Разработка и использование адъювантов на основе (стр. 3 )

Рис. 2. Схема технологии получения жидкой ЛВГВ вакцины

На начальных технологических стадиях производства липосомальных вакцин проводят упаривание спиртового раствора липидов на роторном испарителе до полного удаления спирта и образования тонкой липидной пленки на стенках колбы при давлении -90 Па в течение 1,5-2 часов. Далее липидную пленку гидратируют в трис-буфере, содержащем антиген, при температуре 41-43 0С. Таким образом получают дисперсию мультиламеллярных везикул с включенным антигеном. На следующей технологической стадии проводят гомогенизацию ультразвуком в течение 30 минут при 35 kHz и температуре 41-43 0С. Для стандартизации технологического процесса получения липосом на данной стадии необходимо контролировать оптическую плотность полуфабриката при двух длинах волн 540 нм и 400 нм, средний размер частиц, ФПД, а также специфическую активность. Оптическая плотность и размер липосом после ультразвуковой обработки должны уменьшаться, а специфическая активность антигенов должна оставаться на исходном уровне. На последующих стадиях проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и контролируют стерильность. Для стабилизации липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка предусмотрена стадия лиофилизации. ЛВГВ стабильна в жидком виде, ее лиофилизации не подвергают. В течение срока наблюдения (12 месяцев) вакцина оставалась гомогенной, не имела признаков расслоения. Соблюдение всех отработанных параметров технологического процесса гарантирует получение стандартного препарата.

В четвертой главе изложены результаты по разработке технологического процесса получения адъюванта САНЧ из СТБ, соответствующего требованиям к вакцинным препаратам для парентерального введения, по отработке методов контроля технологического процесса и стандартизации готового адъювантного препарата САНЧ, а также представлены данные по изучению иммунобиологических свойств САНЧ.

Дизайн проведенных исследований по разработке технологии получения САНЧ представлен в таблице 11.

Таблица 11

Дизайн исследования по разработке технологии получения САНЧ

Этап исследования	Исследуемый показатель
1. Отработка метода стерилизации	Гомогенность дисперсий; оценка сорбционной способности мембран
2. Отработка метода очистки дисперсий САНЧ	Фотометрический показатель дисперсности; концентрация СТБ и ТГФ; стерильность
3. Отработка метода лиофилизации	Эвтектическая точка; концентрация СТБ и ТГФ; стерильность; фотометрический показатель дисперсности
4. Контроль готового препарата	Дзета-потенциал; средний размер частиц; содержание основного вещества; остаточное количество ТГФ; рН; стерильность; пирогенность; токсичность; сорбционные свойства САНЧ; потеря в массе при высушивании

При разработке новых адъювантов и при внедрении их в медицинскую практику следует тщательно изучить все стороны их действия, учитывая требования по стерильности, пирогенности, токсичности. Выполняя этот раздел исследований, первоначально мы считали необходимым выбрать оптимальный метод стерилизации САНЧ, который можно было бы применить на заключительной технологической стадии производства. Для получения стерильного адъюванта оценивалась возможность использования термических и мембранных методов стерилизации. При отработке методов мембранной технологии для стерилизации было установлено, что на поверхности фильтров из нейлона, полиэфирсульфона, ацетатацеллюлозы происходит сорбция САНЧ. Термическая обработка, нарушая структуру аморфных наночастиц, вызывала их агрегацию. Таким образом, стерилизация САНЧ мембранными и термическими методами на конечных этапах производства невозможна. С целью получения адъюванта, отвечающего требованиям к препаратам для парентерального введения, мы отработали технологию, в которой все исходные растворы должны стерилизоваться на начальных этапах производства САНЧ, и весь дальнейший технологический процесс должен проходить в стерильных условиях.

Поэтому мы предложили мембранную технологию стерилизации исходной смеси СТБ/ТГФ с помощью фильтроэлемента с модифицированным поверхностным зарядом, который обладал низкой сорбционной способностью в отношении СТБ и устойчивостью к ТГФ.

Основной стадией получения САНЧ является осаждение частиц при смешивании со стерильным буферным раствором. В результате последующей обработки ультразвуком в течение 5 минут образовывались гомогенные дисперсии САНЧ.

