Гибридизационно-флуоресцентная ПЦР-тест система с гарантией достоверности результата обнаружения ДНК вируса гепатита В в крови доноров и пациентов ЛПУ.
, ,
Центр крови Минздрава России
По данным ВОЗ в мире инфицировано вирусом гепатита В более 2 миллиардов людей (1, 2), и потому остаточный риск передачи этого вируса через компоненты донорской крови несколько выше по сравнению с вирусом гепатита С и ВИЧ. Прямое и быстрое определение вирусной ДНК с гарантией лимита детекции необходимо также и для точной диагностики вирусного гепатита В, и для выявления носительства этого вируса.
К настоящему времени получены убедительные данные о необходимости генамплификационного тестирования ДНК HBV в дополнение к тестированию на HBsAg крови доноров и пациентов, поскольку не все генотипы этого вируса выявляются в ИФА. Так, по данным японского Красного Креста (3), с 1.02.2000 по 15.10.2001 в результате NAT-тестирования 11 миллионов серонегативных на HBsAg донаций было выявлено 181 донация положительная на ДНК HBV. Последующее ретестирование этих 181 донаций на HBsAg системами ИФА и CLIA (хемолюминесцентным иммунологическим методом) дало соответственно%) и%) отрицательных результатов. Второй пример касается необходимости тестирования на ДНК HBV пулов плазмы для фракционирования (4). В результате тестирования 200 пулов плазмы NAT-системой «in house» с лимитом детекции 116 МЕ/мл и COBAS Ampliscreen NAT-системами с лимитом детекции 37 МЕ/мл была выявлена ДНК HBV в тех же самых 2 пулах (1%).
NAT-ретестированию должна подвергаться не только вся кровь, негативная на HBsAg, но и все доноры и больные с положительными результатами на HBsAg-тестирование, поскольку до 70% таких людей не содержат ДНК HBV. В результате этого такие люди будут избавлены от страха вирусного гепатита В и необходимости его лечения, а Мир получит основание снизить предполагаемое количество HBV-инфицированных (более 2 миллиардов) в 2-3 раза, которое по данным ВОЗ превышает.
В условиях российской действительности до настоящего времени дополнительные NAT-тестирования крови на ДНК HBV пока возможны только посредством электрофоретической детекции продукта амплификации и без контроля чувствительности на основе стандартного положительного образца плазмы. Для широкомасштабного скрининга доноров крови и пациентов на ДНК HBV такая технология не может быть применена.
Только после того как совсем недавно в России стали производиться флуоресцентно-гибридизационные ПЦР-тест системы на ДНК HBV и другие патогены, появилась возможность начать такие тестирования на ДНК HBV как во всей службе крови, так и в ЛПУ. Необходимое условие - комплектация таких наборов калиброванным и вирусобезопасным HBV-стандартом для гарантии достоверности получаемого результата.
Внедрение флуоресцентно-гибридизационной ПЦР-тест системы на HBV и другие патогены стало возможным благодаря широкодоступному флуоресцентному детектору продуктов ПЦР «Джин» фирмы «ДНК-технология», что не только дешевле, так как исключается большое дорогостоящее оборудование для электрофореза и видео-компьютерной детекции, но и позволяет исключить основной источник ложно-положительных ПЦР-результатов за счет рассеивания ампликонов при вскрытии пробирок.
В развитых странах донорская кровь подвергается дополнительному NAT-генотестированию на вирусные патогены с обязательным установлением лимита детекции по международному стандарту или его национальному аналогу. Центр крови Минздрава России начал работу по калибровке материала, содержащего ДНК HBV, по международным NAT-стандартам ВОЗ. Цель работы – дать возможность учреждениям службы крови России получили возможность оценивать лимит детекции NAT-скрининга донорской крови как при использовании ПЦР-наборов с электрофоретической детекцией, так и с флуоресцентно-гибридизационной детекцией продукта ПЦР. В противном случае результаты NAT-скрининга будут сомнительными, независимо от любых характеристик ПЦР-набора и рекомендаций его производителей.
