Разработка и использование адъювантов на основе (стр. 1 )

наночастиц в технологии вакцинных препаратов

На правах рукописи

разработка и Использование адъювантов на основе

наночастиц в технологии вакцинных препаратов

14.04.01 - Технология получения лекарств

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь – 2013

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук

ч

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

, г. Пермь

доктор биологических наук,

Институт экологии и генетики микроорганизмов

Уральского отделения РАН

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Минздрава России

Защита состоится « 19 » марта 2013 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава Российской Федерации .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава Российской Федерации по адресу: 6.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www. ***** «__» _____ 2013 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России http://www. ***** «__» ______ 2013 г.

Автореферат разослан «___» февраля 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вакцинопрофилактика рассматривается в современных условиях как одно из ведущих массовых эффективных средств борьбы с инфекциями [, 2001, , 2010, , 2010]. Стремление создать вакцины из высокоочищенных антигенов, которые в большинстве случаев обладают слабой иммуногенностью, привело к необходимости применения адъювантов, усиливающих иммунный ответ [, 2010, с соавт., 2010, Manmohan S., 2007].

Разработка эффективных адъювантов – носителей антигенов, обеспечивающих формирование выраженного и длительно сохраняющегося иммунитета, является одной из сложнейших задач в производстве вакцинных препаратов. На стадиях экспериментальных исследований и клинических испытаний находятся вакцины, направленные на профилактику более 60-ти видов заболеваний. Поэтому разработка новых адъювантов приобретает особую актуальность в связи с постоянной необходимостью усиливать иммунный ответ на обширное количество новых антигенов, для большинства которых характерна слабая иммуногенность [, 2010, с соавт., 2010]. Следует указать, что использование адъювантов имеет и экономическую целесообразность, так как вакцины с адъювантами требуют минимального расхода антигена [S. L. Plotkin, 2004].

В настоящее время как самые перспективные адъюванты в мировой и отечественной практике рассматриваются наночастицы: липосомы, виросомы, иммуностимулирующие комплексы, эмульсии (MF59, SAF, Montanide), полимерные наносферы, вирусоподобные частицы и др. [ с соавт., 2008, D. Drane et al., 2006, J. Aucouturier et al., 2002].

Липосомы считаются нетоксичными, сами липиды не обладают иммуногенностью, включенные в липосомы вещества не вызывают пирогенные, токсические или аллергические реакции организма. Все эти особенности липосом могут быть весьма эффективно реализованы в вакцинных препаратах [, 2004, с соавт., 2008, с соавт., 2009].

В МИТХТ им. профессором с соавт. [2008] разработаны сферические аморфные наночастицы (САНЧ) из смеси тритерпеноидов бересты (СТБ). В модельных экспериментах, выполненных на базе филиала ФГУП "НПО "Микроген" МЗ РФ "Пермское НПО "Биомед" с использованием экспериментальных образцов САНЧ, нами была выявлена их адъювантирующая способность в отношении вакцины против гепатита В.

Учитывая перспективность применения САНЧ в качестве носителя антигенных препаратов, представлялось целесообразным для использования в вакцинных композициях разработать технологию, обеспечивающую получение адъюванта на основе САНЧ, соответствующего требованиям, предъявляемых к препаратам для парентерального введения.

Цель исследования – разработка и использование адъювантов на основе липосомальных структур и сферических аморфных наночастиц в технологии вакцинных препаратов.

Основные задачи исследования:

1. Разработать технологию получения липосомальных композиций с эффективным включением рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В, дифтерийного и столбнячного анатоксинов. Разработать методы контроля технологического процесса и стандартизации липосомальных композиций.

2. Оценить полученные липосомальные вакцинные композиции по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам. Изучить адъювантные свойства липосом в отношении дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В.

3. Отработать параметры технологического процесса получения адъюванта САНЧ. Разработать методы контроля технологического процесса и стандартизации готового адъюванта. Оценить физико-химические и биологические свойства САНЧ.

4. Получить вакцинные композиции на основе САНЧ и оценить их иммунобиологические свойства.

Личный вклад автора. Все приведенные в диссертации данные были получены лично автором на базе ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России и в филиале » Минздрава России "Пермское НПО "Биомед".

Научная новизна. Впервые по разработанной технологии получены липосомальные формы вакцинных препаратов: лиофилизированный дифтерийно-столбнячный анатоксин и жидкая вакцина против гепатита В, отвечающие требованиям к препаратам, вводимым парентерально, по показателям безопасности и эффективности. Установлены критерии и параметры контроля технологического процесса и качества липосомальных форм вакцин: гомогенность липосомальной дисперсии, средний размер, дзета-потенциал, фотометрический показатель дисперсности (ФПД), эффективность включения антигенов в липосомы, стерильность, токсичность, иммуногенность. Получены гомогенные липосомальные дисперсии с эффективностью включения антигенов не менее 75%, со средними размерами частиц 120-170 нм, дзета-потенциал которых составлял минус 12-15 мВ.