На следующем этапе наших исследований отрабатывали метод очистки дисперсии САНЧ. С целью удаления токсичного ТГФ применяли ультрафильтрацию на полых волокнах с номинальной отсекающей молекулярной массой 300 кДа в режиме ультрадиафильтрации. Для определения оптимальных условий ультрафильтрации была отработана система контроля процесса по следующим параметрам: ФПД, концентрации смеси тритерпеноидов бересты и ТГФ.

Лиофилизацию САНЧ проводили с учетом значения зоны эвтектической температуры по режиму сублимации, отработанному для липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка. В результате проведенных исследований была разработана технология получения САНЧ, схема которой представлена на рисунке 3.

Контроль готового препарата осуществляли по следующим показателям: описание, подлинность, количественное определение СТБ, остаточное количество ТГФ, pH, показатель дисперсности, потеря в массе при высушивании, стерильность, токсичность, пирогенность.

Важными характеристиками наночастиц при отработке технологии получения САНЧ являются их средний размер и дзета-потенциал. В следующей серии экспериментов нами были определены данные показатели: дзета-потенциал составил минус 44,3 мВ, средний размер частиц - 160-180 нм.

Остаточное количество ТГФ в готовом препарате определяли методом ГЖХ. Анализ полученных результатов показал, что отработанный метод ультрафильтрации обеспечивает эффективное удаление ТГФ, его концентрация в препарате составила 0,176±0,009 мг/мл. Последующая стадия лиофилизации способствовала снижению остаточной концентрации ТГФ до 0,122±0,004 мг/мл, т. е. почти на 30 %. Следует отметить, что по данным ГФ XII издания, предельно допустимое количество тетрагидрофурана, принимаемое в составе суточной дозы в лекарственных средствах, не должно превышать 7,2 мг/мл, что в 2360 раз меньше, чем при введении 25 мкг САНЧ (предполагаемое содержание в одной дозе вакцинного препарата).

 

Рис. 3. Схема технологии получения САНЧ

Токсические свойства препарата оценивали в опытах по определению острой и хронической токсичности. Для изучения острой токсичности белым мышам вводили препарат внутрибрюшинно однократно в дозе 0,5 мл (25 мкг САНЧ) на мышь (что соответствует 2994 человеческим дозам), морским свинкам (массой 300-350 г) - подкожно в дозе 5,0 мл (250 мкг САНЧ) на морскую свинку (что соответствует 1851 человеческой дозе). При изучении хронической токсичности белым мышам вводили САНЧ в концентрации 50 мкг/мл в дозе по 0,5 мл (25 мкг САНЧ) внутрибрюшинно трехкратно (1, 4, 9 сутки) в суммарной дозе 1,5 мл на мышь (что соответствует 8982 человеческим дозам). Животным группы сравнения водили 0,9 % раствор натрия хлорида по аналогичным схемам.

Результаты наблюдения показали, что однократное и многократное введение препарата не вызывало гибели животных, не приводило к снижению массы тела (табл. 12, 13), изменениям волосяного покрова, некробиотическим изменениям на месте введения.

Таблица 12

Динамика изменения массы животных после однократного введения препарата

Исследуемый препарат	Вид животных	Исходная масса животных, г	Массы животных на 1 сут, г	Массы животных на 8 сут, г*
САНЧ	Белые мыши	18,24±0,14	18,58±0,184	21,48±1,24
Морские свинки	317,50±2,10	320,50±1,90	367,00±3,50
NaCl 0,9% (контроль)	Белые мыши	18,09±0,16	18,30±0,14	22,20±0,98
Морские свинки	324,10±2,39	327,50±2,03	372,10±4,15

Примечание: * - p>0,05 различие не значимо по сравнению с контролем

Таблица 13

Динамика изменения массы белых мышей после многократного введения препарата

Исследуемый препарат	Исходная масса животных, г	Массы животных на 1 сут, г	Массы животных на 22 сут, г*
САНЧ	18,46±0,18	18,78±0,60	27,80±2,89
NaCl 0,9% (контроль)	18,60±0,46	18,68±0,62	27,63±2,80

Примечание: * - p>0,05 различие не значимо по сравнению с контролем

Через 24 ч и 13 суток после последней инъекции при оценке хронической токсичности в группе сравнения и опытной группе внутренние органы животных имели все характерные признаки, расположение и строение. Оболочки, выстилающие внутренние полости влажные, серовато-розового цвета, без признаков воспаления.

