Особенности состояния кроветворения у больных раком молочной железы разных возрастных групп (стр. 1 )

На правах рукописи

Особенности состояния кроветворения у больных

раком молочной железы разных возрастных групп

14.01.30 – геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Филиале ГБОУ ВПО РНИМУ им. Минздравсоцразвития РФ

«Научно-клинический центр геронтологии»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

Филиал ГБОУ ВПО РНИМУ

им. Минздравсоцразвития РФ

НКЦ геронтологии, ведущий научный сотрудник

доктор медицинских наук, профессор,

ГУ МОНИКИ им. ,

руководитель отделения клинической

гематологии и иммунотерапии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-

стоматологический университет» им.

Защита состоится ___________ 2012 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д.208.072.13 ГОУ ВПО РГМУ Росздрава Москва, ул. Леонова, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Минздравсоцразвития РФ Москва, .

Автореферат разослан «______» _________________ 2012 года.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Рак молочной железы (РМЖ) прочно удерживает первое место в структуре онкологической заболеваемости. Статистические данные последнего десятилетия свидетельствуют о неуклонном росте показателей заболеваемости и смертности в России (, 2000). Известно, что опухоль возникает вследствие нарушения процессов обмена веществ в клетках и ослабления контроля за внутриклеточными процессами со стороны организма (, 2002, 2004). Любая онкопатология является мощным неспецифическим стрессом, при котором адаптационные механизмы организма претерпевают изменения и переходят на новый уровень функционирования (, 2001). В большей степени в процесс адаптации вовлекается система крови, как одна из интегральных систем организма. В пожилом возрасте в силу уже имеющихся изменений функциональных и обменных процессов создаются условия для более выраженных дизадаптационных нарушений и изменений в системе гемопоэза, иммунной системе крови и. т.д. (, 2003). Развитие опухолевого процесса сопровождается выраженными нарушениями практически всех звеньев иммунитета, а применяемые специальные методы лечения в онкологической практике приводят к угнетению кроветворения,

развитию лейкоцито -  и  лимфоцитопении. Исходя из этого, оценка состояния кроветворения онкологического больного является необходимой для проведения целенаправленной и обоснованной сопроводительной терапии. Применение полихимиотерапии, при которой одной из самых атакуемых мишеней является костномозговое кроветворение, может также привести к развитию новых клеточных мутаций и клональных заболеваний (Schnitt S. J., 2001.Vincеnt T., 2001). За последние 15 лет получены данные о том, что опухоли молочной железы развиваются на основе выраженных нарушений иммунной системы, возникающих уже при предопухолевых заболеваниях и усугубляются применяемым комплексным лечебным воздействием (, 2002, , 2003). Однако, нет объективной картины морфологических признаков деградации как лимфоцитов - основных иммунокомпетентных клеток, так и других клеток гемопопоэза, обеспечивающих защитные функции организма. Тем не менее, накапливаются данные о том, что важная информация может быть получена в результате анализа  кроветворения у больных с онкопатологией. Отсюда, мы сочли актуальным провести более углубленное изучение кроветворения при РМЖ, выявить возрастные морфологические и функциональные особенности клеток периферической крови и костного мозга с использованием современных методов количественной цитологии, дополнив имеющиеся знания о раке молочной железы, и привнести новые подходы к диагностике и лечению. Результаты данного исследования важны в теоретическом и практическом плане, поскольку они могут стать дополнительным инструментом для оптимизации лечения, своевременного предупреждения тяжёлых побочных осложнений противоопухолевой терапии, определения факторов риска их развития и оценки индивидуального прогноза течения заболевания. В литературе имеется значительное количество работ, посвящённых изучению морфофункциональных характеристик клеток гемопоэза при онкогематологических заболеваниях (острые и хронические гемобластозы), но практически нет сведений по изучению морфологических и цитохимических показателей клеток кроветворения при раке молочной железы. Всё сказанное определило цель и задачи исследования.

Цель исследования: определить возрастные особенности кроветворения у больных раком молочной железы до и после комплексного лечения, и установить факторы риска, ассоциирующиеся с неблагоприятным прогнозом заболевания, на основе комплексного изучения морфофункциональных показателей клеток периферической крови и костного мозга.