Разработана технология получения САНЧ из СТБ, отвечающих требованиям к адъювантам, используемых при производстве вакцин для парентерального введения. Впервые создан стерильный апирогенный препарат САНЧ. При испытании его в опытах на лабораторных животных показано отсутствие токсических свойств и установлена высокая адъювантирующая способность на примере вакцинных препаратов против гриппа и гепатита В.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическая значимость результатов исследований состоит в расширении знаний об адъювантных свойствах липосомальных структур и САНЧ. Показана возможность получения вакцинных препаратов для парентерального введения с указанными адъювантами. Созданные вакцинные композиции обосновывают перспективность дальнейших исследований по углубленному изучению адъювантных свойств липосомальных структур и САНЧ в отношении различных групп антигенов.

В ходе выполнения данных исследований разработаны:

- технология получения липосомальной вакцины против гепатита В (ЛВГВ) и лиофилизированной комбинированной липосомальной дифтерийно-столбнячной вакцины (ЛДС-М) для парентерального введения;

- технология получения стерильного, апирогенного, нетоксичного лиофилизированного адъюванта на основе нанодисперсии из смеси тритерпеноидов бересты. Составлен проект ФСП «Нанодисперсия САНЧ из смеси тритерпеноидов бересты лиофилизированная». Установлен адъювантирующий эффект САНЧ на примере вакцин против гриппа и гепатита В. В Пермском и Иркутском филиалах НПО «Микроген» проведены испытания адъюванта САНЧ (акты испытания от 01.01.2001, 23.11.2012). Технология получения липосомальной формы анатоксинных композиций может быть перспективна в плане изучения возможностей ее использования в производстве гетерогенных антитоксических сывороток при подготовке антигенного материала для иммунизации животных.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе ГБОУ ВПО ПГФА на факультете дополнительного профессионального образования (ФДПО) (сертификационный цикл «Фармацевтическая технология»). Подготовлен материал к лекционным и практическим занятиям для слушателей интернатуры и ФДПО (акт внедрения от 01.01.2001). Опубликовано учебно-методическое пособие для слушателей ФДПО «Биотехнологические аспекты производства лекарственных средств», Пермь, 2010 г.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были доложены на XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2010; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия», Курск, 2010; Научно-практической конференции Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, 2011; Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации», Пермь, 2011; Х Съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации», Москва, 2012; Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности», Казань, 2012.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, включая 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 148 стр. машинописного текста, содержит 43 таблицы и 22 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, двух глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 170 источников, из них 79 отечественных и 91 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения липосомальных композиций с эффективным включением поверхностного антигена вируса гепатита В, дифтерийного и столбнячного анатоксинов.

2. Результаты контроля физико-химических и иммунобиологических свойств липосомальных вакцинных композиций.

3. Технология получения адъюванта на основе сферических аморфных наночастиц из смеси тритерпеноидов бересты. Методы контроля технологического процесса и стандартизации готового адъювантного препарата САНЧ.

4. Характеристика иммунобиологических свойств вакцинных композиций с использованием в качестве адъюванта САНЧ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава посвящена анализу данных литературы, касающихся характеристики классических адъювантов на основе соединений алюминия и современных адъювантных препаратов, приготовленных с использованием бионанотехнологий. Приведены сведения, обосновывающие необходимость использования адъювантов для создания эффективных высокоиммуногенных вакцинных препаратов. Подробно изложен материал по липосомальным структурам с описанием технологических приемов их получения. Представлены сведения по уникальным наночастицам на основе тритерпеноидов бересты, обладающих высокой биологической активностью.

. Во второй главе приведены основные материалы и методы, использованные при проведении экспериментальных исследований. Для получения вакцинных композиций применяли очищенные концентрированные анатоксины: столбнячный (ОКСА) и дифтерийный (ОКДА) (производство филиала » МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»), рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) очищенный концентрированный (производство HeberBiotech, Куба), лецитин (производство , Украина) и смесь тритерпеноидов бересты (производство мир», Россия).

В работе при выполнении экспериментов в качестве препаратов сравнения использовали следующие вакцины: АДС-М-анатоксин - анатоксин дифтерийно-столбнячный очищенный адсорбированный с уменьшенным содержанием антигенов жидкий (производство филиала » МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»); экспериментальная вакцина против гриппа инактивированная расщепленная (производство филиала » МЗ РФ в г. Уфа "НПО "Иммунопрепарат"); вакцина против гепатита В с содержанием геля гидроксида алюминия 0,5 мг/мл (производство филиала » МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»).