Таким образом, при изучении острой и хронической токсичности было установлено, что адъювант САНЧ не вызывает симптомов интоксикации, не обладает токсическим действием на системы и органы лабораторных животных, не способствует развитию патологических, в том числе воспалительных, дистрофических и некротических изменений.

При отработке технологии получения САНЧ определяли их сорбционную способность. В результате было установлено, что САНЧ в концентрации 50 мкг/мл эффективно связывает поверхностный антиген вируса гепатита В (табл. 14).

Таблица 14

Определение сорбционной способности САНЧ

Концентрация САНЧ, мкг/мл	Эффективность включения антигенов, %
дифтерийный анатоксин	столбнячный анатоксин	HBsAg
50	3,59	5,84	96,56
100	1,24	1,34	97,85
200	9,91	3,11	98,92
400	13,56	14,73	99,47
500	29,35	20,98	99,39

В тоже время, как видно из данных таблицы 14, даже при концентрации САНЧ 500 мкг/мл эффективность связывания по отношению к дифтерийному и столбнячному анатоксину составляет менее 30 %. Поэтому в последующих сериях экспериментов по конструированию вакцинных композиций с использованием адъюванта САНЧ мы применяли поверхностный антиген вируса гепатита В и экспериментальную Split-вакцину против вируса гриппа (штамм Уругвай/716/2007/H3N2).

Результаты по оценке иммуногенных свойств приготовленных вакцинных композиций с использованием HBsAg представлены в таблице 15.

Таблица 15

Результаты изучения иммуногенных свойств вакцины против гепатита В с адъювантами различной природы в опытах на морских свинках

Вакцинные композиции (суммарная доза на одно животное)	Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл
I иммунизация	II иммунизация
20 мкг HBsAg+50 мкг САНЧ	40,02* [17,53-91,35]	1276,63** [830,24-1963,03]
20 мкг HBsAg+500 мкг САНЧ	44,92* [15,40-130,96]	1192,26** [681,91-2084,57]
Контроль коммерческая вакцина против гепатита В (20 мкг HBsAg+500 мкг Al(OH)3)	22,81 [10,94-47,52]	586,69 [401,97-856,30]

Примечание: * - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем; ** - различия средних величин существенны по сравнению с контролем

Из приведенных данных видно, что после первой иммунизации средняя геометрическая титра специфических антител в исследуемых группах животных практически не отличались. После второй иммунизации в группах животных, в которых использовался адъювант САНЧ, наблюдался достоверно более высокий уровень анти-НВs, чем в группе животных, иммунизированных коммерческой вакциной. При этом следует отметить, что снижение концентрации САНЧ в 10 раз не оказывало влияния на иммуногенные свойства вакцины против гепатита В. Различия величин СГТ сравниваемых групп не существенны. Таким образом, было показано, что адъювантирующие свойства САНЧ проявляются в концентрациях значительно меньших, чем широко используемый в качестве адъюванта гель гидроксида алюминия, обеспечивая высокую иммуногенность вакцины против гепатита В.

Данные по изучению иммуногенности вакцинных композиций с САНЧ против вируса гриппа приведены в таблице 16.

Таблица 16

Иммуногенные свойства вакцины против гриппа с адъювантом САНЧ

Вакцинные композиции	Количество гемагглютинина (ГА) на одно животное, мкг	Среднее геометрическое значение оптической плотности
1,5 мкг ГА + 25 мкг САНЧ	1,5	1,015[0,877-1,173]**
1,5 мкг ГА + 250 мкг САНЧ	1,5	0,791[0,596-1,051]**
1,5 мкг ГА + 500 мкг САНЧ	1,5	0,676[0,546-0,836]***
1.5 мкг ГА*	1,5	0,551[0,429-0,708]

Примечание: *- контроль (несорбированный гемагглютинин); ** - различия средних величин существенны по сравнению с контролем; *** - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем

Представленные результаты ИФА показали, что САНЧ проявлял выраженные адъювантирующие свойства. Из препаратов с адъювантами максимальный уровень антител у животных обеспечила вакцинная композиция с низкой дозой САНЧ.