Сравнение результатов ПЦР-тестирования ДНК HBV при помощи гибридизационно-флуоресцентной тест системы на HBV в десятикратных разведениях международного стандарта на ДНК HBV с концентрацией 6,25´106 геном-эквивалентов/мл (табл.1) и в десятикратных разведениях вируссодержащей криоплазмы (табл.2) позволило установить исходный титр последней как 3´108 геном-эквивалентов/мл. Эта вируссодержащая плазма была стабилизирована бактерицидным агентом азидом натрия и в течение года хранилась при –20 оС, +4 оС и при +20 оС. Титр ДНК HBV при этих температурах хранения практически не изменился, что хорошо согласуется с данными других авторов о высокой стабильности ДНК HBV при указанных температурах (5, 6). Для исключения инфекционной опасности такого стандартного материала в 3 микропробирки, содержащие по 100 мкл её разведений в 100, 1000 и 10000 раз плазмой здорового донора, добавляется 400 мкл лизирующего раствора. В том же соотношении, что и при выделении ДНК и РНК из плазмы или крови в соответствии с методикой однопробирочной экстракции нуклеиновых кислот (7) и инструкцией, содержащейся в прилагаемом проспекте нашей ПЦР-тест системы.
Заключение:
Гибридизационно-флуоресцентная ПЦР-тест система на ДНК вируса гепатита В, созданная в Центре крови Минздрава России, в сочетании с калиброванным и стабилизированным бактерицидными агентами контрольным материалом, содержащим ДНК HBV, позволяет с гарантией достоверности обнаруживать HBV в серонегативных донациях и в крови пациентов, а также разделять HBsAg-положительных людей на содержащих HBV в крови и не содержащих HBV в крови. Все этапы исследования производятся в обычных ПЦР-лабораториях, оснащенных приборами и реагентами отечественного производства.
Литература.
1. HBV Fact Sheet WHO/2004, Rev. October 2000
2. Maddrey W. C. Hepatitis B – an important public health issue//Clin. Lab.- 2001- Vol. 47.-P. 51-55
3. Minegishi K., Yoshikawa A., Kishimoto S. et al. Superiority of minipool nucleic acid amplification technology for hepatitis B virus over chemiluminescence immunoassay for hepatitis B surface antigen screening// Vox Sang.- 2003.- Vol. 84.- N4.- P.287-291
4. Pisani G., K. Cristiano, G. M. Bisso et al. HBV DNA in plasma pools for fractionation// Transfusion.- 2003.- Vol. 43.- N12.- P.
5. Saldana J., Gerlich W., Lelie N. et al. An international collaborative study to establish a WHO international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques// Vox Sang.- 2000.- Vol. 80.- P.63-71
6. Lee D. H., Li L., Andrus L., Prince A. P. Stabilized viral nucleic acids in plasma as alternative shipping method for NAT// Transfusion.- 2002.- Vol. 42, N4.- P. 409-413
7. , А., , Жибурт (NAT) тестирование крови и других материалов на патогены и мутации.- М.: Полиграфсервис, 200с.
Разведения HBV Referenzplasma "Giessen 1/1" 6.25x106 GE/ml
Пробирка | Образец | Результат | Специфика | ВК |
|
| |||||
| 19,9* | 13,7* |
Специфика ВК | ||
1 | 1:10 | + | 7,0 | 3,1 |
|
2 | 1:100 | + | 6,3 | 1,7 | |
3 | 1:1000 | - | 2,7 | 1,5 | |
4 | разбавитель | - | 2,0 | 3,6 | |
6/фон | фон | фон | 1,0 | 1,2 | |
7/фон | фон | фон | 1,0 | 1,0 | |
*Нормировочныезначения |
Разведения HBV-содержащей плазмы донора № 000
Пробирка | Образец | Результат | Специфика | ВК |
| |
| ||||||
| 84,0* | 54,5* |
Специфика ВК | |||
1 | 1:10 | + | 15,9 | 2,1 |
| |
2 | 1:100 | + | 15,5 | 2,0 | ||
3 | 1:1000 | + | 10,8 | 2,4 | ||
4 | 1:10000 | + | 5,4 | 2,3 | ||
5 | 1:100000 | + | 4,7 | 3,2 | ||
разбавитель | - | 1,9 | 3,6 | |||
6/фон | фон | фон | 1,0 | 1,2 | ||
7/фон | фон | фон | 1,0 | 1,0 | ||
* Нормировочные значения |
ПРОСПЕКТ
Флуоресцентно-гибридизационная тест-система для обнаружения ДНК вируса гепатита В в крови
Содержит аналог международного стандарта.
