Исследование генотоксического действия импульсных электромагнитных излучений с большой пиковой мощностью (стр. 3 )

Рис.4. Изменение процентного содержания ДНК в хвосте кометы в лейкоцитах цельной крови мыши после действия g-излучения и 20-мин облучения ИЭМИ КВЧ при различных температурах. ** - p<0.01, n=5.

Полученные нами результаты позволяют заключить, что ИЭМИ КВЧ БПМ при выбранном режиме воздействия (37 ГГц, длительность импульса 60 нс, импульсная мощность 20 кВт, частота следования импульсов 50 Гц, средняя мощность 60 мВт) не оказывает прямого генотоксического действия на ДНК нативных лейкоцитов цельной крови мыши [Гудкова и др., 2004]. Можно было предположить, что ИЭМИ КВЧ способно оказывать не прямое, а опосредованное генотоксическое действие, например, при участии АФК, которые, как известно, могут индуцировать повреждения ДНК напрямую и/или в результате влияния на активность ферментных систем [McName et al., 2000; Petersen et al., 2000; Тронов и Константинов, 2000]. В связи с этим особый интерес представляет исследование механизмов действия ИЭМИ БПМ, опосредованных свободно-радикальными процессами.

Глава 2. Оценка возможности повреждения ДНК активными формами кислорода, образующимися под действием ИЭМИ КВЧ БПМ.

2.1. Определение продукции АФК в водных растворах под действием ИЭМИ КВЧ БПМ.

Методом усиленной хемилюминесценции мы обнаружили, что облучение 1 мМ фосфатного буфера ИЭМИ КВЧ БПМ (37 ГГц, 20 кВт, 400 нс, 500 Гц) приводит к образованию в нем Н2О2, количество которой линейно зависит от времени экспозиции (Рис.5). Необходимо отметить, что скорость образования Н2О2 при фиксированных параметрах ИЭМИ КВЧ (400 нс, 500 Гц) сохраняется постоянной 0.7±0.2 нМ/мин.

Рис.5. Зависимость образования Н2О2 от времени экспозиции ИЭМИ КВЧ БПМ (400 нс, 500 Гц).

Исследование образования Н2О2 при различных параметрах ИЭМИ КВЧ БПМ показало сложный характер зависимости, демонстрирующий отсутствие образования перекиси водорода при длительностях импульсов 100 и 200 нс и увеличение скорости образования Н2О2 с увеличением ППМ излучения (Рис.6). Это прямо показано в экспериментах, проведенных при равной энергетической нагрузке (0.4 Вт/см2) с 5 мин экспозицией: при длительности импульсов 400 нс и частоте следования импульсов 500 Гц образовалось 3.3±0.8 нМ Н2О2, а при 200 нс и 1000 Гц – -0.3±1.0 нМ.

Рис.6. Зависимость скорости образования D[H2O2] при облучении ИЭМИ КВЧ БПМ от длительности импульсов при фиксированной частоте следования импульсов 500 Гц.

Факт отсутствия образования Н2О2 при коротких длительностях импульсов ИЭМИ КВЧ БПМ заслуживает отдельного особого внимания и дополнительных исследований с использованием генераторов ИЭМИ КВЧ БПМ, способных обеспечить плавное изменение длительности импульсов и достаточно большое время экспозиции образцов.

2.2. Исследование механизмов образования АФК в водных растворах при облучении ИЭМИ КВЧ БПМ

В результате определения кинетики нагрева фосфатного буфера при облучении ИЭМИ КВЧ БПМ с одинаковой ППМ излучения (0.4 Вт/см2 при 400 нс и 500 Гц или 200 нс и 1000 Гц) были получены близкие значения параметров кинетических кривых. Усредненные данные представлены на Рис.7а(1). Кинетика температуры буфера при облучении ИЭМИ КВЧ хорошо аппроксимируется экспоненциальной зависимостью с постоянной времени 3.24±0.03 мин, а уровень нагрева буфера через 10 мин облучения составляет 46.7±0.2оС.

Для исследования роли тепла в образовании АФК под действием ИЭМИ КВЧ БПМ мы создавали аналогичные условия нагрева образцов, помещая их в твердотельный термостат при температуре 49.0±0.5оС. В таких условиях кинетика нагрева буфера также хорошо аппроксимируется экспоненциальной зависимостью с постоянной времени 4.46±0.04 мин и за 10 мин образец нагревается до 46.1±0.2оС, что сравнимо с уровнем нагрева за 10 мин облучения ИЭМИ КВЧ (Рис.7а(2)). В результате определения количества образовавшейся перекиси в течение 25 мин нагрева образцов в термостате была получена характерная зависимость образования H2O2 от времени нагрева (Рис.7б). Измерения показали, что за 10 мин нагрева буфера в термостате при уровне нагрева, сравнимом с таковым при облучении образцов ИЭМИ КВЧ, в растворе образуется 0.8±0.1 нМ перекиси водорода.