При разработке технологии получения липосомальных дисперсий использовали в качестве базовых два метода: обращение фаз и дегидратация/регидратация.

Определение степени включения антигенного материла в липосомы проводили с помощью гельхроматографии на ультрогеле АсА 34 (Pharmacia, Швеция) и сефарозе 6В (Pharmacia, Швеция), используя оборудование фирмы «LKB» (Швеция) и «Dоmbifrac» (Россия).

Газо-жидкостную хроматографию в металлической колонке с сорбентом Хроматон-N-AW для определения концентрации тетрагидрофурана (ТГФ) в пробах адъюванта на основе САНЧ выполняли на базе судебно-химического отделения Пермского Краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы. Обработка результатов проводилась с помощью программы «Хроматэк Аналитик» (СКБ Хроматэк, Россия).

Специфическую активность анатоксинов и их липосомальных дисперсий оценивали в реакции коагглютинации (РКОА) с диагностическими реагентами на основе аффинноочищенных антител (экспериментальные серии филиала » МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»). Для определения специфической активности HBsAg применяли реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарным диагностикумом производства НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород).

Определение специфической активности антигенов в иммуноферментном анализе проводили с помощью следующих тест-систем: иммуноферментной тест-системы для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В «ИФА-HВsAg» производства НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород); экспериментальной иммуноферментной тест-системы для выявления дифтерийного и столбнячного антигенов на основе F(ab)2-фрагментов дифтерийных и столбнячных антител, меченных пероксидазой хрена (филиал » МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»).

Для анализа полученных наночастиц на основе липосомальных структур и САНЧ были использованы фотометрические и спектрофотометрические методы: определение ФПД, индекса окисления фосфолипидов.

Определение средних размеров фосфолипидных частиц методом лазерного корреляционного светорассеяния и определение дзета-потенциала с помощью электрофоретического рассеяния проводили на приборе Zetasizer Nano ZS фирмы Malvern.

Точку эвтектики для липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка (ЛДС-М) и САНЧ при отработке режима лиофилизации определяли методом анализа зависимости электрического сопротивления от температуры.

Лиофилизацию полученных образцов проводили с помощью аппарата для сублимирования ТГ-50 (Германия) на базе филиала » МЗ РФ «Пермский НПО «Биомед».

Оценку полученных экспериментальных образцов проводили в соответствии с Европейской Фармакопеей и отечественными нормативными документами по следующим показателям: стерильность, пирогенность, токсичность, иммуногенность. Стерильность и пирогенность определяли по ГФ ХII издания. Токсические свойства ЛДС-М и САНЧ оценивали в экспериментах по изучению острой и хронической токсичности согласно основным положениям РД «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов». Иммуногенную активность компонентов ЛДС-М вакцины по показателю выживаемости устанавливали по резистентности иммунизированных морских свинок (масса 300±50 г) к дифтерийному тест-токсину и по резистентности иммунизированных белых мышей (масса 17±1 г) к столбнячному тест-токсину. Иммуногенную активность липосомальных вакцин и вакцин на основе САНЧ по индуцированию специфических антител определяли в опытах на морских свинках и белых мышах. Уровень антител в сыворотках иммунизированных животных оценивали с помощью иммуноферментного метода, используя экспериментальные тест-системы для определения дифтерийных, столбнячных и гриппозных антител, разработанные в филиале » МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» и коммерческие тест-системы для определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В производства фирмы «BIO-RAD» и НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород).

Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985).

Третья глава посвящена разработке технологии получения липосомальных композиций, отвечающих требованиям к вакцинным препаратам по показателям стерильности, пирогенности, токсичности на модели дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В.

Дизайн проведенных исследований по разработке технологии получения липосомальных вакцинных композиций представлен в таблице 1.

Первоначально в исследованиях при оценке качества лецитина - исходного сырья для конструирования липосомальных вакцин, по показателю пирогенности и индекса окисления, который характеризует стабильность липидных мембран, нами было показано, что липидная субстанция по показателю пирогенности соответствует фармакопейным требованиям к парентеральным препаратам и по индексу окисления (0,160±0,003) соответствует нормам, предъявляемым к фосфолипидам при получении липосомальных лекарственных форм.

Таблица 1.

