Исследование генотоксического действия импульсных электромагнитных излучений с большой пиковой мощностью (стр. 2 )

Щелочной вариант комета-теста.

Для оценки повреждений ДНК в клетках использовали щелочной вариант комета-теста с некоторыми модификациями. Метод основан на анализе картины электрофореза индивидуальных клеток, ДНК которых окрашена флуоресцентным красителем. Свое название метод получил из-за визуального сходства получаемых электрофореграмм с кометами: имеется яркая флуоресцирующая "голова кометы" и "хвост", образующийся в результате миграции поврежденных или расплетенных участков ДНК после электрофореза в геле агарозы. Для анализа готовили 3-х слойные препараты. Слой легкоплавкой агарозы с клетками помешали между двумя слоями 0.5% легкоплавкой агарозы. Затем препараты помещали в лизирующий раствор (2.5 М NaCl, 10 мМ Tris-HCl, 1% Triton X-100 (для образцов из крови человека и мыши дополнительно добавляли 1% N-lauryl-sarcosine), 100 мМ ЭДТА; pH=10.0) на 25 мин при 22оС (эритроциты лягушки) или при 37оС (образцы крови человека и мыши) в темноте. Далее препараты выдерживали в щелочном растворе (0.3 М NaOH, 1 мМ ЭДТА; pH>13.0) в течение 20 мин при 4оС в темноте. Электрофорез проводили при 4оС в течение 20 мин при напряженности электрического поля 3.2 В/см (эритроциты лягушки), 2.4 В/см (образцы крови человека) или 3.1 В/см (образцы крови мыши). Препараты окрашивали бромистым этидием (1 мкг/мл в ФБ) в течение 1 ч при 20-22оС в темноте. Все процедуры проводили при искусственном освещении с использованием ламп накаливания во избежание возникновения дополнительных повреждений ДНК в клетках [Speit et al., 1999].

Анализ препаратов.

Препараты исследовали под модифицированным световым микроскопом "Biolam" (LOMO, Россия) с люминесцентной насадкой. Для возбуждения флуоресценции использовали суперяркий светодиод с максимумом эмиссии 505 нм. Для захвата изображений нуклеоидов использовалась цифровая телекамера LCL-902HS высокой чувствительности (0.001 Lux) и разрешения 768´494 pixels. Для регистрации и анализа изображений нуклеоидов использовали программное обеспечение, разработанное в лаборатории Регуляции в биомедицинских системах ИБК РАН. Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами "слепого" контроля, с применением рандомизации при выборе биологических образцов для анализа. Уровень повреждений ДНК в клетках оценивали по процентному содержанию ДНК в хвосте кометы. В каждом независимом эксперименте для каждого образца (отрицательный и положительный контроли, температурное воздействие, облучение ИЭМИ, обработка ЭМС) фотометрировали 3-5 препаратов. На каждом слайде регистрировали и обрабатывали по 25 изображений комет. Затем для каждого образца по 75 изображениям рассчитывался средний процент ДНК в хвосте кометы. Средние значения и стандартные ошибки среднего для каждой серии экспериментов вычислялись по результатам повторных, независимых экспериментов (n>5). Статистический анализ данных проводили по непараметрическому критерию Манна-Уитней (p<0.05).

Облучение водного раствора ИЭМИ КВЧ БПМ.

Образцы (2 мл) 1 мМ фосфатного буфера (бидистиллированная вода (4 мкСи); Na2HPO4 • 7H2O; NaH2PO4 • H2O; рН 6.8) облучали в чашках Петри в течение 2.5, 5 и 10 мин с использованием пирамидальной рупорной антенны с апертурой 34´27 мм при длительностях импульсов ИЭМИ КВЧ БПМ 100, 200, 400 или 800 нс и частотах следования импульсов 500 или 1000 Гц. Толщина слоя облучаемого образца составляла около 2 мм. При длительности импульса ИЭМИ КВЧ 400 нс и частоте следования импульсов 500 Гц средняя плотность потока мощности (ППМ) на выходе излучателя, согласно расчетам, составляла около 0.4 Вт/см2. Облучение образцов проводили в нескольких вариантах (Рис.1): а) в чашках Петри непосредственно на излучающем торце антенны; б) в бакпечатках через 15-мм слой желатина и силиконовую прокладку толщиной 5 мм на пленке "Парафилм" с обеспечением надежного акустического контакта с помощью геля для УЗИ; в) в бакпечатках через 15-мм слой желатина на пленке "Парафилм" с воздушной прослойкой между желатином и образцом (без акустического контакта между образцом и желатином). Имитацию воздействия проводили по схеме, представленной на Рис.1г, экранируя чашку Петри с образцом от воздействия ИЭМИ КВЧ 15-мм слоем дистиллированной воды, помещенной в пластиковую чашку Петри диаметром 65 мм. Контрольные образцы не подвергались облучению и содержались в чашках Петри при комнатной температуре (21±1оС) в течение соответствующего времени облучения. Для определения кинетики изменения температуры фосфатного буфера при облучении проводили измерения температуры буфера через каждые 15 с в течение 10 мин воздействия ИЭМИ КВЧ БПМ (400 нс, 500 Гц или 200 нс, 1000 Гц) с помощью стеклянного микротермистора с точностью ±0.05оС.