Задачи исследования:

1. Изучить возрастные особенности морфологических и цитохимических параметров клеток периферической крови и костного мозга у больных раком молочной железы в период развёрнутых клинических проявлений, до лечения.

2. Исследовать морфометрические характеристики лимфоцитов при раке молочной железы у больных различных возрастных групп до лечения.

3. Провести сравнительный анализ морфологических и цитохимических характеристик клеток периферической крови и костного мозга у больных раком молочной железы до и после комплексного лечения с учётом возраста.

4. Определить факторы, ассоциирующиеся с неблагоприятным исходом рака молочной железы и риском развития гематологических осложнений после комплексного лечения на основе выявленных морфологических и цитохимических нарушений в клетках периферической крови и костного мозга.

Научная новизна работы

Определены возрастные особенности морфологических и цитохимических параметров клеток периферической крови и костного мозга у больных раком молочной железы до и после комплексного лечения, включавшего хирургическое, лучевую и полихимиотерапию.

Установлена функциональная недостаточность кроветворения, сопровождающаяся морфологическими дефектами в основных клеточных линиях периферической крови и костного мозга как до, так и после комплексного лечения, наиболее выраженная в старшей группе больных, что свидетельствовало о наличии неэффективного эритропоэза, количественной и качественной неполноценности гранулоцито - и лимфоцитопоэза.

Определены количественные изменения активности миелопероксидазы, кислой и щелочной фосфатазы, неспецифической эстеразы, отражающие снижение фагоцитарной и бактерицидной функций нейтрофилов и активности клеточного обмена иммунокомпетентных клеток – лимфоцитов.

С помощью компьютерной морфоцитометрии выявлена гетерогенность циркулирующих лимфоцитов, и разработана лимфоцитограмма периферической крови для больных раком молочной железы с учётом возраста. Выделены модальные классы лимфоцитов, позволяющие дополнительно оценивать тяжесть течения заболевания.

Курсы полихимиотерапии, независимо от возраста, значительно ухудшали морфологические и цитохимические показатели клеток периферической крови и костного мозга, указывая на повышенный риск побочных гематологических осложнений, обусловленных токсичностью противоопухолевой терапии, и вероятность развития новых клеточных мутаций и клональных заболеваний.

Научно-практическая значимость работы

Разработаны дополнительные диагностические тесты, оценивающие нарушения кроветворения при раке молочной железы и позволяющие корректировать и осуществлять сопроводительную терапию, тем самым повышая вероятность благоприятного исхода заболевания.

Определены факторы, ассоциирующиеся с неблагоприятным исходом заболевания и риском развития гематологических осложнений: высокие значения морфологических дефектов, содержания полисахаридов в клетках периферической крови и костного мозга и площади клеточных ядер лимфоцитов с низкой активностью гидролаз, снижение активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах (≤90%, СЦК≤1,60).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Состояние кроветворения у больных раком молочной железы характеризуется функциональной и количественной недостаточностью клеток периферической крови и костного мозга, как в период развёрнутых клинических проявлений болезни, до лечения, так и после комплексного лечения, включавшего хирургическое, лучевую и полихимиотерапию, наиболее выраженные у больных пожилого возраста.

Установлены индивидуальные и общие закономерности нарушений гемопоэза, выражающиеся в увеличении морфологически дефектных клеток в трёх основных клеточных линиях, наличии неэффективного эритропоэза и количественной и качественной неполноценности гранулоцито - и лимфоцитопоэза.

2. Изучены морфометрические параметры лимфоцитов при раке молочной железы и выделены модальные классы лимфоцитов для лиц зрелого и пожилого возраста. Наиболее информативным морфометрическим параметром является площадь ядра клетки, которая может быть использована

в качестве дополнительного теста определения тяжести и исхода заболевания.

3. Анализ выявленных морфологических и цитохимических нарушений в клетках периферической крови и костного мозга позволяет: оценить состояние кроветворения у больных раком молочной железы; определить факторы, ассоциирующиеся с неблагоприятным течением и исходом заболевания; использовать мониторинг изучения морфологического и функционального состояния клеток кроветворения как до, так и в период применения цитостатической терапии для обоснованной терапии в целях профилактики и лечения осложнений, обусловленных токсичностью противоопухолевых препаратов.

