклеотидных замен с особенностями течения ХГС получены только для малого числа полиморфизмов. Разноречивость опубликованных работ во многом связана с неодинаковыми критериями включения/исключения больных, изучением различных популяций и обследованием сравнительно небольших групп больных, что увеличивает вероятность получения ложных корреляций (Newton-Cheh C, Hirschhorn, 2005). В большинстве работ по определению клинической значимости генетического полиморфизма изучаются больные, имеющие дополнительные факторы прогрессирования фиброза печени (в т. ч. алкоголь) (Richardson MM, Powell EE., 2005), отсутствует оценка влияния на результаты исследования других факторов хозяина и вируса, длительности заболевания (Bahr M. J., el Menuawy M., 2003; Tanaka Y., Furuta T., 2003), и только в единичных работах проводится анализ комбинации генетических факторов (Richardson MM, Powell EE., 2005). Особо следует отметить крайнюю немногочисленность отечественных работ по изучению генетического полиморфизма при заболеваниях печени, которые представлены исследованиями по установлению генетических маркеров быстрого развития цирроза печени у пациентов с HCV-инфекцией (Romanov A. O., Belyaeva T. V., Esaulenko E. V., 2006) или у лиц, злоупотребляющих алкоголем (, , 2002; , , 2006).

Таким образом, разноречивость результатов исследований, в том числе вследствие различной популяционной распространенности аллельных вариантов генов цитокинов и гемохроматоза, а также ограниченность данных по российской популяции определили актуальность и необходимость проведения работы по выявлению аллельных вариантов генов-кандидатов, ассоциированных с особенностями течения и прогнозом ХГС.

Цель исследования: определить клиническую и прогностическую значимость носительства аллельных вариантов генов цитокинов и гена гемохроматоза, а также их влияние на результат противовирусной терапии у больных ХГС.

Задачи исследования:

1. Исследовать распространенность генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов цитокинов (-511 C/T гена IL-1b; -1082 G/A гена IL-10; -238 G/A гена TNF; -174 G/C гена IL-6 и +915 G/C гена TGF-b1) и гена гемохроматоза (C282Y и H63D) в российской популяции и у больных ХГС.

2. Проанализировать особенности клинико-лабораторной картины у больных ХГС в зависимости от носительства определенных аллельных вариантов исследованных генов цитокинов и гена гемохроматоза.

3. Определить взаимосвязь между полиморфными маркерами исследованных генов и темпом прогрессирования фиброза у больных ХГС.

4. Исследовать ассоциацию между генетическим полиморфизмом и эффективностью противовирусной терапии.

Научная новизна. Впервые в России проведено клинико-лабораторное и морфологическое исследование значительной по численности выборки больных ХГС, имеющих разный темп прогрессирования фиброза печени, с определением у них частоты генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов цитокинов (IL-1b -511 C/T; ILG/A; TNF -238 G/A; IL-6 -174 G/C и TGF-b1 +915 G/C) и гена гемохроматоза (HFE C282Y и HFE H63D). Впервые на большой группе здоровых доноров изучена распространенность генотипов и аллелей полиморфизма вышеуказанных генов в российской популяции.

Охарактеризованы особенности клинико-морфологической и лабораторной картины заболевания в зависимости от носительства полиморфных маркеров исследованных генов. Впервые показана взаимосвязь между развитием смешанной криоглобулинемии (СКГ) и носительством больными ХГС генотипа гена ILGG; также впервые показана ассоциация между уровнем гликемии и полиморфизмом гена TGF-b1 +915 G/C; индексом массы тела и полиморфизмом гена IL-1b -511 С/Т.

Определены «профибротические» (IL-1b -511 CT и -511 ТТ; IL-6 -174 GC и -174 CC; TGF-b1 +915 GC и +915 CC; HFE 63HD и 63DD) и «протективные» (IL-1b -511 СС и IL-6 -174 GG) генотипы, ассоциированные соответственно с быстрым и медленным темпами прогрессирования фиброза печени. Показано, что комбинация «профибротических» и «протективных» генотипов является независимым фактором прогноза ХГС. Впервые среди отечественных работ продемонстрирована ассоциация генетического полиморфизма гена ILG/A с эффективностью противовирусной терапии.

