Разработка и использование адъювантов на основе (стр. 2 )

Отработанные условия УЗ обработки позволили получить липосомальные вакцинные композиции, визуально отвечающие критериям истинных липосомальных дисперсий.

В результате действия ультразвука в процессе приготовления липосомальных дисперсий возможно снижение активности инкапсулируемого материала. Поэтому далее определяли уровень специфической активности липосомальной комбинированной вакцины ЛДС-М и моновакцины против гепатита В в тесте ИФА. В качестве контрольных препаратов использованы исходные очищенные дифтерийный и столбнячный анатоксины, а также HBsAg. Полученные результаты иммуноферментного анализа представлены в таблице 5.

Таблица 5

Оценка специфической активности липосомальных вакцин после УЗ обработки

№ опыта	ЛДС-М	ЛВГВ	Контрольные препараты
столбнячный компонент, Lf/мл	дифтерийный компонент, Lf/мл	HBsAg, мкг/мл	ОКСА, Lf/мл	ОКДА, Lf/мл	HBsAg, мкг/мл
1	9,03	10,30	19,70	10,80	8,95	18,64
2	10,67	9,10	20,04	10,70	10,90	19,85
3	9,63	10,10	19,95	11,05	10,50	20,65
4	8,77	10,60	20,11	9,15	9,34	19,60
M±m	9,53±0,42*	10,03±0,37*	19,95±0,09*	10,43±0,42	9,92±0,46	19,69±0,41

Примечание: * - p>0,05 различие не значимо по сравнению с контрольным препаратом

Таким образом, проведенные исследования показали, что ультразвуковая обработка не снижает специфическую активность испытуемых липосомальных вакцин и, следовательно, может быть включена в технологию получения липосомальных препаратов на основе дифтерийно-столбнячного анатоксинов и HBsAg. При выбранном режиме ультразвукой обработки в течение 25-30 минут образовывались липосомальные дисперсии, способные проходить через стерилизующие мембраны, что позволило проводить стерилизацию на конечном этапе производства, используя мембранную технологию.

Доказательством включения смеси анатоксинов и HBsAg в липосомы явились результаты гельхроматографии липосомальных дисперсий. Было установлено, что эффективность включения для дифтерийного анатоксина - 94,43 %, столбнячного - 96.98 %, гепатитного компонента - 76,90 %.

Важное значение для характеристики липосомальных вакцин имеют следующие показатели: средний размер, индекс полидисперсности и дзета-потенциал. Индекс полидисперсности характеризует гетерогенность системы, которая может колебаться от 0 (100% гомогенность) до 1,0 (100% гетерогенность). Дзета-потенциал – величина, отражающая взаимное влияние друг на друга дисперсной среды и диспергированной частицы, является важным индикатором поверхностного заряда частиц. Этот показатель может быть использован для прогнозирования и контроля устойчивости коллоидных суспензий или эмульсий (табл. 6).

Таблица 6

Характеристика липосомальных вакцинных препаратов

Образец	Средний размер, нм	Дзета-потенциал, мВ	Индекс полидисперсности
ЛДС-М	142,1	-3,90	0,277
ЛВГВ	125,8	-14,60	0,243

Из приведенных данных видно, что средние размеры липидных частиц и их способность включать антигены позволяют охарактеризовать полученные нами структуры как липосомы. Дзета-потенциал липосомальной вакцины против гепатита В имеет высокое значение, что свидетельствует о стабильности этой композиции. Вместе с тем дзета-потенциал ЛДС-М вакцины составил минус 3,90 мВ. По данным литературы [Heurtault B., 2003], такое значение дзета-потенциала свидетельствует о недостаточной стабильности полученной липосомальной дисперсии.

В связи с этим были проведены эксперименты по стабилизации липосомальных дисперсий с помощью лиофилизации. Отработку процесса высушивания проводили с учетом его влияния на физические свойства и специфическую активность липосомальной вакцины. В результате был отработан следующий режим лиофилизации: замораживание препарата ниже температуры (-35 0С) и выдерживание при этой температуре не менее 4 часов; проведение стадии лиофилизации при температуре препарата (-35 0С) в течение 15 часов; досушивание препарата при плюсовых температурах продолжительностью 15 часов.

В качестве защитной среды использовали наиболее доступный углевод - сахарозу, которую добавляли в различных концентрациях (2, 4, 6, 8 %). Было установлено, что при использовании концентраций сахарозы от 2 до 6 % препарат обладал высокой гигроскопичностью, что приводило к плавлению массы и снижению активности дифтерийного и столбнячного компонентов. Использование сахарозы в концентрации 8 % обеспечивало образование плотной пористой массы и сохранение специфической активности антигенов на исходном уровне. При этом были получены липосомы стандартного состава, основная масса которых состояла из частиц размером 150-170 нм.