Таким образом, разработанная нами технология позволяет получать адъювант САНЧ стерильным и апирогенным с высокими адъювантирующими свойствами, которые могут быть использованы для конструирования высокоиммуногенных вакцинных препаратов.

По результатам проведенных исследований составлен проект Фармакопейной статьи предприятия на адъювант «Нанодисперсия САНЧ из смеси тритерпеноидов бересты лиофилизированная» в соответствии с требованиями ОСТа 91400.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения". Проект ФСП предусматривает контроль препарата по следующим показателям: описание, подлинность по кофеату бетулина, количественное определение, фотометрический показатель дисперсности, pH, потеря в массе при высушивании, остаточное количество тетрагидрофурана, пирогенность, токсичность, стерильность. Срок годности исследуется (табл. 17).

Таблица 17

СПЕЦИФИКАЦИЯ

Нанодисперсия САНЧ из смеси тритерпеноидов бересты лиофилизированная

Показатели	Методы	Нормы
1	2	3
Описание	Визуальный	Плотная пористая масса белого или желтовато-белого цвета. При добавлении к содержимому флакона 25 мл раствора воды для инъекций и интенсивном встряхивании в течение 1 мин должна образовываться дисперсия белого или желтовато-белого цвета.
Подлинность	Спектрофотометриче-ский	Ультрафиолетовый спектр поглощения раствора субстанции (по кофеату бетулина) в области от 220 до 350 нм должен иметь максимум при 320 ±2 нм.

Продолжение таблицы 17

1	2	3
Содержание тритерпеноидов бересты	Спектрофотометрический	0,95 – 1,05 мг/мл
Фотометрический показатель дисперсности	Фотоэлектроколориметрический	От 2,0 до 2,6
рН	ГФ ХII, Т.1, С.89, потенциометрически	От 8,5 до 9,3
Остаточное количество тетрагидрофурана	ГЖХ	Не более 0,2 мг/мл
Потеря в массе при высушивании	ГФ ХI, Т. 1, С.176	Не более 5,0 %
Стерильность	Метод прямого посева, ГФ ХII, Т. 1, С.150	Дисперсия должна быть стерильна
Токсичность	Биологический, ГФ ХII, Т. 1, С.124	Дисперсия должна быть нетоксична
Пирогенность	Биологический, ГФ ХII, Т. 1, С.125	Дисперсия должна быть апирогенна
Упаковка		Во флаконы вместимостью 100 мл, укупоренные пробками из резины и завальцованные колпачками алюминиевыми.
Хранение		В соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 0С.
Срок годности		Срок наблюдения 12 месяцев

В экспериментально-производственных условиях была приготовлена серия адъюванта САНЧ, которая прошла испытания с положительными результатами в филиалах » в г. Пермь и в г. Иркутск.

ВЫВОДЫ

1.  С использованием метода дегидратации/регидратации и последующей ультразвуковой обработки разработана технология получения лиофилизированной комбинированной липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка и жидкой липосомальной моновакцины против гепатита В со средним размером частиц 120-170 нм и эффективностью включения антигенов не менее 75 %. Отработана система контроля технологического процесса и готового препарата.

2.  Липосомальные вакцины, полученные по разработанной технологии, по показателям специфической активности, пирогенности, стерильности, токсичности полностью отвечали требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам. В опытах in vivo установлен выраженный адъювантирующий эффект липосом в отношении дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В. Липосомальная дифтерийно-столбнячная вакцина и липосомальная вакцина против гепатита В в опытах на животных проявили иммуногенные свойства, сопоставимые с аналогичными адсорбированными на геле гидроксида алюминия коммерческими вакцинами.

3.  Разработана технология получения адъюванта на основе сферических аморфных наночастиц из смеси тритерпеноидов бересты. Отработаны методы контроля технологического процесса получения САНЧ и готового адъювантного препарата. Разработанная технология обеспечивает получение стерильного, апирогенного, нетоксичного адъюванта со средним размером частиц 160-180 нм, дзета-потенциалом минус 44,3 мВ. Разработан проект Фармакопейной статьи предприятия на САНЧ.