Практическая значимость. Результаты проведенного исследования, позволившие выделить клинические и генетические факторы, влияющие на особенности течения ХГС, темпы прогрессирования заболевания и эффективность противовирусной терапии, имеют значение для оценки прогноза ХГС. Установлены генетические факторы, влияющие на особенности клинико-лабораторной картины ХГС, в том числе развитие СКГ. Разработана модель определения прогноза ХГС, основанная на анализе комбинации «протективных» и «профибротических» полиморфных маркеров генов цитокинов и гемохроматоза. Присвоение баллов «протективным» и «профибротическим» генотипам позволяет вычислить суммарный балл генетического профиля больных ХГС и по его значению прогнозировать течение заболевания: выделить больных с благоприятным прогнозом и больных, наиболее угрожаемых по развитию ЦП. Установлены клинические и генетические факторы, ассоциированные с низкой эффективностью противовирусной терапии. Проведенное исследование позволяет индивидуализировать тактику ведения больных ХГС, учитывая данные клинического и генетического обследования, а также разработать рекомендации по изменению образа жизни больными ХГС.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. У больных ХГС распространенность генотипа гена IL-1b -511 CC (52,6%) достоверно выше, чем в популяции (40,6%; p=0,006), на основании чего можно предполагать, что носительство данного генотипа, ассоциированного с низкой продукцией провоспалительного цитокина IL-1b, способствует хронизации HCV - инфекции.

2. Больные ХГС с генотипом гена ILGG имеют повышенный риск развития СКГ; носители гетерозиготного генотипа гена IL-1b -511 CT имеют более высокий индекс массы тела, чем носители нормального (-511 СС) генотипа. У больных ХГС носительство генотипа гена TGF-b1 +915 GC сопряжено с более высоким уровнем гликемии, а наличие мутации гена гемохроматоза C282Y (282 CY генотип) - с повышенным содержанием сывороточного железа. Выявленные ассоциации имеют значение в понимании патогенеза ХГС и позволяют прогнозировать особенности клинического течения заболевания.

3. Определение генетического профиля, представляющего собой комбинацию генетических полиморфизмов, ассоциированных с быстрым (генотипы гена IL-1b -511 СТ и -511TT; генотипы гена IL-6 – 174 GC и -174 CC; генотипы гена TGF-b1 - +915 GC и +915 СС; генотипы гена HFE – 63HD и 63DD), и медленным (генотип гена IL-1b -511 CC; генотип гена IL-GG) темпом накопления фиброза, позволяет прогнозировать течение ХГС – оценить риск формирования ЦП, что имеет значение для выбора тактики ведения больных.

4. Генетический полиморфизм гена ILG/A наряду с другими факторами хозяина определяет эффективность ПВТ. Генотип -1082 GG, ассоциированный с повышенной продукцией противовоспалительного цитокина IL-10, является независимым предиктором отсутствия ответа на лечение или рецидива виремии. Генетический анализ, выявляющий носительство этого генотипа, целесообразно использовать в оценке прогноза эффективности противовирусного лечения.

Внедрение результатов работы. Результаты настоящего исследования используются при обследовании и лечении больных ХГС в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней ММА им. , включены в материалы лекционных курсов для студентов медико-профилактического факультета, факультета подготовки научных и научно-педагогических кадров ММА им. и факультета фундаментальной медицины МГУ им. . Рекомендуется использовать полученные данные в планировании научных исследований по проблемам гепатологии, а практические рекомендации внедрить в практику специализированных отделений стационаров.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены 17 октября 2006г на заседании кафедры биологической и медицинской химии факультета фундаментальной медицины МГУ им. и 15 февраля 2007г на совместном заседании кафедры терапии и профессиональных болезней медико-профилактического факультета ГОУ ВПО ММА им. Росздрава, академической группы академика РАМН , кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования ГОУ ВПО ММА им. Росздрава, отдела нефрологии НИЦ ГОУ ВПО ММА им. Росздрава, кафедры внутренних болезней ФФМ МГУ им. .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 170 страницах и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации и список литературы, состоящий из 54 отечественных и 267 иностранных работ. Работа проиллюстрирована 42 рисунками и 19 таблицами.

База проведения исследований. Основными базами проведения исследования были кафедра терапии и профессиональных болезней медико-профилактического ГОУ ВПО ММА им. Росздрава и лаборатория генных и клеточных технологий кафедры биологической и медицинской химии ФФМ МГУ им. .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материал исследования.

