Сравнительное фармакогностическое изучение грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной (стр. 1 )

На правах рукописи

МАЗЕПИНА ЛАРИСА СЕРГЕЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ изучение

грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и

толокнянки обыкновенной

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

доктор фармацевтических наук,

профессор

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «_____» __________________2011 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им.  Министерства здравоохранения и социального развития РФ» г. Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ им.  г. Москва, Нахимовский проспект, д.49

Автореферат разослан «_____»_________________2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного 208.040.09,
доктор фармацевтических наук, профессор		Наталья Петровна Садчикова

о б щ а я х а р а к т е р и с т и к а р а б о т ы

Актуальность темы. В условиях современной жизни не избежать развития различных заболеваний, в том числе урологических, доля которых составляет 10 – 12 % в общей структуре заболеваемости населения России (Урология, 2009). Неосложненные инфекции мочевыводящих путей – одни из самых частых заболеваний женщин репродуктивного возраста. По статистике в нашей стране регистрируется 26 – 36 млн. случаев острого цистита в год. Такая высокая заболеваемость свидетельствует об актуальности и необходимости поиска безопасных, эффективных, не оказывающих побочных эффектов лекарств, к которым, прежде всего, относятся фитотерапевтические средства.

В этом аспекте заслуживает внимания изучение отдельных представителей семейства вересковые (Ericaceae Juss.), в частности грушанки круглолистной (Руrola rotundifolia L.) и зимолюбки зонтичной (Chimaphila umbellata (L.) W. Barton), сходных с таким классическим лекарственным растением, издавна применяемым для лечения урологических заболеваний, как толокнянка обыкновенная (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.), относящаяся к тому же семейству. В сравнении с ней они обладают определенными преимуществами. Так, установлено, что грушанка обладает более выраженным противовоспалительным действием и проявляет терапевтическую эффективность при экспериментальном гломерулонефрите (, 1999). Для зимолюбки характерна противогрибковая активность (J. J. Galvan et al., 2007). В то же время в сравнении с толокнянкой в химическом отношении грушанка и зимолюбка исследованы недостаточно.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось сравнительное фармакогностическое изучение грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной для обоснования возможности использования дополнительных источников растительного сырья в медицинской практике.

Для реализации поставленной цели следовало решить следующие задачи:

-  изучить данные литературы по современному состоянию морфолого-анатомических, фитохимических и фармакологических исследований объектов диссертационной работы;

-  предпринять сравнительное изучение химического состава листьев исследуемых растений, в частности различных элементов, аминокислот, веществ вторичного метаболизма, главным образом фенольных соединений (простых фенолов, флавоноидов, гидроксикоричных кислот, дубильных веществ);

-  подобрать и адаптировать методики количественного определения отдельных групп фенольных соединений в сырье каждого изучаемого растения после предварительного выявления оптимальных условий их проведения;

-  определить содержание отдельных групп фенольных соединений в образцах сырья, заготовленных в различных регионах РФ и реализуемых в аптеках;

-  проанализировать сезонную динамику накопления действующих веществ в листьях грушанки круглолистной и зимолюбки зонтичной для выявления оптимальных сроков их заготовки;

-  провести сравнительный хромато-масс-спектрометрический и морфолого-анатомический анализ листьев изучаемых растений;

-  определить числовые показатели листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и разработать проекты фармакопейных статей предприятия (ФСП) «Листья зимолюбки зонтичной», «Листья грушанки круглолистной» и проект изменения к фармакопейной статье (ФС) ГФ XI «Листья толокнянки».

Научная новизна работы. С использованием современных физико-химических методов анализа (хромато-масс-спектрометрия, ВЭЖХ, масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой, спектрофотометрия и др.) предпринято сравнительное фитохимическое изучение листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной.

Методом масс-спектрометрии определено содержание 5 макро-, 53 микро - и ультрамикроэлемента в листьях изучаемых растений.

При анализе аминокислотного состава листьев грушанки, зимолюбки и толокнянки выявлены 8 незаменимых и 11 заменимых аминокислот.

Подобраны и адаптированы методики количественного определения арбутина, флавоноидов и гидроксикоричных кислот в листьях каждого исследуемого растения.

Проведен сравнительный хромато-масс-спектрометрический и морфолого-анатомический анализ листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной.

Результаты исследований нашли отражение в проектах ФСП «Листья зимолюбки зонтичной» и «Листья грушанки круглолистной», а также в проекте изменения к ФС ГФ XI «Листья толокнянки» в разделе «Количественное определение».

Практическая значимость работы. Предложены методики стандартизации листьев изучаемых растений по отдельным показателям, позволяющие объективно оценивать их доброкачественность.