Рис.7. а) Кинетика нагрева фосфатного буфера при (1) облучении ИЭМИ КВЧ БПМ (400 нс и 500 Гц или 200 нс и 1000 Гц) и (2) термостатировании при Т=49.0±0.5оС;

б) Зависимость образования Н2О2 от времени нагрева образцов фосфатного буфера в термостате при 49.0±0.5оС.

Таким образом, нагрев, сопровождающий воздействие ИЭМИ КВЧ БПМ, вносит незначительный вклад в образование Н2О2 в процессе облучения (0.8±0.1 нМ по сравнению с 6.8±0.9 нМ). Следовательно, в образовании Н2О2 в растворе при облучении ИЭМИ КВЧ БПМ принимают участие дополнительные механизмы.

Для проверки предположения об образовании Н2О2 под действием акустических колебаний, возбуждаемых в растворе ИЭМИ КВЧ БПМ [Андреев и др., 2001], мы провели специальную серию экспериментов при облучении буфера через слой 20% желатина, плотно прилегающий к фосфатному буферу. ИЭМИ КВЧ БПМ не проникает через слой желатина толщиной 15 мм, но в результате быстрого нагрева нижнего пограничного слоя желатина, т. е. кратковременного термоупругого расширения и затем сжатия, возбуждает в нем акустические импульсы, распространяющиеся через желатин и дальше в буфер. Слой желатина с силиконовой прокладкой препятствуют также распространению тепла, появляющегося в результате поглощения ИЭМИ КВЧ в желатине, в образец фосфатного буфера. Если между слоями желатина и буфера нет акустического контакта (воздушная прослойка), то возбуждаемые ИЭМИ КВЧ акустические колебания не проникают в буфер и затухают в слое желатина. Результаты измерений образования Н2О2, полученные в этих экспериментах, представлены в Табл. 2.

Таблица 2. Образование Н2О2 при различных условиях воздействия в течение 10 мин.

Условия воздействия	D[Н2О2], нМ
Контроль	0.0±0.5
Имитация облучения (экранирование образцов от ИЭМИ КВЧ)	0.1±0.1
Облучение ИЭМИ КВЧ БПМ (400 нс, 500 Гц)	6.8±0.9
Облучение через слой желатина	5.1±0.8
Облучение через слой желатина без акустического контакта	-0.6±0.4
Термостатирование при 49.0±0.5оС (имитация нагрева при облучении)	0.8±0.1
Облучение в герметичных условиях	6.8±0.1
Облучение после дополнительного насыщения азотом	4.0±0.3
Облучение в присутствии 1 мМ гуанозина	3.1±0.4

Облучение через слой желатина приводит к образованию в буфере Н2О2 только при наличии надежного акустического контакта между облучаемым желатином и буфером. Таким образом, можно заключить, что образование Н2О2 в облучаемом ИЭМИ КВЧ БПМ растворе происходит в результате суммарного влияния тепла и возбуждаемых ИЭМИ КВЧ БПМ термоакустических колебаний.

Считается, что образование Н2О2 в водных растворах может являться результатом активации растворенного в воде атмосферного кислорода, и в этом случае на продукцию Н2О2 прямое влияние оказывает концентрация растворенного O2 (наличие "кислородного эффекта") [Брусков и др., 2001, 2002; Bruskov et al., 2002]. В связи с этим необходимо было выяснить, изменяется ли [O2] в растворе в процессе облучения. Измерение [O2] до и после 10-мин облучения ИЭМИ КВЧ БПМ (400 нс, 500 Гц) показало отсутствие изменения количества кислорода в буфере: 0.33±0.01 мМ и 0.32±0.01 мМ соответственно. При облучении буфера в герметичных условиях под пленкой, препятствующей доступу атмосферного кислорода в буфер из окружающего воздуха, Н2О2 образовывалось столько же, сколько и при облучении в отсутствии воздухонепроницаемой пленки (Табл.2). Однако при дополнительном насыщении облучаемого буфера азотом продукция Н2О2 уменьшалась в 1.7 раза, а при добавлении в облучаемый буфер 1 мМ гуанозина (перехватчика синглетного кислорода [Halliwell et al., 1998]) – уменьшалась в 2.2 раза (Табл.2). Таким образом, мы показали наличие "кислородного эффекта", т. е образование Н2О2 в процессе облучения ИЭМИ КВЧ БПМ частично обусловлено активацией кислорода, содержащегося в буфере, но не поступающего извне. Результаты эксперимента с гуанозином свидетельствуют о том, что цепочка реакций, ведущих к образованию перекиси водорода в облучаемом буфере, включает образование синглетного кислорода, что еще раз подтверждает наличие активации содержащегося в буфере кислорода.

