На правах рукописи
КОРОКИН МИХАИЛ ВИКТОРОВИЧ
ПУТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ
МЕТАБОЛИЗМА ОКСИДА АЗОТА
ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
доктора медицинских наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научные консультанты:
доктор медицинских наук,
профессор
доктор медицинских наук,
профессор
Официальные оппоненты:
Член-корреспондент РАМН,
заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук,
профессор
доктор медицинских наук,
профессор
доктор медицинских наук,
профессор
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет»» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится «___ »________________ 2012 г. в________ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.040.13 ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени , стр.2.
С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени : г. Москва, Нахимовский проспект,.
Автореферат разослан «____________ » 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д. 208.040.13
доктор медицинских наук,
профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность научного исследования
В патогенезе и клинике артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции сосудистого эндотелия (Napoli С., 2001; Falk Е., 2006; Е, , 2008; , 2002). Развитие эндотелиальной дисфункции при дефиците оксида азота представляются многообразным комплексом соединяющихся и взаимообусловленных механизмов.
Коррекция эндотелиальной дисфункции и, как следствие, нарушений метаболизма оксида азота приводит к снижению риска возникновения, а также предупреждению патогенетических механизмов развития и клинических проявлений артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений (, 2000; , 2006; Das М., Das D. K., 2008; Lin K. Y., Ito A., 2002).
Сравнительно недавно к потенциальным факторам риска сердечнососудистых заболеваний стали относить гипергомоцистеинемию. Гипергомоцистеинемия может являться независимым фактором развития эндотелиальной дисфункции или усиливать уже имеющееся повреждение эндотелия (J. Zhou, G. H. Werstuck, S. Lhotak, 2008). Известных факторов коррекции гипергомоцистеинемии не так много и, пожалуй, к ним следует отнести лишь экзогенное введение витамина В6 и фолиевой кислоты. В клинических исследованиях применение фолиевой кислоты или 5- метилтетрагидрофолата (5-МТГФ, активная и циркулирующая форма фолиевой кислоты) заслужило наибольшего внимания, так как данные агенты/средства могут оказывать потенциально благоприятное влияние на метаболизм тетрагидробиоптерина (ВН4).
Одновременно, появление в последние годы понятий «эндогенного ингибирования» эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) и «разрыва eNOS» привело к интенсификации исследований, направленных на их предотвращение, как ключевых звеньев в коррекции эндотелиальной дисфункции. Метилированные аналоги L-аргинина - ассиметричный диметиларгинин (ADMA) и монометиларгинин (L-NMMA) - являются эндогенными ингибиторами эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). (Antoniades С., 2006; Bode-Boger SM, Scalera F, Ignarro LJ., 2007). «Разрыв eNOS» представляет собой переключение ферментной активности eNOS на выработку супероксида, а не окиси азота. При этом на ключевую роль в регуляции функции eNOS выдвигается кофактор птерина тетрагидробиоптерин (ВН4). Дефицит ВН4 при сосудистых заболеваниях вызван, в основном, окислением тетрагидробиоптерина пероксинитритом. Следовательно, стратегии, направленные на защиту эндогенного ВН4 от окислительных атак со стороны пероксинитрита, могут привести к сохранению оптимальной эндотелиальной концентрации тетрагидробиоптерина.
Кроме того, ограничение образования оксида азота может быть обусловлено высокой активностью аргиназы - фермента, разрушающего L-аргинин в слизистой оболочке тонкого кишечника. Становится очевидной необходимость подавления высокой активности аргиназы для снижения риска и частоты развития болезней сердца и сосудов. С этой целью возможно использовать ингибиторы аргиназы. Среди веществ данной группы наибольший интерес представляет L-норвалин - неселективный ингибитор фермента аргиназы (D. L. Costanzo, М. Ilies, 2010).
В ранее проводимых исследованиях было показано, что L-аргинин как при монотерапии, так и в сочетании с антигипертензивными средствами на ADMA - подобной модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции эффективно увеличивал активность эндотелиальной NO-синтазы и продукцию оксида азота и предотвращал развитие эндотелиальной дисфункции в эксперименте (, , 2008; , , 2009; , , 2006).