Дизайн исследования по разработке технологии получения липосомальных вакцинных композиций

Этапы исследования	Исследуемый показатель
1. Оценка качества исходного сырья	Пирогенность; индекс окисления фосфолипидов
2. Выбор метода получения липосомальной вакцины	Термостабильность антигенов; влияние органических растворителей на антигены; специфическая активность антигенов
3. Отработка режимов ультразвуковой обработки	Специфическая активность антигенов; средний размер липосом; фотометрический показатель дисперсности
4. Характеристика липосомальных дисперсий	Степень включения антигенов; дзета-потенциал; средний размер; гомогенность системы; стерильность; специфическая активность
5. Стабилизация липосомального дифтерийно-столбнячного анатоксина	Эвтектическая точка; подбор концентрации криопротектора; специфическая активность антигенов
6. Изучение иммунобиологических свойств	Пирогенность; токсичность; иммуногенность

При создании липосомальных вакцин следует учитывать физико-химические свойства каждого отдельного антигена, чтобы избежать снижения эффективности препарата. Различия в термостабильности антигенов определяют особенности конструирования липосомальных вакцин. Для обоснования выбора метода получения липосомальной композиции мы проводили исследования по определению устойчивости к повышенной температуре антигенного материала. В модельных опытах антигены прогревали при различных температурах в течение 2 часов в соответствии с длительностью термообработки при использовании метода обращения фаз (табл. 2).

Таблица 2

Оценка сохранения специфической активности в образцах исследуемых антигенов после термообработки методом ИФА

Температура, 0С	Специфическая активность после термообработки, % сохранения активности
дифтерийный компонент	столбнячный компонент	гепатитный компонент
45	100	60	100
65	50	0	100
80	0	0	30

Из представленных данных видно, что наиболее стабильным оказался гепатитный антиген, анатоксинные компоненты менее устойчивы к воздействию повышенных температур. Столбнячный анатоксин в течение 2-х часовой обработки при 450С терял 40 % своей активности. Поэтому при отработке способа получения ЛДС-М вакцины за основу был выбран метод дегидратации/регидратации. В свою очередь, HBsAg вплоть до температуры 80 0С сохранял свою активность.

На основании результатов этих опытов для изготовления липосомальной вакцины против гепатита В нами испытаны 2 метода получения: дегидратации/регидратации и метод обращения фаз (табл. 3).

Таблица 3

Результаты ИФА по определению специфической активности липосомальной

вакцины против гепатита В

№ опыта	Метод получения
дегидратации/регидратация	обращения фаз
HBsAg, мкг/мл	HBsAg, мкг/мл
1	19,50	-
2	19,60	-
3	21,00	-
M±m	20,03±0,48	-

Несмотря на высокую термоустойчивость гепатитного компонента, его исходная специфическая активность не сохранялась при использовании метода выпаривания с обращением фаз за счет денатурирующего действия органических растворителей на антигенный белок. В связи с этим для получения липосомальной вакцины против гепатита В был выбран метод дегидратации/регидратации.

Отрабатывая начальные технологические стадии получения липосомальных композиций, мы выбрали оптимальное соотношение лецитина и антигенных компонентов (дифтерийно-столбнячный анатоксин / лецитин - 1:1, поверхностный антиген вируса гепатита В / лецитин 1:1), и в качестве раствора для регидратации липидной пленки - 0,01 М трис-HCl буфер, рН 7,0-7,2.

В технологии получения липосомальных препаратов ультразвуковая обработка является одним из основных приемов для гомогенизации дисперсий.

В связи с этим в следующей серии экспериментов для гомогенизации полученных мультиламеллярных липосомальных дисперсий дифтерийно-столбнячной вакцины отрабатывали оптимальный режим ультразвуковой обработки (УЗ) (табл.4).

Из приведенных в таблице данных видно, что при увеличении длительности УЗ обработки показатели оптической плотности снижались, значения ФПД увеличивались, что соответствовало уменьшению размера частиц. Оптимальная продолжительность УЗ обработки составила 25-30 минут.

После 25 минутной обработки дисперсии обладали хорошей смачивающей способностью, имели голубоватый оттенок.

Таблица 4

Отработка режимов ультразвуковой обработки липосомальных дисперсий

дифтерийно-столбнячной вакцины

Характеристика	Время обработки (мин)
0*	5	10	15	20	25	30
Оптическая плотность при 400 нм	∞	1,200	0,375	0,160	0,080	0,050	0,045
Оптическая плотность при 540 нм	1,750	0,800	0,220	0,082	0,042	0,025	0,020
ФПД	-	1,354	1,777	1,992	2,147	2,310	2,702
Средний размер частиц, нм	1442,0	241,4	167,8	160,2	133,6	125,6	118,9

Примечание: * – липосомальная дисперсия до обработки ультразвуком