Рис.1. Схемы облучения образцов ИЭМИ КВЧ БПМ и имитации воздействия.

1 – пирамидальная рупорная антенна; 2 – образец в чашке Петри диаметром 35 мм; 3 – слой 20% желатина толщиной 15 мм в бакпечатке; 4 – силиконовая прокладка толщиной 5 мм; 5 – образец на пленке "Парафилм"; 6 – чашка Петри диаметром 65 мм с водой.

Термостатирование.

Учитывая увеличение температуры буфера при облучении ИЭМИ КВЧ БПМ, в отдельной серии экспериментов исследовали влияние тепла на образование АФК (в эквиваленте [Н2О2]). Для этого образцы (2 мл) фосфатного буфера в чашках Петри диаметром 35 мм содержали в термостате при 49.0±0.5оС (имитация нагрева буфера при облучении) в течение 5–25 мин. Для определения кинетики изменения температуры фос-фатного буфера при термостатировании при 49.0±0.5оС проводили измерения температу-ры в образцах каждые 0.5–1 мин в течение 1 ч с помощью стеклянного микротермистора.

Насыщение фосфатного буфера азотом проводили путем 30-мин барбатирования при комнатной температуре под воздухонепроницаемым куполом в соответствии с методикой [Bruskov et al., 2002]. Концентрация кислорода в растворах измерялась с помощью электрода Кларка.

Оценку количества образовавшихся АФК проводили в эквиваленте [Н2О2], поскольку известно, что перекись водорода является конечным продуктом восстановления кислорода и характеризуется длительным по сравнению с другими формами АФК периодом полураспада (около 4 ч). Для количественного определения Н2О2 использовали высокочувствительный метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол–парайодфенол-пероксидаза, регистрацию проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике Бета-1 [Bruskov et al., 2002]. Непосредственно перед измерением в каждый образец вносили 150 мкл "счетного раствора" (0.5 М Трис-HСl буфер, рН 8.5, 10 мкМ 4-йодфенола, 10 мкМ люминола и пероксидаза). В каждом эксперименте проводили измерения [Н2О2] в трех образцах с последующим расчетом средней концентрации и величины стандартной ошибки. Процедура калибровки счетчика в диапазоне наномолярных концентраций перекиси водорода проводилась по [Bruskov et al., 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ и ИЭМИ КВЧ БПМ на ДНК различных типов клеток in vitro.

1.1. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ на ДНК эритроцитов лягушки.

В литературе отсутствуют данные, полученные методом "комета-тест" на эритроцитах X. laevis при оценке повреждающего действия различных генотоксических факторов. Поэтому, чтобы показать адекватность наших экспериментальных условий при обнаружении известных генотоксических агентов, в отдельной серии экспериментов на эритроцитах X. laevis мы оценили генотоксическое действие различных доз ионизирующего излучения (0, 50, 100 и 200 сГр, g-излучение) и алкилирующего агента ЭМС (5 мМ). Мы показали, что после облучения эритроцитов лягушки в дозе 50 сГр уровень повреждения ДНК увеличивается более чем в 3 раза по сравнению с уровнем повреждения ДНК в соответствующем контроле (p<0.05). Дозы 100 и 200 сГр вызывали еще больший уровень повреждений ДНК в клетках, который линейно возрастал с увеличением дозы (Рис.2). После 40-мин инкубации эритроцитов при 20оС в присутствии ЭМС содержание ДНК в хвосте кометы увеличилось почти в 4 раза (p<0.05) от 1.2±0.2% при 0 мМ ЭМС до 4.6±0.9% при 5 мМ ЭМС (Рис.2). Таким образом, мы показали, что "комета-тест" в наших экспериментальных условиях позволяет регистрировать достоверное увеличение уровня повреждений ДНК в эритроцитах лягушки после облучения g-излучением и обработки ЭМС in vitro в концентрации 5 мМ.