Таким образом, среди нарушений метаболизма NO можно выделить факторы, ведущие к снижению его выработки (пониженное поступление L - аргинина, повышенная активность аргиназ, ингибирование и разобщение eNOS, повреждение эндотелиоцитов и т. д.) и уменьшению биодоступности (окислительный стресс, гиперлипидемия, воспаление). Очевидно, что в настоящее время достаточно большое внимание уделяется изучению путей фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота при эндотелиальной дисфункции. Однако, в доступной литературе не обнаружено сравнительного комплексного изучения эндотелио - и кардиопротективной активности терапевтических подходов, направленных на предотвращение эндогенного ингибирования и разобщения eNOS с субстратом с помощью тетрагидробиоптерина, L-аргинина, L-норвалина, витамина В6 и фолиевой кислоты, а также их комбинаций с представителями основных групп препаратов, обладающих эндотелиопротективными эффектами (эналаприл, лозартан, амлодипин, мексикор), при различных экспериментальных моделях эндотелиальной дисфункции.
Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на гг., номер госрегистрации 0120.0710379. Номер государственной регистрации темы диссертационного исследования -.
Цель исследования - провести сравнительную оценку фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота с помощью терапевтических подходов, направленных на предотвращение эндогенного ингибирования и разобщения эндотелиальной NO-синтазы с субстратом при различных экспериментальных моделях дефицита оксида азота.
Основные задачи исследования
1. Исследовать развитие эндотелиальной дисфункции при гипергомоцистеин индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
2. Изучить эндотелио - и кардиопротективную активность тетрагидробиоптерина, L-аргинина и L-норвалина при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции
3. Изучить эндотелио - и кардиопротективную активность сочетанного применения L-аргинина с тетрагидробиоптерином и L-норвалином при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции
4. Изучить эндотелио - и кардиопротективную активность эналаприла, лозартана и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME - индуцированной эндотелиальной дисфункции
5. Изучить эндотелио - и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и эналаприла при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции
6. Изучить эндотелио - и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и лозартана при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции
7. Изучить эндотелио - и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
8. Изучить эндотелио - и кардиопротективную активность эссенциальных фосфолипидов, потенцированных антител к эндотелиальной NO-синтазе, мельдония и этилметилгидроксипиридина сукцината, витамина В6 и фолиевой кислоты при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
Научная новизна исследования
В работе впервые предложен способ моделирования гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Продемонстрировано, что эндотелиальная дисфункция на фоне внутрижелудочного введения метионина связана с гипергомоцистеинемией и характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3,6 раза. Одновременно гипергомоцистеин индуцированная эндотелиальная дисфункция не сопровождается повышением абсолютных значений систолического и диастолического артериального давления. Кроме того, развитие эндотелиальной дисфункции сопровождалось снижением показателей биохимических маркеров (концентрация стабильных метаболитов оксида азота (Total NO, NOx), экспрессия эндотелиальной NO-синтазы), повышением концентрации гомоцистеина а также отрицательной динамикой морфометрических показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов).
В работе впервые показано, что преодоление разобщения eNOS c cубстратом путем введения тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг в качестве кофактора и влияние на метаболизм L-аргинина путем блокирования фермента аргиназы с помощью L-норвалина 10 мг/кг в качестве монотерапии оказывают эндотелио - и кардиопротективное действие при внутрибрюшинном введении в течение 7 суток как на модели L-NAME-индуцированной, так и гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. При гипергомоцистеин индуцированной патологии продемонстрировано выраженное эндотелио - и кардиопротективное действие L-аргинина.
Впервые предложен способ комбинированной фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота с помощью сочетанного применения тетрагидробиоптерина и L-аргинина, L-норвалина и L-аргинина. При сочетанном применении тетрагидробиоптерина и L-аргинина, L-норвалина и L-аргинина обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном приближении исследуемых показателей функции сосудистого эндотелия к таковым показателям интактных животных.
Эналаприл 0,5 мг/кг, лозартан калия 6 мг/кг, амлодипин 0,5 мг/кг обладали эндотелиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии. Впервые показано, что сочетанное использование тетрагидробиоптерина с вышеперечисленными представителями основных групп антигипертензивных препаратов приводит к положительному фармакодинамическому взаимодействию, что обусловлено различными точками приложения фармакологических эффектов изучаемых препаратов.
Впервые доказано, что комбинация витамина В6 и фолиевой кислоты, эссенциальные фосфолипиды, мельдоний, этилметилгидроксипиридина сукцинат и потенцированные антитела к эндотелиальной NO-синтазе оказывают выраженное эндотелио - и кардиопротективное действие при моделировании эндотелиальной дисфункции с помощью внутрибрюшинного введения L-NAME в дозе 25 мг/кг и внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг.
Впервые установлено увеличение экспрессии eNOS под влиянием тетрагидробиоптерина в качестве монотерапии и в комбинации с эналаприлом, лозартаном, амлодипином и L-аргинином.
Таким образом, на основании выполненных исследований разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицировать как крупное научное достижение, заключающееся в формировании целостных представлений о механизмах нарушения и путях фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида при эндотелий ассоциированной патологии путем предотвращения эндогенного ингибирования, преодоления разобщения eNOS с субстратом и увеличения биодоступности оксида азота.
Научно-практическая значимость
Предложенная модель гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции и комплексный подход к оценке патологии дает возможность в дальнейшем оценивать эндотелиопротективные свойства фармакологических агентов и проводить скрининг эндотелиопротективной активности новых веществ.
Экспериментально обосновано применение тетрагидробиоптерина в качестве монотерапии и в комбинации с L-аргинином, комбинации L-аргинина с L-норвалином, витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата, мексикора и импазы, а также комбинаций тетрагидробиоптерина с эналаприлом, лозартаном и амлодипином для коррекции выраженной гипергомоцистеинемии, эндотелиальной дисфункции и снижения риска развития сердечно - сосудистой патологии. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки и внедрения фармакологических препаратов на основе тетрагидробиоптерина, L-аргинина и L-норвалина в качестве средств для профилактики и лечения эндотелий ассоциированной патологии. По результатам проведенных исследований на мощностях ОАО "Новосибхимфарм" готовится к промышленному выпуску препарат, содержащий в своем составе L-аргинин и L-норвалин.
Сравнительный анализ полученных экспериментальных данных о эндотелио - и кардиопротективной активности традиционных антигипертензивных препаратов в комбинации с тетрагидробиоптерином позволит разработать новые лекарственные средства для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Внедрение результатов научных исследований
На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований L-норвалина, L-аргинина, тетрагидробиоптерина, их комбинаций, а также комбинаций тетрагидробиоптерина эналаприлом, лозартаном и амлодипином при эндотелий ассоциированной патологии.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив форте производства -Лексредства» (РУ № ЛCP-008120/08), фосфоглив производства -Лексредства» (РУР N002528/01) и мельдоний (Кардионат) производства -УфаВИТА» (РУ ЛCP-006481/08), включены в состав документов, поданных на регистрацию в М3 РФ.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности комбинации L-аргинина и L-норвалина включенны в состав документов для промышленного выпуска нового оригинального препарата, содержащего в своем составе L-аргинин и L-норвалин (ООО "Новосибхимфарм").
Полученные результаты используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и учебных программах кафедр фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии, фармакологии и фармацевтических дисциплин, биохимии и фармакологии Белгородского государственного университета, фармакологии Воронежской медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Гипергомоцистеин индуцированная эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3 раза, снижением показателей биохимических маркеров, повышением концентрации гомоцистеина а также характерной динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы.
2. Тетрагидробиоптерин 10 мг/кг, L-аргинин 200 мг/кг, L-норвалин 10 мг/кг, а также комбинации тетрагидробиоптерина 10 мг/кг и L-аргинина
200 мг/кг, L-норвалина 10 мг/кг и L-аргинина 200 мг/кг оказывают выраженное эндотелио - и кардиопротективное действие при моделировании гипергомоцистеин - и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции.
3. Комбинация витамина В6 и фолиевой кислоты, препараты «Фосфоглив», «Кардионат», «Мексикор» и «Импаза» в качестве монотерапии обладают эндотелио - и кардиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии.
4. Эналаприл 0,5 мг/кг, лозартан 6 мг/кг и амлодипин 0,5 мг/кг оказывают выраженное эндотелио - и кардиопротективное действие на моделях гипергомоцистеин - и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции. При комбинированном использование тетрагидробиоптерина 10 мг/кг с энаиаприлом 0,5 мг/кг, лозартаном 6 мг/кг и амлодипином 0,5 мг/кг на моделях гипергомоцистеин - и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований.
Апробация диссертации
Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых КГМУ в 2гг., I-IV всероссийских конференциях молодых ученых-медиков, Росийской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), шестой международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2007), съезде терапевтов юга России «Врач XXI века: сегодня и завтра» (Росто-на-Дону, 2009), научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2009), XIII - XVII национальных конгрессах «Человек и лекарство», I, II, V национальных конгрессах терапевтов и кардиологов, VII съезде аллерголов и иммунологов СНГ, V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт - Петербург, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Москва, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011).
Апробация диссертации проведена 27 июня 2011 года на совместном заседании кафедр Курского государственного медицинского университета и Белгородского государственного национального исследовательского университета.
Диссертационная работа обсуждена на научно-практической конференции кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней Первого МГМУ имени 10 ноября 2011 г. (протокол )
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке цели и поиске путей ее достижения. Им проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, на основании чего выдвинуты рабочие гипотезы о возможных фармакотерапевтических стратегиях и биологических моделях для исследования эндотелио - и кардиопротективной активности выбранных веществ и препаратов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.
В печатных работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, моделирование исследуемой патологии и введение тестируемых препаратов, выведение животных из эксперимента с помощью аппаратного комплекса Biopac, регистрация необходимых показателей гемодинамики (САД, ДАД, ЧСС, интенсивность функционирования структур, ЛЖД, максимальная скорость сокращения и расслабления) on-line с помощью программного комплекса «Asqknowledge 3.8.1», проведение функциональных проб (эндотелийзависимая и эндотелийнезависимая вазодилатация, нагрузка объемом и сопротивлением, пробы на адренореактивность, гипоксию и реоксигенацию) статистическая обработка, научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, из них 25 в российских рецензируемых научных журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций, отражающих полностью содержание диссертации. Получено 8 патентов РФ на изобретения
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 615 источников, из них 87 отечественных и 528 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 394 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 69, рисунков - 110, схем -1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Опыты проводились на белых крысах самцах линии Wistar массой 1г. Раствор для внутрижелудочного введения метионина готовили ех tempore с помощью растворителя ТВИН-80 и 1% крахмального раствора. С целью моделирования эндотелиальной дисфункции метионин (, г. Белгород) вводили ежедневно, 1 раз в сутки, внутрижелудочно в дозе 3 г/кг в течение 7 дней (n=10 животных).
N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился самцам ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг. На 8 день от начала эксперимента при моделировании L-NAME-индуцированной и гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей гемодинамики. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством аппаратного комплекса «Biopac» (США) и компьютерной программы «Aсqknowledge 3.8.1». Болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Проводили следующие функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) (Laursen J. В., 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (, 1991).
Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством аппаратного комплекса «Biopac» (США) и компьютерной программы «Aсqknowledge 3.8.1» регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления
(- dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС).
Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:
1. Проба на адренореактивность - внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1*10-5 моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г массы тела (, 1980).
2. Нагрузка сопротивлением - пережатие восходящей аорты на 30 сек (, 1980).
3. 3-х минутная гипоксия (, 1993).
Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (, , 2005). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ваннадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски.
Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (, , 2002). Детекцию полосы eNOS проводили методом усиленной хемолюминесценции (ECL).
Концентрацию гомоцистеина (ГЦ) определяли энзиматическим методом с помощью набора фирмы Pliva-Lachema Diagnostika s. r.o. Для определения концентрации гомоцистеина использовали свежую гепаринизированную плазму крови без гемолиза..
Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца и почек во всех сериях экспериментов. Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использована окраска гематоксилином и эозином. При морфометрии сердца использован метод определения попереченого диаметра кардиомиоцитов по методике .
Обоснование доз и дизайн эксперимента. В рамках данной работы проведено исследование эндотелио - и кардиопротективной активности ряда фармакологических агентов. В хронических экспериментах при моделировании гипергомоцистеин - и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции препараты вводились в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно или внутрижелудочно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME или метионина.
Исследование активности тетрагидробиоптерина (ВН4) (Sigma Aldrich, USA) проводили при внутрибрюшинном введении ВН4 в дозе 10 мг/кг/сутки. Данная доза выбрана в соответствии с литературными данными, где диапазон дозировок при исследовании активности тетрагидробиоптерина находится в пределах от 5 мг/кг до 20 мг/кг.
L-норвалин (WIRUD GmgH, Hamburg) вводился в дозе 10 мг/кг/сутки. Согласно данным современных исследователей, именно начиная с этой дозировки L- норвалин способен ингибировать фермент аргиназу.
Исследована эндотелиотропная активность L-аргинина производства EUROBIOPHARM GmgH, Hamburg в дозе 200 мг/кг/сутки, которая была определена нами по данным литературы, в соответствии с которыми эндотелиопротективные эффекты L-аргинина проявляются в дозах от 30 до 500 мг. В соответствии с исследованиями, проводимыми в лаборатории кардиофармакологии НИИ ЭМ КГМУ дозозависимые эндотелиопротективные эффекты L-аргинина обнаружены в дозах 30 и 200 мг/кг.
Фолиевую кислоту (Валента Фармацевтика, ОАО) вводили внутрижелудочно в дозе 0,2 мг/кг/сутки в течение 7 дней. Витамин В6 (Верофарм) вводили внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг/сутки.
Эндотелио - и кардиопротективная активность мельдония (Кардионат®, производства -Лексредства», Россия) исследовалась в дозе 80 мг/кг/сутки. Максимальная суточная доза мельдония для человека массой 70 кг равняется 1000 мг, т. е. 14,28 мг/кг, коэффициент пересчета на площадь поверхности тела человека - 39,0, коэффициент для крысы массой 200г равен 6,5 в результате максимальная терапевтическая доза для крыс с данной массой тела равнялась 84,26 мг/кг/сутки.
Этиметилгидроксипиридина сукцинат, препарат «Мексикор» () вводили внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг. Данная доза препарата определена в соответствии с ранее полученными экспериментальными данными исследования активности препарата «Мексикор».
Для исследования эндотелио - и кардиопротективной активности препарата «Импаза» (сверхмалые дозы аффинно очищенных антител к эндотелиальной NO-синтазе, смесь гомеопатических разведений С12+С30+С200, производства «Материа Медика Холдинг», Россия) препарат разводили в поилках из расчёта 1 таблетка на 100 мл воды. Крысы получали импазу в свободном доступе к питью с учётом объема потребляемой жидкости 20±3 мл/животное/сут., что соответствовало суточной дозе 1 таб/кг массы животного.
Для изучения эффективности эссенциальных фосфолипидов был выбран препарат «Фосфоглив», капсулы производства - Лексредства» в дозе 2,2 г/кг/сутки. Доза препарата рассчитывалась по входящему в их состав фосфатидилхолину, равноэквивалентно содержанию последнего в препарате эссенциале форте Н (капсулы) и последующему пересчету доз с человека на крысу в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Препараты с доказанными эндотелиопротективными свойствами вводили внутрижелудочно в течение 7 суток. Эналаприла малеат («Рениприл», производства -Лексредства»), лозартан калия («Блоктран», производства -Лексредства»), амлодипин («Амлотоп», производства «Макизфарма»), использовали в дозах 0,5 мг/кг/сутки, 6 мг/кг/сутки, 0,5 мг/кг/сутки соответственно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие препаратов в экспериментах. При комбинированном использовании препаратов использовались те же дозы, пути введения, и та же продолжительность применения.
Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±m) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные, при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании гипергомоцистеин - и L-NAME - индуцированного дефицита NO.
Внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг однократно в сутки в течение 7 дней не привело к статистически значимому изменению артериального давления. Внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг /кг однократно в сутки в течение 7 дней крысам-самцам, привело к стойкому и статистически значимому повышению артериального давления (рис. 1АД).
Проведение функциональных проб с оценкой реакций на эндотелий - зависимое и эндотелийнезависимое расслабление сосудов показало существенные отличия в группах с патологией от группы интактных животных и животных контрольной серии, получавших соллюбилизатор ТВИН 80.
|
| ||
|
|
1- Твин 80 (контроль); 2 – Метионин 3 г/кг; 3 – Интактные; 4 – L-NAME
Рис. 1. Функциональные показатели при моделировании гипергомоцистеин и L - NAME индуцированного дефицита NО.
Здесь и далее: САД, ДАД, АД систолическое, диастолическое артериальное давление, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр - адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением.
Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин.
В наших экспериментах КЭД в группе интактных самцов составил - 1,1±0,1, при L-NAME индуцированном дефиците оксида азота - 5,4±0,6, в контрольной группе животных, получавших ТВИН,9±0,2, при гипергомоцистеин индуцированном дефиците оксида азота - 3,3±0,3 (рис. 1КЭД).
Гипергомоцистеин и L-NAME индуцированные модели патологии приводят к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением (рис. 1АДр, рис. 1НС).
У интактных самцов миокардиальный резерв к 25 секунде проведения пробы составлял 83,6±7,7 относительно значений на 5-й секунде, в контрольной группе животных 85,4±6,1, а у животных с гипергомоцистеин и L-NAME индуцированной патологией данный показатель был значительно ниже и составил соответственно 65±5,5% и 69,8±4,7% (рис. 1НС).
Характерная динамика биохимических маркеров гипергомоцистеин и L - NAME индуцированного дефицита оксида азота представлена на рисунке 4. Экспрессия эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) при L-NAME индуцированной патологии составила 21,4±4,7%, тогда как у интактных животных - 72,9±3,8% (рис. 4eNOS).
|
|
|
|
| ||
Концентрация стабильных метаболитов оксида азота (NOx) у животных, получавших L-NAME и метионин, соответственно, составила 61,2±3,6 и
72,9 ±4,6 мкМоль, тогда как соответствующие значения у интактных животных составили - 114,1±4,1 и 121,2±7,4 мкМоль (рис. 4NOx).
Внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг привело к статистически значимому увеличению концентрации гомоцистеина. Так в контрольной группе животных, получавших ТВИН 80 данный показатель составил 8,6±1,4 мкМоль/л, в группе животных, получавших метионин - 53,5±8,1 мкМоль/л (рис. 4НCу)
Результаты гистологических исследований показали, что при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции диаметр поперечного сечения кардиомиоцитов статистически достоверно не отличался от такового показателя в контрольной группе животных. При моделировании L-NAME индуцированного дефицита оксида азота обнаружено статистически достоверное увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов до 18,5±1,1 мкм, тогда как у интактных животных данный показатель составил 9,1±1,1 мкм (рис.4ДК).
При гистологическом исследовании сердца отмечены сосудистые изменения в виде спастического состояния артериол, утолщения их стенок. При окраске гематоксилином Рего выявлялись очаговые сегментарные или тотальные повреждения кардиомиоцитов контрактурного типа.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 |