Практическое внедрение полученных результатов

Полученные результаты внедрены в практику ГУЗ «Онкологический диспансер» г. Нальчика, КБР.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены на научной конференции «Состояние онкологической помощи в ЮФО по итогам 2008г.» - Нальчик 2008г. и Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученных.- Нальчик 2011г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из которых 4 опубликованы в рекомендованных ВАК журналах.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста.

Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 34 таблицами и 5 рисунками. Библиографический указатель включает 188 источника, 95 отечественных и 93 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, материал и методы исследования

Положения и выводы работы базируются на результатах клинических и лабораторных исследований 71 больного раком молочной железы. Объектом морфологического и цитологического исследования в работе явились клетки периферической крови и костного мозга больных раком молочной железы разных возрастных групп в период развернутых клинических проявлений болезни, до лечения и после проведения комплексной программы лечения, включавшей сочетание хирургического, лучевого и химиотерапию. Работа выполнена на базе лаборатории возрастной гематологии ГОУ ВПО РГМУ филиала «НКЦ» геронтологии Росздрава и ГУЗ «Онкологический диспансер» г. Нальчик, КБР за период годы. Формулировка диагнозов соответствовала Международной статистической классификации болезней, травм и причин смерти X пересмотра (МКБ-10, 1992 г.). Возрастная градация обследованных пациентов проводилась с учётом классификации, принятой на Международном симпозиуме по проблемам геронтологии ВОЗ (Москва, 1965). Среди наших больных были только лица женского пола в возрасте от 45 до 74 лет (средний возраст составил 56,1лет). В зависимости от возраста больные были распределены на 2 группы. Первую группу составили 54 пациента в возрасте от 45 до 59 лет (средний возраст 54, 6). Во вторую группу вошли 17 больных в возрасте 60-74 лет (средний возраст 64,4). При морфологических исследованиях клеток гемопоэза контрольную группу составили 30 практически здоровых человека в возрасте 25-55 лет. Общая продолжительность заболевания до обращения к врачу-онкологу колебалась от 6 месяцев до 3 лет. Осмотр пациентов проводили в соответствии со стандартной схемой обследования онкологических больных (сбор жалоб, анамнез заболевания и жизни; объективный осмотр). Всем больным при поступлении в стационар проведен: общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови, коагулограмма, флюорографическое исследование органов грудной клетки, ЭКГ, ультразвуковое исследование органов, маммография. Диагноз ставился на основании цитологического исследования материала после пункционной или эксцизионной биопсии опухоли, при негативном ответе - по данным УЗИ и маммографии. 56 больным проведено комплексное лечение: операция – мастэктомия с предварительным проведением предоперационного курса телегамматерапии (ТГТ) на молочную железу и пути регионарного метастазирования на аппарате АГАТ-С. Наряду с оперативным вмешательством и лучевой терапией, применялись курсы адъювантной полихимиотерапия по программе FAC: 5-фторурацил -500мг/м2 внутривенно в 1-ый и 8-й дни; адриамицин – 50мг/м2 внутривенно в 1-ый день и циклофосфан - 500мг/м2 внутривенно в 1-ый день. Суммарно проведено 4 и более курсов в зависимости от стадии и состояния больного, соматических заболеваний и имеющихся осложнений. 10 больным проводилась только лучевая и химиотерапия, и 5 пациентов от лечения отказались. Исследование кроветворения осуществлялось до комплексной терапии и после лечения (4-х курсов химиотерапии). В своей работе мы использовали клинико-анатомическую классификацию рака молочной железы, в которой выделяется четыре стадии распространенности опухоли. В зависимости от стадии развития опухоли, согласно данной классификации, наши больные распределились следующим образом: IIа стадия болезни имела место всего лишь у 2-х пациентов (2,8%); IIb – у 10 больных (14,1%); IIIа – у%); IIIb стадия – у 23 больных (32,4%); IV - терминальная стадия заболевания имела место у 14 пациентов (19,7 %). В группе пожилого возраста наибольшее число пациентов имело IIIa и IIIb стадию болезни (11 чел.-15,5 %) и IV стадию (6 чел.-8,5 %) (таблица 1).

Что касается сопутствующих патологических процессов, результаты нашего исследования показали, что чаще сопутствующая нозологическая форма патологии встречалась в системе кровообращения.