4.  Получены вакцины на основе расщепленного вируса гриппа (штамм Уругвай/716/2007/H3N2) и рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В с использованием в качестве адъюванта САНЧ. В опытах на животных установлено, что экспериментальные вакцинные препараты по иммуногенности превосходили базовые вакцины и по показателям стерильности, пирогенности, токсичности полностью отвечали требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.  Иванов, подходы к получению липосомальной формы коклюшной вакцины // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство : сб. материалов конгр. : тез. докл., Москва, 12–16 апр. 2010 г. – Москва, 2010. – С. 623–624.

2.  Иванов, подходы к созданию липосомальных форм вакцинных препаратов // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. тр. III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курского гос. мед. ун-та. – Курск. 2010. – С. 63–65.

3.  Изучение возможности использования нанодисперсии экстракта бересты в качестве адъюванта вакцинных препаратов / , , // Сиб. мед. журн. – 2011. – Т. 26, № 2. – С. 65–67.

4.  Вахтин, оптимального режима ультразвуковой обработки липосомальной дисперсии АДС анатоксина / , // Вестн. Перм. гос. фармац. акад. – 2011 – № 8 – С. 204 – 206.

5.  Иванов, использования нанодисперсии экстракта бересты в качестве адъюванта // Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации : материалы науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию ПГФА, Пермь, 7–9 дек. 2011 г. – Пермь, 2011. – С. 77–80.

6.  Иванов, липосомальной вакцины против гепатита В / , // Инфекция и иммунитет. – 2012. – Т. 2, № 1–2. – С. 443.

7.  Иванов, технологии получения адъюванта для парентерального введения на основе экстракта бересты // Биоматериалы и нанобиоматериалы : актуальные проблемы и вопросы безопасности : тез. докл. Всерос. молодежной науч. школы, Казань, 18–22 июня 2012 г. – Казань, 2012. – С. 54.

8.  Иванов, как адъюванты комбинированных вакцин / , , // Перм. мед. журн. – 2012. – Т. 29, № 4. – С. 110–115.

(Россия)

Разработка и использование адъювантов на основе наночастиц в технологии вакцинных препаратов.

Установлен адъювантный эффект липосом в отношении дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В. На основе липосомальных структур разработана технология получения лиофилизированной комбинированной дифтерийно-столбнячной вакцины, а также моновакцины против гепатита В для парентерального введения. В опытах на животных липосомальные вакцины проявили иммуногенные свойства сопоставимые с аналогичными коммерческими вакцинами, адсорбированными на геле гидроксида алюминия. Разработана технология получения стерильного, апирогенного, нетоксичного адъюванта на основе сферических аморфных наночастиц из смеси тритерпеноидов бересты. Применение адъюванта растительного происхождения позволило получить вакцины на основе расщепленного вируса гриппа (штамм Уругвай/716/2007/H3N2) и рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В по иммуногенности превосходящие базовые препараты. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о перспективности использования липосом и сферических аморфных наночастиц в технологии вакцинных препаратов.

Ivanov Aleksandr (Russia)

Development and use of adjuvants based on nanoparticles in vaccine technology.

Adjuvant effect of liposomes against diphtheria, tetanus toxoids and hepatitis B surface antigen has been established. The technology of obtaining of a freeze-dried liposomal form of diphtheria-tetanus vaccine and liposomal form of hepatitis B vaccine for parenteral introduction has been elaborated. In experiments on animals the liposomal vaccines revealed the immunogenic properties comparable with similar vaccines adsorbed on gel of aluminium hydroxide. The technology of obtaining of sterile, nonpyrogenic, nontoxic adjuvant based on spherical amorphous nanoparticles from a mix of birch bark triterpenoids has been developed. Vaccines for prophylactic of influenza (strain Uruguay/716/2007/H3N2) and hepatitis B with plant-derived adjuvant have revealed higher immunogenic properties than similar base vaccines. The received results reveal prospective usage of liposomes and spherical amorphous nanoparticles as adjuvants in vaccine preparations technology.