В Центре крови Минздрава России создана тест-система, позволяющая определять ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с обнаружением продукта по флуоресценции гибридизованного с ним зонда с использованием простого специализированного флуориметра «Джин» фирмы «ДНК-технология». Для регулярного контроля лимита детекции к тест-системе прилагается стабилизированный стандарт ДНК HBV – калиброванный по международному стандарту ВОЗ.
Как и при ПЦР в реальном времени (генодиагностика нового поколения, пока еще требующая очень дорогой аппаратуры), флуоресцентный сигнал обусловлен расщеплением в ходе ПЦР зонда типа TaqMan. Применение зондов с пониженной фоновой флуоресценцией («молекулярных бакенов») позволяет получать достоверные результаты путем простой флуориметрии после ПЦР. Благодаря этому созданная тест-система обладает следующими преимуществами:
- Процесс обнаружения продукта ПЦР проходит без вскрытия пробирки, что исключает рассеивание этих продуктов – основной источник ложноположительных результатов ПЦР. Анализ может проводиться в обычной клинической лаборатории – специальные требования к организации ПЦР-лаборатории оказываются необязательными.
- По сравнению с обычной электрофоретической детекцией продуктов ПЦР намного снижены трудоемкость и длительность анализа. Флуориметрия после ПЦР в течение 2-3 минут заменяет не менее чем получасовой электрофорез и всю работу по приготовлению гелей.
- Обеспечивается полная документированность результатов при меньших затратах, чем при электрофорезе с видеокомпьютерной регистрацией, проведение которого требует комплекта оборудования в 2-3 раза более дорогостоящего, а также дополнительного расхода агарозы и других материалов.
- Возможность регистрации флуоресценции разного цвета позволяет, как и во всех современных генодиагностических тест-системах, применять ДНК внутреннего контроля для достоверности отрицательных результатов анализа. Флуоресценция зонда на патоген и зонда на ДНК внутреннего контроля регистрируются в одной пробе одновременно (см. пример).
Пример. Результат анализа разведений контрольного ДНК HBV-содержащего материала с концентрацией 2,8´108 ГЭ/мл, прилагаемого к данной тест-системе.
Образец: степень разведения ДНК HBV-содержащего контроля | Результат | Специфика | ВК |
| |||
1:100 | + | 14,9 | 3,0 | ||||
1:1000 | + | 10,2 | 5,4 | ||||
1:10000 | + | 5,2 | 6,3 | ||||
1:100000 | + | 4,4 | 7,2 | ||||
Разбавитель | - | 1,8 | 7,6 | ||||
Фон | фон | 1,0 | 1,2 | ||||
Фон | фон | 1,0 | 1,0 | ||||
* Нормировочные значения | 88,5* | 57,3* |
спецификаУказанные разведения были проанализированы в соответствии с приведенной инструкцией. Величины флуоресценции в канале патогена (специфика) и внутреннего контроля (ВК) нормированы к фоновой флуоресценции амплификационной пробирки, содержащей воду под защитным слоем парафина в тех же объемах, что и реакционная смесь при ПЦР-анализе.
Тест-система включает в себя готовые к работе амплификационные пробирки с компонентами ПЦР и флуоресцентными зондами под слоем парафина и набор реагентов для однопробирочного выделения ДНК из плазмы крови (патент РФ № 2 ТУ ). Общая продолжительность анализа не превышает 3 часов. Прилагается контрольный образец – стабилизированный аналог международного стандарта на вирус гепатита В и плазма-разбавитель. Для установления лимита детекции проводится анализ серии разведений контрольного образца разбавителем.
Гибридизационно-флуоресцентная ПЦР-тест система, созданная в Центре крови Минздрава России на ДНК вируса гепатита В, в сочетании с откалиброванным и стабилизированным бактерицидными агентами стандартом ДНК HBV, позволяет с гарантией достоверности обнаруживать HBV в серонегативных донациях и в крови пациентов, а также разделять HBsAg-положительных людей на содержащих HBV в крови и не содержащих HBV в крови. Все этапы исследования производятся в обычных ПЦР-лабораториях, оснащенных приборами и реагентами отечественного производства.