Обследовано 216 больных ХГС. В исследование включались проспективно все больные ХГС, поступающие в клинику для обследования и лечения, а также ретроспективно из числа наблюдающихся амбулаторно. Из исследования исключались больные, употребляющие алкоголь, или имеющие другие дополнительные этиологические факторы поражения печени (коинфекция HBV, болезнь Вильсона-Коновалова, аутоиммунный гепатит, наследственный гемохроматоз), а также больные с ВИЧ-инфекцией и сахарным диабетом 1 и 2 типа.

Возраст больных колебался от 16 до 78 лет, продолжительность заболевания от предполагаемого момента инфицирования до включения в исследование варьировала от 1 года до 50 лет. Диагноз ХГС устанавливался на основании данных анамнеза, клинического обследования, результатов лабораторных методов диагностики, включая вирусологическое исследование (позитивные тесты на антитела к HCV и HCV RNA). Морфологическое исследование ткани печени с определением индекса гистологической активности и стадии фиброза (по RG Knodell) было проведено у 102 больных.

Для решения поставленных задач все обследованные больные ХГС были разделены на следующие группы:

1) для определения распространенности полиморфных маркеров исследованных генов у больных ХГС, а также для изучения взаимосвязи между аллельным полиморфизмом и особенностями клинико-лабораторной картины заболевания, нами были проанализированы данные всех 216 больных ХГС, включенных в настоящее исследование.

2) для определения взаимосвязи между полиморфными маркерами исследованных генов и темпами прогрессированием фиброза печени из 216 обследованных больных нами была сформирована группа из 120 пациентов, с известной стадией поражения печени и длительностью заболевания. На основании данных о длительности заболевания до проведения морфологического исследования (или установления диагноза ЦП) и выявленной стадии фиброза рассчитывался средний темп прогрессирования фиброза печени, представляющий собой отношение стадии фиброза к длительности болезни. У 37 больных было отмечено медленно прогрессирующее (средний темп прогрессирования фиброза 0,06 ед. фиброза/год) и у 83 больных – прогрессирующее (0,22 ед. фиброза/год) течение ХГС.

3) для определения ассоциации между носительством вариантных аллелей исследованных генов и эффективностью противовирусной терапии (ПВТ) нами была сформирована группа, состоящая из 59 больных с известным исходом лечения: 38 больных с устойчивым вирусологическим ответом и 21 больной с отсутствием ответа на лечение или рецидивом виремии после завершения терапии.

С целью определения распространенности полиморфизма генов цитокинов и гена гемохроматоза в российской популяции, а также подтверждения корректности генотипирования было обследовано 250 здоровых доноров, составивших контрольную группу, состоящую из лиц обоих полов, не имеющих маркеров ХГС и других этиологических факторов поражения печени. Этническая принадлежность больных ХГС и лиц в контрольной группе была одинаковой.

Методы исследования.

1. Клинико-лабораторное обследование.

Для сбора данных и их последующего анализа была разработана «карта обследования больного», включавшая жалобы, данные анамнеза заболевания и жизни, результаты проведенного лабораторного, инструментального и морфологического обследования, а также результат лечения больных. При анализе данных анамнеза жизни и заболевания особое внимание обращали на установление факта перенесенного острого вирусного гепатита (ОВГ), желтушной формы ОВГ и наиболее вероятного фактора риска инфицирования, от которого производился отсчет длительности заболевания. У некоторых больных имело место несколько факторов риска инфицирования, при этом наиболее вероятным моментом инфицирования считалось воздействие, предполагающее максимальный объем инфицирующего материала. В случае наличия нескольких одинаковых факторов риска (несколько гемотрансфузий), момент инфицирования рассчитывался как среднее между наиболее ранним и наиболее поздним фактором. Кроме того, больные тщательно расспрашивались относительно употребления алкоголя.

Клинико-лабораторное обследование включало проведение клинических анализов крови и мочи, биохимическое исследование сывороток крови в межклинической биохимической лаборатории ММА им. (зав. - канд. мед. наук ), иммунологические исследования (межклиническая иммунологическая лаборатория ММА им. , зав. - ). Исследование антител к HCV и маркеров HBV (HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, HBcor IgM и HBcor суммарные) проводилось в межклинической иммунологической лаборатории ММА им. ; качественное и количественное исследование HCV RNA с генотипированием в лаборатории молекулярной диагностики ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (зав. – к. б.н. ). Исследование уровня церулоплазмина сыворотки выполнялось всем больным моложе 40 лет.

2. Молекулярно-генетические методы.