Рис.2. Процентное содержание ДНК в хвосте кометы в эритроцитах лягушки после действия различных доз g-излучения и обработки ЭМС (5 мМ). * - p<0.05, ** - p<0.01, n=8.

При облучении эритроцитов лягушки ИЭМИ СВЧ температура внутри волновода составляла 29±1oC. Следует отметить, что нормальная физиологическая температура для лягушек Xenopus laevis близка к 20±1oC. Согласно существующим данным, нагрев индуцирует образование в растворах АФК, которые, взаимодействуя с ДНК, могут приводить к образованию 8-оксогуанина, биомаркера повреждений ДНК, разрывам цепей ДНК, гидролизу гликозильных связей и дезаминированию цитозина [Bruskov et al., 2002; Lindahl, 1993]. Поэтому в отдельной серии экспериментов мы исследовали влияние различных температур (20, 25 и 30oC; 40 мин) инкубации клеточной суспензии на целостность ДНК в эритроцитах лягушки. Результаты показали увеличение повреждений ДНК в эритроцитах с увеличением температуры инкубации (Рис.3). Повреждения ДНК, вызванные инкубацией клеток в течение 40 мин при 30oC, были достоверно выше по сравнению с инкубацией при 20oC (p<0.003) и 25oC (p<0.02).

С учетом этих данных, имитацию облучения мы проводили при температуре 29±1oC. Затем мы сопоставляли данные по инкубации клеток при 30oC, имитации и облучению ИЭМИ СВЧ (Рис.3).

Рис.3. Процентное содержание ДНК в хвосте кометы после температурного воздействия, имитации облучения и ИЭМИ СВЧ облучения эритроцитов лягушки в течении 40 мин. * - р<0.05, n=15.

Из Рис.3 видно, что имитация облучения и облучение эритроцитов ИЭМИ СВЧ вызывают одинаковый уровень повреждений ДНК (P>0.99). В тоже время уровень повреждения ДНК при имитации облучения и облучении ИЭМИ СВЧ достоверно выше уровня повреждения ДНК после инкубации клеток при температурах 25оС (p<0.05) и 20oC (p<0.02).

Таким образом, полученные нами результаты позволяют заключить, что ИЭМИ СВЧ при выбранном режиме воздействия не оказывает прямых генотоксических эффектов на ДНК эритроцитов лягушки in vitro. Увеличение поврежденности ДНК в клетках при действии ИЭМИ СВЧ, представленное на Рис.3, обусловлено увеличением температуры суспензии облучаемых клеток на 3.5±0.1oC, что подтверждено в экспериментах по имитации облучения и в экспериментах с инкубацией клеток в течение 40 мин в соответствующих температурных условиях [Chemeris et al., 2004]. В условиях такого повышения температуры увеличение уровня повреждения ДНК может быть связано с ростом скорости депуринизации / депиримидинизации ДНК в физиологических условиях.

1.2. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ на ДНК лейкоцитов и лимфоцитов крови человека.

Учитывая тот факт, что при облучении клеточной суспензии ИЭМИ СВЧ происходит ее нагрев на 3.5±0.1оС, мы исследовали влияние различных температур инкубации на возникновение повреждений ДНК в лейкоцитах цельной крови и изолированных лимфоцитах крови человека. Было обнаружено, что инкубация клеток в течение 40 мин при температурах 23, 27, 33 и 37оС не влияет на уровень поврежденности ДНК в исследованных клетках. Облучение клеток ИЭМИ СВЧ в течение 40 мин также не вызывало дополнительных повреждений ДНК по сравнению с отрицательным и имитационным контролями (Табл.1).

Таблица 1. Процентное содержание ДНК в хвосте кометы в лейкоцитах и изолированных лимфоцитах крови человека после 40-мин инкубации при различных температурах, облучения ИЭМИ СВЧ, обработки ЭМС и действия ионизирующего излучения и в лейкоцитах цельной крови человека, инкубированных при различных температурах, облученных ИЭМИ СВЧ или обработанных ЭМС в течение 40 мин и затем дополнительно инкубированных в течение 30 мин при 37оС. * - р<0.01.