Чтобы оценить время жизни АФК, образующихся в буфере под действием ИЭМИ КВЧ БПМ, в специальной серии экспериментов фосфатный буфер после облучения ИЭМИ КВЧ оставляли в герметично закрытых флаконах при комнатной температуре в течение 1, 2, 3 и 4 ч. Оказалось, что, по крайней мере, в течение 4 ч после облучения количество образовавшихся в растворе АФК не уменьшается, даже имеется тренд в сторону его увеличения (Рис.8).

Рис.8. Изменение концентрации Н2О2 после облучения ИЭМИ КВЧ БПМ (400 нс, 500 Гц, время экспозиции 10 мин).

Таким образом, мы напрямую показали, что образование Н2О2 в облучаемом ИЭМИ КВЧ буфере в основном связано с действием возбуждаемых в нем термоакустических колебаний. В наших экспериментах зависимость образования Н2О2 под действием ИЭМИ КВЧ БПМ от ППМ излучения имела выраженный S-образный характер и при низких ППМ образования Н2О2 не наблюдалось. Однако следует отметить, что образование Н2О2 в растворах под действием различных факторов сильно зависит от ионного состава и величины pH раствора. В отдельной серии экспериментов при использовании натрий-бикарбонатного буфера (2.33 мМ NaHCO3, pH 8.5), содержащего хлорид анионы (0.53 мМ NaCl), через 10 мин облучения ИЭМИ КВЧ БПМ (400 нс, 500 Гц) мы зарегистрировали существенное увеличение образования Н2О2 (94.0±2.8 нМ), почти в 14 раз превышающее количество Н2О2, образующейся при облучении 1 мМ фосфатного буфера [Гудкова и др., 2005]. При облучении раствора Хенкса (pH 7.5), наиболее близкого по ионному составу к плазме крови, в нем образовывалось меньшее количество Н2О2 (около 16 нМ), что может быть связано с присутствием в этом физиологическом растворе сульфат анионов, подавляющих образование Н2О2 [Брусков и др., 2003]. Потенциальная генотоксичность АФК и, в частности, Н2О2 хорошо известна [Petersen et al., 2000; Тронов и Константинов, 2000]. Методом комета-тест было показано, что генотоксическое действие на изолированные лимфоциты крови человека оказывает перекись водорода в концентрации 25 мкМ [Тронов и Константинов, 2000], а на лимфоидные клетки человека линии ТК6 – в концентрации 1 мкМ и выше [McName et al., 2000]. В наших экспериментальных условиях за 10 мин облучения ИЭМИ КВЧ БПМ концентрация образовавшейся Н2О2 не превышала 100 нм, т. е. была ниже той, которая обладает генотоксическими свойствами in vitro. Возможно, при других условиях воздействия, параметрах и временах экспозиции объекта ИЭМИ БПМ скорость образования Н2О2 и соответственно ее количество будут выше. В этом случае нельзя отрицать возможного генотоксического действия ИЭМИ БПМ, опосредованного свободно-радикальными процессами.

ВЫВОДЫ

1. ИЭМИ СВЧ БПМ с выбранными параметрами (8.8 ГГц, длительность импульса 180 нс, импульсная мощность 65 кВт, частота следования импульсов 50 Гц, средняя УПМ 1.6 кВт/кг, время экспозиции 40 мин) не оказывает прямого генотоксического действия на нативные эритроциты лягушки Xenopus laevis in vitro. Увеличение уровня повреждений ДНК в эритроцитах лягушки при действии ИЭМИ СВЧ БПМ обусловлено увеличением температуры суспензии облучаемых клеток.

2. ИЭМИ СВЧ БПМ с выбранными параметрами не вызывает возникновения прямого повреждения ДНК в интактных лейкоцитах и изолированных лимфоцитах крови человека после 40 мин облучения in vitro в диапазоне температур 23-37оС.

3. Облучение ИЭМИ КВЧ БПМ с выбранными параметрами (37 ГГц, длительность импульса 60 нс, импульсная мощность 20 кВт, частота следования импульсов 50 Гц, интенсивность 0.24 Вт/см2, время экспозиции 20 мин) не вызывает прямого повреждения ДНК в интактных лейкоцитах крови мыши in vitro в исследованном диапазоне температур.

4. Под действием ИЭМИ КВЧ БПМ (37 ГГц, импульсная мощность 20 кВт, длительность импульса 400 нс, частота следования импульсов 500 Гц, интенсивность 0.4 Вт/см2) в водных растворах образуется Н2О2 в наномолярных концентрациях. Показано, что образование Н2О2 происходит в результате суммарного влияния тепла и возбуждаемых ИЭМИ КВЧ БПМ термоакустических колебаний. Обнаруженный факт образования Н2О2 под действием ИЭМИ КВЧ БПМ имеет принципиальное значение для дальнейших исследований генотоксического действия ИЭМИ БПМ.