Для определения генотипов изучаемых генов проводилось выделение ДНК из цельной венозной крови больных ХГС и доноров крови (контрольная группа) с последующим проведением амплификации определенных участков исследованных генов с помощью соответствующих праймеров. Для определения полиморфных аллелей генов цитокинов использовали метод полиморфизма длины рестриктных фрагментов (ПДРФ), а гена HFE – аллельспецифичную ПЦР. Визуализация результатов и хранение результатов ПЦР и ПДРФ осуществлялись с помощью системы гель-электрофореза и цифрового фотографирования в УФ свете.

3. Статистическая обработка материала.

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Достоверность различий оценивалась с помощью U-теста Манна-Уитни для независимых выборок в случае ненормального распределения последних. Для количественных признаков в случае нормального распределения достоверность различий оценивалась с помощью t – критерия. Статистическая значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивалась при помощи критерия c2 и точного критерия Фишера. Для оценки репрезентативности (от фр. выборки контрольной группы и корректности определения полиморфных маркеров экспериментально определенные частоты генотипов и аллелей сравнивались с теоретически рассчитанными, исходя из уравнения Харди-Вайнберга. Темп убывания процента больных с I стадией фиброза и достижение ими II стадии рассчитывался с помощью теста выживаемости по Каплану-Мейеру (начальная точка – I стадия фиброза, конечная точка – II стадия фиброза). Кривые выживаемости разных групп больных сравнивали с помощью теста log rank. Уровень значимости был принят как p<0,05. При p, лежащим в пределах от 0,05 до 0,15, результат рассматривался как тенденция к различию. Для статистической обработки был использован пакет программы Statistica 6.0 и SPSS 10.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Анализ распространенности полиморфных маркеров генов цитокинов и гена гемохроматоза у больных ХГС и в популяции.

Из 216 обследованных больных было 142 женщины (65,7%) и 74 мужчин (34,3%). Средний возраст больных составил 44,0±15,5 лет (от 16 до 78 лет), средняя длительность заболевания от предполагаемого момента инфицирования до включения в исследование - 15,6±10,6 лет (1–50 лет). В группе больных с установленной стадией фиброза (на основании морфологического или клинико-инструментального обследования) I стадия фиброза диагностирована у,6%), II стадия - у,7%), III стадия – у 10 (6,4%) и IV стадия (цирроз печени) – у,4%) больных.

Результаты генотипирования контрольной группы и больных ХГС представлены в таблице 1.

Таблица 1. Частота генотипов и аллелей полиморфных маркеров исследованных генов в контрольной группе и у больных ХГС.

Полиморфизм	Генотип/ аллель	Контроль n (%)	Больные ХГС n (%)	p
IL-1b -511 C/T	Генотип СС	101(40,6)	,6)	0,006
Генотип СТ	,2)	75 (35,2)	0,003
Генотип ТТ	28 (11,2)	26 (12,2)	нд
Аллель Т	35,3	29,8	нд
TNF -238 G/A	Генотип GG	69 (94,5)	,7)	нд
Генотип GA	4 (5,5)	9 (4,3)	нд
Генотип AA	0 (0)	0 (0)	нд
Аллель A	2,7	2,2	нд
IL-10 -1082 G/A	Генотип GG	87 (36,1)	78 (36,6)	нд
Генотип GA	,9)	92 (43,2)	нд
Генотип AA	41 (17,0)	43 (20,2)	нд
Аллель A	40,5	41,8	нд
IL-6 -174 G/C	Генотип GG	73 (36,7)	73 (34,3)	нд
Генотип GC	94 (47,2)	,7)	нд
Генотип CC	32 (16,1)	32 (15,0)	нд
Аллель C	39,7	40,4	нд
TGF-b1 +915 G/C	Генотип GG	,7)	,9)	нд
Генотип GC	35 (12,9)	29 (13,6)	нд
Генотип CC	1 (0,4)	1 (0,5)	нд
Аллель C	6,8	7,3	нд
HFE H63D	Генотип HH	,1)	,3)	0,04
Генотип HD	,6)	66 (30,6)	0,07
Генотип DD	27 (3,2)	9 (4,2)	нд
Аллель D	15,5	19,4	0,09
HFE C282Y	Генотип CC	,4)	,5)	нд
Генотип CY	54 (6,4)	14 (6,5)	нд
Генотип YY	2 (0,2)	0 (0)	нд
Аллель Y	3,5	3,3	нд

Примечание: нд – статистически недостоверно.