Установлено, что разработанный режим сублимации и выбранная концентрация криопротектора (8 %) обеспечивают остаточную влажность основной массы ЛДС-М вакцины в диапазоне (3,5±0,5) % и её стабильность в течение 12 месяцев (максимальный срок наблюдения) (табл. 7).

Таблица 7

Изучение стабильности лиофилизированной липосомальной

дифтерийно-столбнячной вакцины

Срок хранения	pH	Характеристика ЛДС-М вакцины
Средний размер липосом, нм	Специфическая активность, Lf/мл
дифтерийный компонент	столбнячный компонент
1 мес.	6,95	152,0	10	10
6 мес.	7,05	158,2	10	10
12 мес.	7,00	166,7	10	10

После определения основных технологических параметров получения лиофилизированной липосомальной дифтерийно-столбнячной вакцины и липосомальной вакцины против гепатита В представлялось целесообразным изучить качественные характеристики полученных препаратов, из которых основной является иммуногенность. Результаты испытания иммуногенных свойств по протективной активности ЛДС-М вакцины представлены в таблице 8.

Таблица 8

Результаты изучения протективной активности ЛДС-М вакцины

в опытах на животных

Столбнячный компонент	Препарат	Доза введенного токсина	Количество животных	Выживаемость, %
иммунизированных	выживших
ЛДС-М вакцина	50 DLM	11	11	100
АДС-М анатоксин*	50 DLM	11	11	100
Контроль столбнячного токсина	1 DLM	4	0	0
Дифтерийный компонент	ЛДС-М вакцина	100 DLM	4	4	100
АДС-М анатоксин*	100 DLM	4	4	100
Контроль дифтерийного токсина	1 DLM	3	0	0

Примечание: *- препарат сравнения

Из данных таблицы видно, что разработанный липосомальный препарат обеспечивает резистентность иммунизированных морских свинок и белых мышей к дифтерийному и столбнячному токсину. Показатель выживаемости в обеих группах животных составил 100 % при регламентированных требованиях к АДС-М вакцине: 100 % для дифтерийного компонента и не менее 70 % для столбнячного компонента.

Дополнительные испытания липосомального препарата в опытах на морских свинках показали, что группы животных, в которых использовался ЛДС-М, имели уровень антител, сопоставимый с уровнем индуцируемым АДС-М анатоксином, адсорбированном на геле гидроксида алюминия (табл. 9).

Таблица 9

Результаты изучения иммуногенных свойств липосомальной ЛДС-М вакцины в опытах на морских свинках

Препарат	Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл
дифтерийный компонент	столбнячный компонент
ЛДС-М вакцина	3213,33** [881,97-8090,22]	3341,93** [316,48-6569,70]
АДС-М анатоксин, адсорбированный на геле гидроксида алюминия*	3302,72 [746,,05]	3441,33 [1164,,86]

Примечание: * - контроль; ** - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем

Результаты испытания иммуногенных свойств ЛВГВ вакцины приведены в таблице 10.

Таблица 10

Результаты изучения иммуногенных свойств вакцины против гепатита В с адъювантами различной природы

Препарат	Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл
I иммунизация	II иммунизация
ЛВГВ	15,04** [9,70-23,31]	5571,42**[3681,34-8431,89]
Вакцина против гепатита В с гелем гидроксида алюминия*	15,88* [12,12-20,81]	6345,05* [3581,,70]

Примечание: *- контроль; ** - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем

Из представленных данных видно, что после первой и второй иммунизации средняя геометрическая титра анти-HBs в опытной и контрольной группе животных не отличались. Полученные результаты демонстрируют высокие иммуногенные свойства ЛВГВ, сопоставимые с вакциной против гепатита В, адсорбированной на геле гидроксида алюминия.

Разработанные формы липосомальных вакцин не обладали пирогенными свойствами и по показателям стерильности, токсичности, иммуногенности полностью соответствовали требованиям, предъявляемым к коммерческим вакцинным препаратам. Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность липосомальных вакцинных препаратов. На основании полученных данных можно сделать вывод о перспективности использования липосом в качестве адъювантов вакцин.

По результатам проведенных исследований были разработаны технологии получения липосомальных форм вакцинных препаратов, схемы которых представлены на рисунках 1, 2.

 

Рис. 1. Схема технологии получения лиофилизированной ЛДС-М вакцины

Раствор липидов в органическом растворителе