Условия воздействия	Лейкоциты цельной крови (n=18)	Изолированные лимфоциты (n=10)	Лейкоциты цельной крови (с дополнительной инкубацией) (n=8)
23oC	1.20 ± 0.20	0.47 ± 0.06	0.94 ± 0.15
Облучение ИЭМИ СВЧ	1.26 ± 0.26	0.38 ± 0.05	0.84 ± 0.10
27oC	1.30 ± 0.14	0.45 ± 0.05	0.91 ± 0.16
37oC	1.24 ± 0.18	0.43 ± 0.09	0.88 ± 0.15
ЭМС 5 мМ	6.8 ± 0.4*	5.5 ± 0.6*	16.0 ± 1.0*
2.74 Гр	3.7 ± 0.5*	6.2 ± 1.0*	-

После облучения лейкоцитов цельной крови ИЭМИ СВЧ процентное содержание ДНК в хвосте кометы составило 1.26±0.26%, что достоверно не отличалось от процентного содержания ДНК в хвосте кометы после инкубации клеток при различных температурах (P>0.86). После облучения изолированных лимфоцитов ИЭМИ СВЧ процентное содержание ДНК в хвосте кометы составило 0.38±0.05%, что также достоверно не отличалось от процентного содержания ДНК в хвосте кометы после инкубации клеток при различных температурах (P>0.31). Напротив, инкубация клеток в течение 40 мин при 37оС в присутствии ЭМС (первый положительный контроль) в концентрации 5 мМ приводила к существенному достоверному увеличению уровня поврежденности ДНК, который более чем в 5 раз превышал уровень поврежденности в соответствующем контроле. Ионизирующее излучение (второй положительный контроль) в дозе 2.74 Гр также приводило к достоверному увеличению уровня повреждений ДНК в клетках (Табл.1).

Ранее было показано, что дополнительная инкубация лимфоидных клеток при 37оС после окончания воздействия электромагнитного излучения позволяла выявить физиологические изменения структуры хроматина, возникающие в результате работы ферментных систем [Гапеев и др., 2003]. Поэтому в специальной серии экспериментов лейкоциты цельной крови после 40-мин облучения ИЭМИ СВЧ дополнительно инкубировали в течение 30 мин при 37оС. Было обнаружено, что дополнительная инкубация лейкоцитов в течение 30 мин при 37оС приводит к снижению уровня повреждений ДНК, однако достоверных различий в содержании ДНК в хвосте кометы в лейкоцитах, инкубированных при различных температурах и облученных ИЭМИ СВЧ, не наблюдается (Табл.1). Процентное содержание ДНК в хвосте кометы уменьшается с 1.26±0.26% (без дополнительной инкубации) до 0.84±0.10% (с дополнительной инкубацией), но недостоверно (P>0.3). В то время как ЭМС в концентрации 5 мМ вызывает существенное увеличение поврежденности ДНК в лейкоцитах, которая возрастает при дополнительной инкубации более чем в 2 раза (Табл.1). Таким образом, дополнительная инкубация образцов крови в течение 30 мин при 37оС после окончания облучения не приводила к проявлению повреждающего действия ИЭМИ СВЧ.

Полученные нами результаты позволяют заключить, что ИЭМИ СВЧ при выбранном режиме воздействия не оказывает прямого генотоксического действия на ДНК нативных лейкоцитов цельной крови и изолированных лимфоцитов крови человека [Chemeris et al., 2006]. Это может быть обусловлено либо отсутствием прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ, либо высокой эффективностью репарационных систем, которые успевают отрепарировать возможно возникающие при действии ИЭМИ БПМ повреждения ДНК.

1.3. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ КВЧ БПМ на ДНК лейкоцитов цельной крови мыши.

Возможное повреждающее действие ИЭМИ КВЧ БПМ было исследовано методом комета-тест на лейкоцитах крови мыши in vitro. Исследование проводили при различных температурах: 0оС – облучение на льду, чтобы исключить возможность влияния ферментов репарации, +4оС и +23оС (точность поддержания температуры ±1оС). Показано, что с повышением температуры при облучении лейкоцитов мыши ИЭМИ КВЧ с 0 до 23оС достоверно увеличивается уровень повреждений ДНК в контрольных образцах с 0.85±0.07 до 1.61±0.23 % (p<0.05). Облучение лейкоцитов крови мыши ИЭМИ КВЧ не вызывает возникновения дополнительных повреждений в облученных клетках по сравнению с контролем (Рис.4). Напротив, облучение крови мыши γ-излучением в дозе 4 Гр приводит к существенному достоверному увеличению уровня повреждений ДНК, который в 10 раз превышает уровень повреждений ДНК в соответствующем контроле.