При оценке состояния кроветворения при РМЖ исследования были сосредоточены на выявлении морфоцитохимических особенностей клеток периферической крови и костного мозга. Проводился количественный подсчёт гемограмм и миелограмм пунктатов костного мозга, изучение морфологических и цитохимических характеристик клеток гемопоэза. Морфологические исследования включали подсчет дефектных клеток (МДК) в эритроидной, гранулоцитарной и лимфоидной линиях периферической крови и костного мозга. В этих же клеточных линиях исследовались цитохимические реакции в целях оценки изменений обменных процессов в клетках. В эритроидных клетках костного мозга определялись количество клеток, содержащих в цитоплазме негемоглобиновое железо и полисахариды.

Таблица 1

Распределение больных раком молочной железы по группам в зависимости от возраста и стадии болезни

Возраст больных (лет)	Стадии рака молочной железы
Группа	II a	II в	III a	III в	IV
45-59	2 (2,8 %)	10 (14,1 %)	20 (28,2 %)	14 (19,7 %)	8 (11,2 %)
60-74	0 (0%)	0 (0 %)	2 (2,8 %)	9 (12,7 %)	6 (8,5 %)
	2	10	22	23	14
Всего, %	2,8 %	14,1 %	31%	32,4 %	19,7 %

В нейтрофильных гранулоцитах периферической крови и костного мозга оценивались активность миелопероксидазы (МП) и щелочной фосфатазы (ЩФ), а также содержание липидов (ЛП). В цитоплазме лимфоцитов периферической крови и костного мозга изучались концентрация полисахаридов (ПС) и активность кислой фосфатазы (КФ) и неспецифической эстеразы (альфа-нафтил-ацетат эстеразы) (НЭ).

Подсчёт морфологически дефектных клеток периферической крови производился в мазках из лейкоконцентрата, полученного из венозной крови. Изучались изменения формы и величины ядра и цитоплазмы, наличие дегенеративных изменений в них. Для этой цели были разработаны специальные карты. Оценка результатов цитохимических исследований проводилась при световой микроскопии мазков периферической крови. Учитывался процент положительных клеток и вычислялся средний цитохимический коэффициент (СЦК) на основании подсчета 100 клеточных элементов каждой из выделяемых категорий клеток по формуле Кеплоу в модификации Астальди и Верга, по которой СЦК = 1а+2б+3в:100, где цифры обозначают интенсивность окраски, а буквы – число подсчитанных клеток: а – число подсчитанных клеток с I степенью интенсивности, б – со II степенью интенсивности, в – с III степенью интенсивности. Автоматизированная морфометрия лимфоцитов выполнена с помощью компьютерной системы анализа изображений по специальным программам изучения лимфоцитов на отечественном приборе для автоматического анализа клеток периферической крови АСПЕК. Анализ введенных изображений лимфоцитов осуществлялся путем сегментирования контуров клетки и ядра в полуавтоматическом режиме. В каждом наблюдении измерялось по 100-112 клеток. Набор регистрируемых параметров для лимфоцитов включал: Scell (Р1) – площадь клетки (кв. мкм), Pcell (P2) – периметр клетки (мкм), FF1(P3) - фактор формы клетки 1 (усл. ед), FF2 (P4) - фактор формы клетки 2 (усл. ед), Scyt (P5) – площадь цитоплазмы (кв. мкм), ECN (Р6) – цитоплазмо-ядерное отношение (усл. ед), Snuk (P7) - площадь ядра (кв. мкм); Pnuk (P8) – периметр ядра (мкм), FF1 (P9) – фактор формы ядра 1 (усл. ед), FF2 (P10) – фактор формы ядра 2 (усл. ед). Площадь цитоплазмы Scyt (P5) и цитоплазмо-ядерное отношение (ECN) являлись производными показателями и вычислялись по алгоритмам, зашитым в компьютерную программу. Все параметры выбраны исходя из представленной фирмой стандартно-измерительной программой. Учет числа вариант в четырех классах гистограмм распределения лимфоцитов по каждому геометрическому параметру производился с помощью теста Genchi-Mori (Bartels, 1979). При вычислении решающего правила (правила классификации) определялись достоверность различий многомерных распределений, коэффициент дискриминации для каждого из выбранных параметров и пороговое значение дискриминантной функции. Статистическая обработка всех цифровых показателей производилась с использованием программы Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corp., USA) с учетом t-критерия Стьюдента. Для всех критериев и тестов критический уровень значимости принимался равным 5%. т. е. нулевая гипотеза отвергалась при p<0,05.