Исследование выполнено при поддержке EOARD/ISTC (проект № 000/№ 000) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект № ).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах

1. Chemeris N.K., Gapeyev A.B., Sirota N.P., Gudkova O.Yu., Kornienko N.V., Tankanag A.V., Konovalov I.V., Buzoverya M.E., Suvorov V.G., Logunov V.A. DNA damage in frog erythrocytes after in vitro exposure to high peak-power pulsed electromagnetic field. // Mutation Res., 2004, Vol. 558, pp. 27-34.

2. , , Исследование механизмов образования активных форм кислорода в водных растворах под действием импульсного электромагнитного излучения крайне высоких частот с большой пиковой мощностью. // Биофизика, 2005, Т. 50, Вып. 5, с. 773-779.

3. Chemeris N. K., Gapeyev A. B., Sirota N. P., Gudkova O. Yu., Tankanag A. V., Konovalov I. V., Buzoverya M. E., Suvorov V. G., Logunov V. A. The lack of direct DNA damage in human blood leukocytes and lymphocytes after in vitro exposure to high power microwave pulses. // Bioelectromagnetics, 2006, Vol. 27, No.3 (early view).

Статьи в сборниках

4. , , Сирота генотоксических эффектов импульсных электромагнитных полей с большой пиковой мощностью. Материалы Международной научно-технической конференции "Медэлектроника 2003. Средства медицинской электроники и новые медицинские технологии", г. Минск, Беларусь, 20-21 ноября 2003 г., Мн.: БГУИР, 2003, с.42-45.

5. , , Чемерис -программный комплекс для мониторинга генотоксического действия физико-химических факторов методом комета-тест. Материалы Международной научно-технической конференции "Медэлектроника 2003. Средства медицинской электроники и новые медицинские технологии", г. Минск, Беларусь, 20-21 ноября 2003 г., Мн.: БГУИР, 2003, с. 49-52.

6. , , Чемерис активных форм кислорода под действием ИЭМИ КВЧ БПМ. Материалы Международной научно-технической конференции "Медэлектроника 2004. Средства медицинской электроники и новые медицинские технологии", г. Минск, Беларусь, 9-10 декабря 2004 г., Мн.: БГУИР, 2004, с. 41-44.

7. , , Чемерис прямого генотоксического действия импульсных микроволн с большой пиковой мощностью методом комета-тест. В кн.: Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии. Труды международной конференции. / Под ред. , , . – Саров: РФЯЦ-ВНИИЭФ, 2005, с. 129-137.

8. Chemeris N. K., Gapeyev A. B., Sirota N. P., Gudkova O. Yu., Tankanag A. V., Konovalov I. V., Buzoverya M. E., Suvorov V. G., Logunov V. A. The in vitro assessment of potential genotoxicity of high power microwave pulses. In NATO Security through Science Series – B: Physics and Biophysics: S. N. Ayrapetyan and M. S. Markov (eds.) Bioelectromagnetics: Current Concepts. Springer, 2006, pp.135-154.

Тезисы докладов

9. Скорочкина (Гудкова) О. Ю., , Гапеев влияния алкилирующих агентов на геном земноводных методом "комета-тест". Тез. докл. 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 14-18 апреля 2002 г., с. 77.

10. Chemeris N. K., Gapeyev A. B., Sirota N. P., Skorochkina (Гудкова) O. Yu., Konovalov I. V., Buzoverya M. E., Suvorov V. G., Logunov V. A. Assessment of the genotoxic effects of high peak-power pulsed electromagnetic field with the use of comet assay. In Proc. of Third International Symposium on Nonthermal Medical/Biological Treatments Using Electromagnetic Fields and Ionized Gases "ElectroMed 2003", San Antonio, Texas, June 11-13, 2003, pp. 55-56.

11. Gapeyev A. B., Chemeris N. K., Sirota N. P., Skorochkina (Гудкова) O. Yu., Kovovalov I. V., Buzoverya M. E., Suvorov V. G., Logunov V. A. High peak-power pulsed electromagnetic field does not cause any significant effect on chromatin of frog erythrocytes determined by the comet assay. Abstract Book of 25th Annual Meeting of BEMS, Maui, Hawaii, June 22-27, 2003, p. 362.

12. , , Сирота генотоксических эффектов электромагнитных излучений при различных режимах воздействия. Тез. докл. 8-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 17-21 мая 2004 г., с. 81.

13. , , Сирота чувствительности метода комета-тест от условий электрофореза. Тез. докл. 8-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 17-21 мая 2004 г., с. 96.

14. , , Гапеев образования активных форм кислорода в водных растворах при облучении импульсным ЭМИ КВЧ. Тез. докл. 9-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 18-22 апреля 2005 г., с. 113.