Роль гипергомоцистеинемии в формировании протромботических нарушений системы гемостаза (стр. 3 )

**- достоверное различие между группами больных с и без ГГЦ, р£ 0,05

Существенным фактором тромбообразования является нарушение функционирования антикоагулянтной системы. Нами было изучено влияние ГГЦ на резистентность к активированному протеину С (APC-R) и активность антитромбина. Полученные данные отразили тенденцию к активации антитромбина у больных с нормальным уровнем ГЦ в плазме. При повышенном уровне ГЦ подобного эффекта не отмечалось (табл. 6).

Таблица 6.

Активность антитромбина у обследованных пациентов (М±SD)

Группы больных	Активность антитромбина, %
В целом	Без ГГЦ	С ГГЦ
ОВТ	118,7±31,6*	128,0±32,6*	94,0±5,6
ПТБ	103,5±14,9*	104,9±15,0*	99,0±14,7
ААНК	100,4±10,9*	104,6±10,5* **	96,8±10,2**
ААНК (↑ ишемии)	110,3±15,4*	113,0±17,9* **	106,5±13,1* **
Стабильное течение ИБС	103,2±10,1	104,3±10,7	101,0±5,7
ОИМ (2-е сутки)	92,8±27,6	96,7±30,0	86,8±22,9
ОИМ (14-е сутки)	102,2±13,8	102,2±14,4	102,2±13,1

* - достоверное различие с нормой (95,0 ± 14,0 %), р £ 0,05 **- достоверное различие между подгруппами больных с и без ГГЦ, р£ 0,05

Наиболее наглядно угнетение активности антитромбина (АТ) при повышенном уровне ГЦ проявлялось у больных ААНК. Если у пациентов в целом данный показатель был достоверно выше, чем в норме (100,4±10,9 % против 95,0±14,0 %, р=0,02), то у лиц с ГГЦ наблюдалось снижение активности антитромбина как вне обострения, так и при нарастании ишемии.

Влияние гомоцистеина на степень чувствительности плазмы к активированному протеину С изучали у женщин с ПМС (n=28), т. е. исключив возможность влияния тромботического эпизода на рассматриваемый показатель. Обязательными критериями включения в исследование было отсутствие АФС, мутации фактора V Leiden, беременности и использования гормональной контрацепции, т. е. известных причин APC-R. У пациенток с ГГЦ индекс APC-R был достоверно снижен в сравнении с пациентками с нормальным уровнем ГЦ (2,7 против 3,3; p=0,004). Причиной нарушений в системе протеина С при ГГЦ может быть появление модифицированных гомоцистеином белков, которые в свою очередь индуцируют развитие антител, препятствующих действию APC на активированные факторы V и VIII.

Снижение компенсаторных возможностей системы свертывания крови при повышенном уровне ГЦ прослеживалось в динамике показателей гемостаза на 2-е и 14-е сутки течения инфаркта миокарда. Активность фVIII достоверно увеличивалась в подгруппе пациентов с нарастающей ГГЦ (160,8±76,5 % против 93,1±71,6 %, р=0,00003 в парном тесте). В то же время у этих больных практически не изменялась активность антитромбина (100,1±11,3 % против 99,1±13,2%, р=0,7). Напротив, в подгруппе, где уровень ГЦ снижался, к 14 суткам течения ОИМ активность антитромбина достоверно увеличивалась (103,6± 13,8% против 97,5 ±17,8%, р=0,04).

У обследованных больных как при ИБС, так и при венозной патологии наличие ГГЦ было ассоциировано с повышенным содержанием Д-димеров (рис.11).

* - р < 0,05

Рис. 11. Частота встречаемости высокого уровня Д-димеров

(>2000 нг/мл) у больных с сосудистой патологией.

У больных множественной миеломой при ГГЦ также отмечался достоверно повышенный уровень Д-димеров (рис 12).

Рис. 12. Частота встречаемости высокого уровня Д-димера у больных множественной миеломой при наличии и в отсутствии ГГЦ.

Ряд других показателей гемостаза у пациентов с ММ также свидетельствовал о наличии более выраженного гиперкоагуляционного синдрома у лиц с повышенным уровнем ГЦ. Так, только в группе больных с ГГЦ отличие АПТВ от нормальных значений достигало статистической значимости. В этой же группе прослеживалась тенденция к более высоким показателям активности факторов VIII и Виллебранда (табл. 7).