Основные результаты исследования и их обсуждение

В результате проведённых исследований системы кроветворения у больных раком молочной железы в период развёрнутых клинических проявлений заболевания, до лечения обнаружено наличие анемии лёгкой и средней степени тяжести в 35,2% случаев у больных I - ой возрастной группы и в 41,2 % случаев - во II-ой. Количество лейкоцитов и тромбоцитов в обеих возрастных группах находилось в пределах референтных значений. Однако, в лейкограмме, независимо от возраста, процентное и абсолютное содержание палочкоядерных нейтрофильных гранулоцитов оказалось повышенным в 1-ой группе у 61,1% и во 2-ой – у 58,8% больных в сравнении с физиологической нормой. Напротив, средние показатели, как процентного, так и абсолютного числа лимфоцитов были сниженными, практически у всех больных. Между группами достоверной разницы в показателях гемограмм не имелось. При сравнении данных миелограмм в обеих группах достоверная разница выявлена лишь в количественном содержании миелокариоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, что, скорей всего, обусловлено возрастными особенностями кроветворения. Нами впервые было установлено наличие увеличенного пула морфологически дефектных клеток в 3-х исследованных клеточных линиях (эритроидной, гранулоцитарной, лимфоидной), как в периферической крови, так и в костном мозге, независимо от возраста, наиболее выраженные у пожилых лиц. До лечения частота морфологических дефектов в клетках у них в 2 и более раза превышали нормальные пределы (Таблица 2). Состояние эритроидной системы гемопоэза оценивалось по объему эффективного и неэффективного эритропоэза. Одним из способов определения неэффективного эритропоэза является подсчет эритрокариоцитов, содержащих в цитоплазме повышенное количество полисахаридов, выявляемых с помощью цитохимической ШИК - реакции. При повышении их числа можно говорить о раннем разрушении и судить о величине неэффективного эритропоэза. По нашим данным у больных РМЖ 1-ой группы до лечения количество эритроидных предшественников, содержащих в цитоплазме полисахариды, в 2 раза, а больных 2-ой группы почти в 3 раза превышало показатели здоровых людей. Это свидетельствовало о неполноценности эритроидных клеток и частичной их гибели в костном мозге. Содержание сидеробластов в костном мозге в обеих группах практически соответствовало нормальным колебаниям (таблица 3).

Таблица 2

Количество морфологически дефектных клеток в периферической крови

у больных раком молочной железы до и после лечения

Срок обследования	Показатели	Количество дефектных клеток, %
		Эритроциты,%	Гранулоциты, %	Лимфоциты, %
До лечения, 1-ая группа n=40	M±m	2,8 ±0,3	2,4 ±0,5	3,2±0,3
σ	1,5	1,3	0,7
M± σ	1,3 -4,3	1,1-3,7	2,5-3,9
После лечения, 1-ая группа n=37	M±m	8±1,5	5,4±1,2	3,3±0,6
σ	4	2,3	1,8
M± σ	4-12	3.1-7,7	1,5-5,1
	t (1-2)	2,1	2,15	0,69
p (1-2)	<0,05	<0,05	>0,05
До лечения, 2-ая группа n=15	M±m	10,4±3,8	4,8 ±1,5	5,5±1,5
σ	8,4	1	2,2
M± σ	2-18,8	3,8-5,8	6,3 -7,7
После лечения 2-ая группа, n=12	М±m	16,1±4,8	13,7±3	5,1±1,8
σ	8,0	2,3	3
	M± σ	8,1-24,1	11,4-16	3,3-8,1
t (3-4)	2,5	4,5	1,05
p (3-4)	р<0,05	р<0,05	р>0,05
Сравнительные данные между группами после лечения	t (2-4)	4	7,5	1,09
p(2-4)	р<0,05	р<0,05	р<0,05
Сравнительные данные со здоровыми людьми
t (2-5)	3,5	2,13	0,5
р (2-5)	р<0,05	р<0,05	р>0,05
t (4-5)	6,4	12	1,2
p(4-5)	р<0,05	р<0,05	р>0,05

Таблица 3