На основании проведенных исследований составлены и внедрены:

-  спектрофотометрические методики количественного определения отдельных групп фармакологически активных веществ (суммы флавоноидов, суммы гидроксикоричных кислот, арбутина) в листьях грушанки круглолистной (акт о внедрении от 01.01.2001 г. в учебный процесс кафедры фармакогнозии с курсом ботаники ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. академика Минздравсоцразвития РФ»);

-  спектрофотометрическая методика количественного определения арбутина в листьях грушанки круглолистной (акт о внедрении от 01.01.2001 г. в учебный процесс кафедры управления и экономики фармации с курсами фармакогнозии и ботаники, фармацевтической технологии, фармацевтической и токсикологической химии ГОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ»).

Особенности исследований отражены в проектах ФСП «Листья зимолюбки зонтичной» и «Листья грушанки круглолистной» и в проекте изменения к ФС ГФ XI «Листья толокнянки».

Положения, выносимые на защиту:

-  результаты определения элементного и аминокислотного состава сырья грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной;

-  данные сравнительного фитохимического изучения сырья исследуемых растений,

-  особенности сравнительного хромато-масс-спектрометрического и морфолого-анатомического анализа листьев объектов исследования,

-  итоги разработки проектов нормативной документации (НД).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обобщены на конгрессе «Традиционная медицина-2007» (Москва, 2007); научно-практических конференциях: «Фармация и здоровье» (ПГФА, Пермь, 2005), «Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования» (Уфа, 2006), «Лекарства – человеку. Современные проблемы создания, исследования и апробации лекарственных средств» (НФаУ, Харьков, 2006), «Современные вопросы теории и практики лекарствоведения» (ЯГМА, Ярославль, 2007), «Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании» (БГУ, Белгород, 2008), «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (ПГФА, Пермь, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (ЯГМА, Ярославль, 2009); на ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых ЯГМА (Ярославль, ); на межкафедральной научной конференции кафедр фармакогнозии и ботаники, фармацевтической и токсикологической химии, фармацевтической технологии, управления и экономики фармации, фармакологии ЯГМА (Ярославль, 2010 г.).

Апробация работы проведена на межкафедральной научной конференции фармацевтического факультета Первого Московского государственного медицинского университета имени (12 октября 2010 г.).

Публикации материалов исследования. По теме диссертации опубликована 30 работ, из них 7 в журналах, в том числе 2 статьи в журнале, входящем в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК», и 3 статьи в зарубежных журналах.

связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО ЯГМА Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (номер государственной регистрации 01.20.0600898). Тема утверждена на заседании Учёного совета ЯГМА (протокол от 01.01.2001).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), описания материалов и методов (2-я глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложения. Она иллюстрирована 27 рисунками и 44 таблицами. Список литературы включает 262 источника, из них 56 на иностранных языках.

о с н о в н о е с о д е р ж а н и е р а б о т ы

объекты и методы исследования

Объектами исследования для сравнительного фармакогностического анализа служили листья грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной, заготовленные в местах естественного произрастания в различных регионах европейской и азиатской частей РФ, а также образцы, реализуемые в аптеках. В процессе изучения использовали как классические, так и современные методы исследований, в частности хроматографию на бумаге (БХ), спектрофотометрию (СФ-56), хромато-масс-спектрометрию (газовый хроматограф 6850 с масс-селективным детектором 5973 Agilent Technologies), ВЭЖХ с фотометричекой детекцией (аминокислотный анализатор Hitachi 835), ВЭЖХ с УФ-детекцией (хроматограф фирмы «Gilson», модель 305), масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (масс-спектрометр ELAN-DRC-e). Морфолого-анатомический анализ проводили в соответствии с требованиями ГФ XI с использованием цифровой камеры для микроскопа Webbers MYscope 310 M. Определение числовых показателей осуществляли, руководствуясь методиками, описанными в ГФ XI издания (ГФ XI, вып.1, 1987, вып. 2, 1989), а разработку проектов нормативной документации – в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 «Отраслевой стандарт. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» (2000).

Изучение элементного и аминокислотного состава

Содержание макро-, микро - и ультрамикроэлементов в листьях грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной определяли с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе ELAN-DRC-e с использованием метода добавок для контроля точности определений. Всего в листьях анализируемых видов определено содержание 5 макро-, 53 микро - и ультрамикроэлемента (табл. 1). Ряды убывания содержания химических элементов свидетельствуют об индивидуальных особенностях их накопления в каждом из анализируемых растений. Обнаружено, что листья грушанки, зимолюбки и толокнянки являются марганофиллами. Образцы оказались экологически безопасными по содержанию свинца, кадмия, ртути и мышьяка.

Аминокислотный состав листьев изучаемых растений определяли на аминокислотном анализаторе «Hitachi» модели 835 на колонке 0,26×15 см в стандартных условиях после гидролиза (табл. 2). Хроматограммы аминокислотного состава исследуемых листьев приведены на рисунках 1 – 3. Всего нами определено содержание 19 аминокислот, из которых 8 являлись незаменимыми (Val, Ile, Leu, Met, Lys, OH-Lys, Thr, Phe) и 11 заменимыми (Ala, Gly, Ser, Tyr, Cys, Asp, Glu, Arg, His, Pro и OH-Pro). Наибольшее суммарное содержание аминокислот отмечено в листьях грушанки.

