Завершена реализация работ по 1 этапу соглашения от 23 октября 2012 № 000 «Разработка технологических основ действия мишень-направленных биологически активных молекул для коррекции нарушений пролиферации и программированной гибели опухолевых клеток в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на годы.
Состав коллектива:
Руководитель: зав. кафедрой молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России –
Исполнители:
1. – зав. каф. патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
2. - профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
3. – профессор кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
4. – ассистент кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
5. – интерн молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
6. - ассистент кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
7. - докторант кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
8. – аспирант кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
9. - аспирант кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
10. - аспирант кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
11. - ассистент кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностике ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
12. – руководитель НОЦ молекулярной медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
13. – аспирант кафедры эндокринологии и диабетологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
14. - интерн молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
15. - докторант кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
16. – доцент кафедры эндокринологии и диабетологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
17. - аспирант кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
18. - аспирант кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
19. – студентка 6 курса лечебного факультета ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
20. - студентка 6 курса МБФ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
21. - студентка 6 курса МБФ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
22. - студентка 4 курса МБФ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
23. - аспирант кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
24. - аспирант кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
25. - студентка 6 курса МБФ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
26. - студентка 6 курса МБФ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
Цель работы: идентифицировать молекулярные механизмы участия внутриклеточных сигнальных систем (белки теплового шока, внутриклеточные газовые трасмиттеры) в дизрегуляции апоптоза и пролиферации опухолевых клеток для разработки технологических подходов таргетной терапии злокачественных новообразований.
Основные результаты:
Показано, что опухолевые клетки линий Jurkat и THP-1 характеризуются повышенным уровнем экспрессии генов и высоким содержанием фосфорилированных форм белка теплового шока (Heat shock protein – Hsp, шаперон) Hsp27 и низким уровнем фосфорилированных форм Hsp90, по сравнению с мононуклеарными лейкоцитами, полученными у здоровых доноров.
Выявлено, что белки теплового шока Hsp27 и Hsp90 играют антиапоптотическую роль в опухолевых клетках Т-лимфобластного лейкоза и моноцитарной лейкемии. Молекулярные механизмы антиапоптотического действия Hsp27 и Hsp90 включают в себя снижение активности каспаз-8 и -3, уменьшение количества TNF - и Fas-рецепторов, изменение уровня факторов транскрипции р53 и NF-kB, а также нарушение баланса про - и антиапоптотических белков семейства Bcl-2 в пользу последних, и как следствие, препятствие снижению уровня трансмембранного потенциала митохондрий.
Получены приоритетные данные о проапоптотическом действии специфических ингибиторов белков теплового шока Hsp27 и Hsp90 (KRIBB-3 и 17-AAG, соответственно) в интактных опухолевых клетках Т-лимфобластного лейкоза, моноцитарной лейкемии и отсутствии данного эффекта в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров.
Впервые показано, что селективные ингибиторы Hsp27 и Hsp90 потенцируют проапоптотическое действие цитостатика (этопозид), глюкокортикоида (дексаметазон) и рекомбинантного TNFα человека в опухолевых клетках Т-лимфобластного лейкоза и моноцитарной лейкемии, а также в мононуклеарных лейкоцитах in vitro.
В эксперименте in vitro показано, что белки теплового шока Hsp90 и Hsp27 являются молекулярными мишенями для таргетного воздействия на программированную гибель опухолевых клеток Т-лимфобластного лейкоза и моноцитарной лейкемии.
Проведена оценка дозозависимого влияния доноров газов NO и H2S на апоптоз клеток линии Jurkat и мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии. Установлено, что селективное проапоптотическое действие газов в отношении опухолевых клеток является следствием митохондриальной дисфункции в трансформированных клетках. При этом газы в различной степени изменяют митохондриальный биогенез. Монооксид углерода увеличивает проницаемость митохондриальных мембран за счет изменения соотношения белков семейства bcl-2. Для оксида азота и сульфида водорода мы предполагаем непосредственное воздействие на белки и липиды митохондриальных мембран, приводящее к рассеиванию трансмемебранного потенциала.
Основным молекулярным механизмом действия газотрансмиттеров является химическая модификация белковых структур, приводящая к изменению активности последних. Нами было показано, что газы специфически модулируют профиль внутриклеточных регуляторных протеинов за счет механизмов, независящих от экспрессии соответствующих генов. Подобный эффект может быть достигнут за счет угнетения протеосомального расщепления модифицированных белков. В нашем исследовании показано, что накопление белков-регуляторов специфично для оксида азота и сульфида водорода.
Установлено, что в отношении клеток Т-лимфобластной лейкемии человека оксид азота проявляет антипролиферативное действие. Выявлено, что в основе замедления прогрессии клеточного цикла при воздействии СО, NO и высокой концентрации H2S лежат неспецифические механизмы. Об этом свидетельствует повышение содержания белков, промотирующих клеточный цикл без адекватной активации последнего. Остановка клеток в G1 фазе при действии низкой концентрации сульфида водорода является следствием снижения содержания циклина D1 и фосфорилированной формы белка ретинобластомы (Rb). Результаты проведенного исследования свидетельствуют о нецелесообразности использования оксида азота в качестве проапоптотического агента в связи с его способностью нарушать деградацию протеинов-ингибиторов каспаз.
Получены принципиально новые данные фундаментального характера о роли белков теплового шока (Hsp27 и Hsp90) в дизрегуляции митохондриального, рецепторного и ядерного путей апоптоза, об уровне экспрессии мРНК и особенностях содержания фосфорилированных форм Hsp27 и Hsp90 в опухолевых клетках Т-лимфобластного лейкоза и моноцитарной лейкемии, а также в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров.
Впервые установлено, что проапоптотическое действие оксида азота и сульфида водорода связано со снижением деградации специфического профиля регуляторных протеинов. Показано, что дисбаланс в системе белков Bcl-2 обусловлен изменением экспрессии соответствующих генов только в случае воздействия на клетки монооксида углерода. Получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что снижение экспрессии генов и остановка клеток в G1 фазе клеточного цикла при действии газов происходит за счет неспецифических механизмов. Продемонстрировано, что инактивация каспазы 9 в случае NO опосредована нарушением деградации протеинов xIAP и AVEN. Нами впервые было показано, что сульфид водорода обладает наименее выраженными цитотоксическими свойствами и антипролиферативным эффектом, реализуемым за счет специфической регуляции элементов G1 фазы клеточного цикла (циклин D1, pRb).
Результаты НИР соответствуют мировому уровню достижений в области молекулярной медицины. Предлагаемый комплексный подход коллектива к решению проблемы таргетной терапии опухолевых заболеваний является инновационным, не имеет мировых аналогов.