Таблица 7.

Показатели гемостаза у пациентов с множественной миеломой

при наличии и в отсутствии ГГЦ (М±SD)

Показатель	Норма	Пациенты с ММ
Повышенный уровень ГЦ	Нормальный уровень ГЦ
АПТВ (индекс)	1,0±0,1	0,8±0,1*	0,9±0,1
Активность фVIII, %	119±30,5	244,4±90,3*	220,1±108,6*
Активность фВ, %	99,5±21,7	189,7±102,4*	179,7±67,8*
Протромбиновый тест, %	93,7±5,7	99,9±14,6	93,4±20,9
Фибриноген, г/л	2,8±0,7	4,1±1,3*	4,1±1,2*
Активность АТ, %	95,0±14,0	99,1±15,5	98,0±19,1
ХЗЛЭФ, с	366,7±124,8	533,6±424,2	537,8±373,5

* - достоверное различие с нормой, р £ 0,05

Изменения показателей гемостаза, отмеченные в ходе проведения у больных ААНК метионинового нагрузочного теста (МНТ), который в данном контексте можно рассматривать как экспериментальную модель по созданию транзиторной ГГЦ, полностью подтвердили прокоагулянтный и проагрегантный потенциал ГЦ.

Была выявлена корреляция между уровнем ГЦ и числом дискоэхиноцитов (r=0,9, p=0,03), суммой активных форм тромбоцитов (r=0,6, p=0,03) и числом крупных тромбоцитарных агрегатов (r=0,6, p=0,04), а также между постнагрузочным уровнем ГЦ и активностью фактора Виллебранда (r=0,7, p=0,03). Значимая корреляционная связь между постнагрузочным уровнем ГЦ и временем ХЗЛЭФ (r=0,7, p=0,004) подтвердила угнетающее действие ГЦ на фибринолитическую активность крови. В ходе проведения МНТ было установлено еще два важных момента. Во-первых, на фоне транзиторного повышения уровня ГЦ у пациентов со скрытой ГГЦ в отличие от пациентов без ГГЦ отмечалось нарастание активности факторов VIII и Виллебранда, а также замедление ХЗЛЭФ. Во-вторых, исходно баланс системы гемостаза у пациентов с нарушенным обменом ГЦ был в большей степени смещен в сторону гиперкоагуляции в сравнении с пациентами без ГГЦ. Полученные данные свидетельствуют об участии в индукции протромботических изменений не только явной, но и скрытой ГГЦ.

Существенным доказательством роли ГГЦ в формировании прокоагулянтных изменений, являются результаты исследования системы гемостаза у лиц контрольной группы с повышенным уровнем ГЦ (табл. 8).

Таблица 8.

Показатели гемостаза у асимптомных носителей ГГЦ (М±SD)

Показатель	Норма	Носители ГГЦ (n=23)
Активные формы тромбоцитов, %	19,5±5,4	28,8±4,9*
Кол-во тромбоцитов в агрегатах, %	6,7±2,1	9,9±2,1*
Активность фактора VIII, %	119±30,5	143,4±34,9*
Активность фактора Виллебранда, %	99,5±21,7	131,9±36,6*
Концентрация фибриногена, г/л	2,8±0,7	3,6±0,6*
Активность антитромбина, %	95,0±14,0	79,5±10,7*
ХЗЛЭФ, с	366,7±124,8	318,6±146,2

* - достоверное различие с нормой, р £ 0,05

Показатели внутрисосудистой активации тромбоцитов (сумма активных форм тромбоцитов и количество тромбоцитов в агрегатах), концентрация фибриногена, активность факторов VIII и Виллебранда у асимптомных носителей ГГЦ не превышали пределов нормальных колебаний, однако были достоверно выше, чем у здоровых доноров. В то же время активность антитромбина у лиц с ГГЦ была достоверно ниже нормы. Подчеркнем, что в рассматриваемой группе не было индивидов с другими формами тромбофилии.

В рамках данного исследования принципиальным для нас являлся поиск наиболее неблагоприятных с точки зрения риска развития и тяжести течения ССЗ сочетаний ГГЦ с другими факторами риска (наследственными и/или приобретенными). Расчетные величины риска тромбообразования при сочетании ГГЦ и мутации фактора V Лейден многократно превысили соответствующие показатели для изолированного носительства указанных факторов. Согласно полученным данным риск развития венозного тромбоза при сочетании ГГЦ и мутации фактора V увеличивается в 41 раз (p<0,0001), а при сочетании ГГЦ и мутации в гене протромбина - в 18 раз (p<0,0001). Сочетание ГГЦ с мутацией фактора V чаще отмечалось у пациентов мужского пола (12% против 6% у женщин). У носителей мутации Лейден при наличии ГГЦ тромбоз манифестировал в среднем на 15 лет раньше, чем при ее отсутствии: в 31,2 ± 12 года против 47,9±15,1 лет. Протромботический потенциал мутации G20210A в гене протромбина при наличии ГГЦ также фенотипически проявлялся в более раннем возрасте – в 35,0±20,3 лет против 45,7±19,2 лет без ГГЦ. Показательно, что у так называемых «двойных гетерозигот» по мутациям в генах факторов II и V в отсутствии классических провоцирующих факторов манифестация тромбоза имела место в возрасте 20,0 ± 10,6 лет при наличии ГГЦ, а без ГГЦ – в 42,4±6,8 года.

Следует подчеркнуть, что если взаимодействие ГГЦ с мутациями фактора V Лейден и G20210A в гене протромбина описано в литературе, пусть и с противоречивыми результатами, то возможное влияние повышенного уровня ГЦ на фенотипическую экспрессию других молекулярных маркеров тромбофилии ранее не изучалось. Поскольку основные патологические эффекты ГГЦ опосредуются через эндотелиальную дисфункцию, особый интерес представляло распределение у больных с ГГЦ аллельных вариантов генов, кодирующих компоненты ренин-ангиотензиновой системы (РАС), аполипопротеина Е (АроЕ) и эндотелиальной синтазы окида азота (eNOS).

У больных с ГГЦ как при артериальных, так и при венозных тромбозах наблюдалось снижение частоты встречаемости генотипов “Е2/Е2” и “Е2/Е3” и, напротив, увеличение частоты аллеля “Е4” гена аполипопротеина Е (ApoE). Различие в частоте встречаемости генотипа “АроЕ Е3/Е4” между больными с ВТ и контролем при наличии ГГЦ достигало пределов статистической значимости (30% против 17,5%, p<0,05).

У больных ИБС и ААНК при наличии ГГЦ прослеживалась отчетливая тенденция к снижению частоты носительства С/C генотипа гена ATGR. У больных ААНК при ГГЦ выявлено двукратное снижение частоты встречаемости генотипа D/D гена ACE в сравнении с контролем и больными без ГГЦ. Возможно, наблюдаемый феномен связан с неблагоприятной прогностической ролью сочетания данного генотипа и ГГЦ. У больных с ВТ ГГЦ была ассоциирована с повышенной частотой носительства генотипов I/I в гене t-PA, 4G/4G в гене PAI-1 и D/D в гене ACE, предрасполагающих к снижению фибринолитической активности.

В группах пациентов с ВТ, ИБС и ААНК у лиц с ГГЦ достоверно чаще, чем при нормальном уровне ГЦ, выявлялся генотип “−786 СС” гена eNOS (рис 13). Снижение активности eNOS у носителей варианта “−786C” может препятствовать защите сосудистой стенки от избытка ГЦ посредством формирования нитрозотиолов, а также действовать синергично с ГГЦ в развитии оксидантного стресса. При относительном дефиците NO избыток ГЦ шунтируется на путь формирования ГЦ-тиолактона – наиболее токсичного производного ГЦ.

Рис 13. Частота встречаемости генотипа “−786СС” эндотелиальной синтазы оксида азота у больных с и без ГГЦ.

У пациентов с ИБС и ААНК полиморфизм генов, опосредующих активацию тромбоцитарных рецепторов, был ассоциирован с повышенным уровнем ГЦ. Так, у больных ААНК с ГГЦ гомозиготное носительство аллеля 434Т гена GpIbα отмечалось в 2 раза, а гетерозиготное - более чем в 3 раза чаще, чем при нормальном уровне ГЦ. Носительство генотипа 807ТТ гена GpIa при ГГЦ выявлено в 2,2 раза чаще. У больных с ГГЦ доля гетерозиготных носителей гаплотипа Н2 гена рецептора АДФ (P2Y12) в 2 раза превышала таковую у индивидов с нормальным уровнем ГЦ, а гомозиготных – более чем в 3 раза (рис.14).

Рис 14. Распределение генотипов тромбоцитарных рецепторов у больных атеросклерозом артерий нижних конечностей.

Установленные ассоциативные связи логично вписываются в известную схему различий патогенеза артериального и венозного тромбоза.

Анализ частоты встречаемости ГГЦ у пациентов с антифосфолипидным синдромом (АФС) представлял особый интерес вследствие сходства их клинических проявлений – рецидивирующие артериальные и венозные тромбозы, нарушение репродуктивной функции. Кроме того, АФС является аутоиммунной патологией, а избыток ГЦ вызывает появление в организме модифицированных белков, потенциально являющихся аутоантигенами. Волчаночный антикоагулянт был выявлен у 5% (12 из 247) больных с ВТ в анамнезе, при этом у 3-х из них (25%) диагностирован повышенный уровень ГЦ. Подобное сочетание приводило к развитию крайне тяжелых клинических проявлений тромбоза. Иммунологическая диагностика АФС была проведена у 81 пациента с ИБС (43 больных с острым инфарктом миокарда и 38 больных с постинфарктным кардиосклерозом). Повышенный титр антител к β2GPI (>10 нг/мл) был выявлен у%) больных с острым инфарктом миокарда и у 9 (24%) больных с постинфарктным кардиосклерозом. У больных с ОИМ выявлялась значимая корреляционная связь между уровнем ГЦ плазмы и титром антикардиолипиновых антител класса G (r=0,6, p=0,001 на 2-е сутки и r=0,9, p=0,0001 на 14 сутки). Корреляционный анализ выявил также связь между носительством антител к β2GPI (а-β2GPI) и уровнем гомоцистеина плазмы (r=0,8, p=0,001 на 2-е и r=0,96, p=0,0001 на 14-е сутки течения ОИМ). Волчаночный антикоагулянт не был выявлен ни у одного из пациентов, что позволяет предположить наличие низкоаффинных антител к b2GPI у обследованных больных. Сочетание ГГЦ с носительством а-β2GPI повышало протромботический потенциал: отмечалась достоверно более высокая активность фактора VIII, тенденция к более выраженной гиперфибриногенемии, снижению активности антитромбина, содержания плазминогена, а также замедлению лизиса эуглобулиновой фракции (табл. 9).

Таблица 9.

Показатели системы гемостаза у пациентов с острым инфарктом миокарда и ГГЦ в зависимости от титра антител к β2GPI (М±SD)

Показатель	Норма	Сутки измерения	а-β2GPI > 10 нг/мл n=9	а-β2GPI< 10 нг/мл n=15
АПТВ (индекс)	1,0±0,1	2-е	1,2±0,6*	1,4±0,5*
14-е	0,9±0,5	1,1±0,2*
Активность фактора VIII, %	119±30,5	2-е	212,8±74,2* **	127,4±71,8
14-е	234,7±88,4* **	145,4±41,5
Активность фактора Виллебранда, %	99,5±21,7	2-е	204,7±73,4*	188,8±89,2*
14-е	188,3±29,8*	172,8±32,8*
ПТ,%	93,7±5,7	2-е	101,5±15,9*	86,8±30,1*
14-е	102,1±10,6*	90,8±23,2*
Концентрация фибриногена, г/л	2,8±0,7	2-е	4,0±0,9*	3,8±0,8*
14-е	4,5±1,1*	3,9±1,1*
Активность антитромбина, %	95,0±14,0	2-е	87,2±35,8	95,6±11,2
14-е	104,8±15,8	106,2±14,1
Хагеман-зависимый лизис эуглобулиновой фракции, с	366,7±124,8	2-е	989,4±460,5*	718,3±488,0 *
14-е	813,8±450,0*	761,7±589,2*
Содержание плазминогена, %	92,2±17,2	2-е	85,3±22,5	93,7±18,6
14-е	107,6±19,4*	125,3±26,8*

* - достоверное различие с нормой, р £ 0,05