Вещества вторичного обмена

Качественное обнаружение веществ вторичного метаболизма, из которых одними из наиболее важных являются фенольные соединения, первоначально мы проводили с использованием одно - и двумерной восходящей хроматографии на бумаге Filtrak FN-4 и FN-6. При двумерном хроматографировании в листьях грушанки нами обнаружено 12 флавоноидных соединений, в листьях зимолюбки и толокнянки – по 15. При хроматографическом изучении нами отмечено по 5 гидроксикоричных кислот в извлечении из листьев каждого растения.

Уточнение данных анализа фенольных соединений методом БХ осуществляли с помощью ВЭЖХ. Исследование проводили на приборе фирмы «Gilson», модель 305 (Франция), инжектор ручной, модель Rheodyne 7125 (USA) с

Таблица 1 – Элементный состав листьев толокнянки обыкновенной, зимолюбки зонтичной и грушанки круглолистной

Элемент	Содержание, мкг/г	Элемент	Содержание, мкг/г
Грушанка	Зимолюбка	Толокнянка	Грушанка	Зимолюбка	Толокнянка
Макроэлементы	Марганец (Mn)	87,6000	240,0000	29,0000
Кальций (Са)	16475,0000	12486,0000	10859,0000	Медь (Cu)	7,5400	8,6600	1,7248
Кремний (Si)	1535,0000	1220,0000	671,0000	Молибден (Mo)	0,0674	0,2159	0,0250
Магний (Mg)	2516,0000	2585,0000	1390,0000	Мышьяк (As)	0,2130	0,2223	0,1203
Натрий (Na)	49,0000	84,0000	13,0000	Неодим (Nd)	0,1020	0,0887	0,0527
Фосфор (P)	1642,0000	1656,0000	1347,0000	Никель (Ni)	0,1100	1,4500	4,3800
Микро - и ультрамикроэлементы	Ниобий (Nb)	0,0301	0,0228	0,0073
Барий (Ba)	80,0000	83,1000	85,0000	Олово (Sn)	0,0764	0,1541	0,0131
Бор (B)	35,7000	15,0000	17,0000	Празеодим (Pr)	0,0269	0,0252	0,0162
Бром (Br)	4,6452	4,0678	4,7000	Ртуть (Hg)	0,0068	0,0522	0,0034
Ванадий (V)	0,5100	0,6400	0,4800	Рубидий (Rb)	8,8228	19,9000	2,8000
Висмут (Bi)	0,0106	0,0304	0,0016	Самарий (Sm)	0,0185	0,0245	0,0164
Вольфрам (W)	0,0379	0,0848	0,0013	Свинец (Pb)	1,5615	2,5969	0,2472
Гадолиний (Gd)	0,0268	0,0194	0,0150	Селен (Se)	0,4580	0,6042	0,5712
Галлий (Ga)	0,1092	0,1305	0,0593	Серебро (Ag)	0,0447	0,1186	0,0020
Гафний (Hf)	0,0078	0,0097	0,0026	Стронций (Sr)	32,6000	31,5000	52,0000
Германий (Ge)	0,0052	0,0097	0,0061	Сурьма (Sb)	0,0144	0,0327	0,0281
Гольмий (Ho)	0,0026	0,0023	0,0017	Талий (Tl)	0,0476	0,0350	0,0027
Диспрозий (Dy)	0,0173	0,0127	0,0083	Тантал (Ta)	0,0014	0,0020	0,0004
Европий (En)	0,0253	0,0505	0,0064	Теллур (Te)	0,0053	0,0098	0,0013
Эрбий (Er)	0,0058	0,0048	0,0034	Тербий (Tb)	0,0034	0,0027	0,0017
Железо (Fe)	447,1000	350,0000	235,0000	Титан (Ti)	8,3600	8,9000	3,0400
Итербий (Yb)	0,0057	0,0045	0,0012	Торий (Th)	0,0663	0,0596	0,0152
Итрий (Y)	0,0744	0,0760	0,0582	Тулий (Tu, Tm)	0,0014	0,0011	0,0007
Йод (I)	0,0653	0,1491	0,0403	Уран (U)	0,0086	0,0096	0,0025
Кадмий (Cd)	0,3428	0,1770	0,0060	Хром (Cr)	8,6600	9,7700	9,4000
Кобальт (Co)	2,8500	2,1800	1,8973	Цезий (Cs)	0,0779	0,1090	0,0081
Лантан (Lo)	0,1154	0,1228	0,1076	Церий (Ce)	0,2406	0,2429	0,1637
Литий (Li)	0,0202	0,2150	0,0050	Цинк (Zn)	27,7000	33,0090	30,9000
Лютеций (Lu)	0,0009	0,0008	0,0002	Цирконий (Zr)	0,4394	0,4297	0,1106

Таблица 2 – Аминокислотный состав листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной