Исследование генотоксического действия импульсных электромагнитных излучений с большой пиковой мощностью (стр. 1 )

На правах рукописи

ГУДКОВА Ольга Юрьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ИМПУЛЬСНЫХ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ИЗЛУЧЕНИЙ С БОЛЬШОЙ ПИКОВОЙ МОЩНОСТЬЮ

03.00.04 – биохимия

автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино – 2006

Работа выполнена в лаборатории регуляции в биомедицинских системах

Института биофизики клетки РАН, г. Пущино

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат физико-математических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук

Ведущая организация:

Филиал института биоорганической химии

им. академиков и РАН, г. Пущино

Защита диссертации состоится «_____» апреля 2006 г. в ____ часов ____ мин. на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН Московская область, .

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН Московская область, .

Автореферат разослан «_____» марта 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Интерес к биологическому действию импульсных электромагнитных излучений с большой пиковой мощностью (ИЭМИ БПМ) возник сравнительно недавно вслед за созданием и распространением радиолокационных излучающих систем, генерирующих высокомощные электромагнитные импульсы (десятки и сотни кВт) с крайне короткой длительностью (десятки нс). При действии таких ЭМИ импульсная напряженность электрического поля в облучаемом биологическом объекте приближается к максимально достижимой из-за близости к величине напряженности пробоя [Albanese et al., 1994; Девятков и др., 2000]. В этих экстремальных условиях можно ожидать наличия прямого повреждающего действия ИЭМИ БПМ на ДНК клеток. Опосредованные механизмы генотоксического действия ИЭМИ БПМ могут быть обусловлены как увеличением температуры облучаемого объекта, так и термоупругим возбуждением в облучаемом объекте акустических колебаний с последующей поляризацией молекул и образованием свободных радикалов [Guy et al., 1975; Olsen & Lin, 1983], потенциальная генотоксичность которых хорошо известна.

На сегодняшний день работы, в которых было исследовано биологическое действие ИЭМИ БПМ на различные объекты, немногочисленны. Обнаружено, что облучение крыс ИЭМИ БПМ приводит к нарушению их оперантного поведения [Akyel et al., 1991], значительному снижению физической выносливости и изменению когнитивных функций [Raslear et al., 1993], что связано с нагревом тела животных. Воздействие ИЭМИ БПМ вызывает повреждение изолированного хрусталика глаз [Creighton et al., 1987] и уменьшает интервал между сокращениями препаратов сердца лягушки [Pakhomov et al., 2000]. Обнаружено уменьшение скорости роста карциномы Walker у крыс и увеличение средней продолжительности жизни животных-опухоленосителей после in vivo облучения ИЭМИ БПМ [Девятков и др., 1994]. Показано увеличение количества деградирующих опухолевых клеток и опухолевых клеток на стадии лизиса после облучения ИЭМИ БПМ in vitro [Девятков и др., 1998]. Воздействие ИЭМИ БПМ прерывает индивидуальное развитие Drosophila [Bolshakov et al., 2000, 2001a], замедляет рост грибов Fusarium sp. и подавляет скорость синтеза РНК и ДНК в опухолевых клетках мастоцитомы P-815 [Bolshakov et al., 2000, 2001b]. Показано отсутствие специфического действия ИЭМИ БПМ на проводниковую функцию нейронов гиппокампа крыс; переходное и обратимое уменьшение амплитуды спайков было вызвано исключительно увеличением температуры при облучении [Pakhomov et al., 2003]. В настоящее время существуют лишь единичные работы, посвященные исследованию генотоксических эффектов ИЭМИ БПМ на клетках человека и животных. Например, Natarajan и др. (2002) показали, что облучение моноцитов человека ИЭМИ БПМ может увеличивать активность связывания фактора NF-κВ с ДНК, что приводит к трансактивации экспрессии генов-мишеней, изменяя тем самым структуру хроматина.

В последние годы большое внимание уделяется оценке генотоксического действия непрерывных и модулированных ЭМИ радиочастотного диапазона (РЧ ЭМИ). В ряде исследований обнаружены индукция повреждений нитей ДНК, увеличение количества дицентрических хромосом, ацентрических участков и микроядер при действии РЧ ЭМИ [Maes et al., 1993; Lai & Singh, 1995; Zotti-Martelli et al., 2000; d’Ambrosio et al., 2002; Tice et al., 2002]. В то же время, в серии работ показано отсутствие каких-либо прямых мутагенных, генотоксических или канцерогенных эффектов РЧ ЭМИ [Verschaeve & Maes, 1998; Brusick, 1998; Vijayalaxmi et al., 2000; Li et al., 2001].

Из приведенных данных видно, что результаты по оценке генотоксического действия РЧ ЭМИ противоречивы, а работы по исследованию генотоксических эффектов ИЭМИ БПМ практически отсутствуют. Поэтому исследование возможности прямого повреждающего действия ИЭМИ БПМ, не обусловленного нагревом облучаемого объекта, представляет большой научный интерес. Однозначный ответ на вопрос о потенциальной генотоксичности ИЭМИ БПМ и знание механизмов действия такого излучения, как на клеточном уровне, так и на уровне организма человека и животных позволит разработать научно обоснованные санитарно-гигиенические нормативы для обслуживающего персонала и населения, попадающего в зону действия ИЭМИ.

Цель работы.

Целью настоящей работы являлось исследование потенциальной генотоксичности импульсных ЭМИ сверхвысоких (СВЧ) и крайне высоких (КВЧ) частот с большой пиковой мощностью (ИЭМИ КВЧ БПМ и ИЭМИ СВЧ БПМ).

Задачи исследования.

1. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ и ИЭМИ КВЧ БПМ на ДНК различных типов клеток (эритроцитах лягушки, лейкоцитах и лимфоцитах крови человека и лейкоцитах крови мыши) in vitro.

2. Оценка возможности повреждения ДНК активными формами кислорода (АФК), образующимися под действием ИЭМИ КВЧ БПМ.

а) Определение продукции АФК в водных растворах под действием ИЭМИ КВЧ БПМ.

б) Исследование механизмов образования АФК в водных растворах при облучении ИЭМИ КВЧ БПМ.

Научная новизна работы.

Впервые исследовано прямое генотоксическое действие ИЭМИ БПМ на клетках различных биологических объектов. Показано отсутствие индукции повреждений ДНК под действием ИЭМИ для гомойотермных видов (мышь, человек) и увеличение поврежденности ДНК при действии ИЭМИ на клетки животных пойкилотермного вида (лягушка), обусловленное увеличением температуры суспензии облучаемых клеток. В результате модификации метода "комета-тест" была существенно увеличена его чувствительность. Показана возможность применения комета-теста в мониторинговых исследованиях с использованием популяций земноводных на примере эритроцитов лягушки Xenopus laevis.

Установлено, что облучение водных растворов ИЭМИ КВЧ БПМ приводит к образованию в них Н2О2, которая потенциально может вызывать повреждения ДНК в различных клетках. Исследование механизмов образования Н2О2 при облучении показало, что образование Н2О2 в облучаемом ИЭМИ КВЧ БПМ растворе происходит в результате суммарного влияния тепла и возбуждаемых ИЭМИ КВЧ БПМ термоакустических колебаний.

Научно-практическое значение.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ИЭМИ с параметрами, характерными для современных радиолокационных станций, не обладает прямым генотоксическим действием, что может быть использовано при научном обосновании безопасных санитарно-гигиенических нормативов для обслуживающего персонала и населения, попадающего в зону действия такого излучения.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 2003 – 2005), на международной конференции «Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии» (Саров, 2004), международных научно-технических конференциях «Медэлектроника. Средства медицинской электроники и новые медицинские технологии» (Минск, 2003 и 2004); в материалах 3-го международного симпозиума по нетепловому воздействию электромагнитных полей и ионизированных газов «Электромед-2003» (Сан Антонио, Техас, 2003), 25-го ежегодного заседания BEMS (Гавайи, 2003).

Публикации.

По результатам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах, 5 статей в сборниках, а также 6 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из разделов ″Введение″, ″Обзор литературы″, ″Материалы и методы исследования″, ″Результаты и обсуждение″, ″Заключение″, ″Выводы″, ″Список литературы″. Диссертация изложена на _____ страницах машинописного текста, содержит _____ рисунков, _____ таблиц и список литературы из ______ ссылок.

Список принятых сокращений. ИЭМИ БПМ – импульсное электромагнитное излучение с большой пиковой мощностью, РЧ ЭМИ – ЭМИ радиочастотного диапазона, СВЧ – сверхвысокие частоты, КВЧ – крайне высокие частоты, УПМ – удельная поглощенная мощность, ППМ – плотность потока мощности, ФБ-ЭДТА - фосфатно-солевой буфер с 1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат динатриевая соль), АФК – активные формы кислорода, ЭМС – этилметансульфонат, %ДНК – процентное содержание ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальный материал.

В работе использовались самцы Южно-африканской гладкой шпорцевой лягушки Xenopus laevis, которые содержались в водопроводной дехлорированной воде при 20-23оС. Цельную кровь лягушек, полученную путем декапитации животных, разводили фосфатно-солевым буфером (в мМ: 136.7 NaCl, 2.7 KCl, 8.1 Na2HPO4, 1.5 KH2PO4; pH=7.0) с 1 мМ ЭДТА (ФБ-ЭДТА) до концентрации эритроцитов 1´106 клеток/мл.

Свежую донорскую кровь закупали на станции переливания крови. Донорами служили здоровые мужчины в возрасте от 25 до 30 лет. В качестве антикоагулянта использовался цитрат натрия. Кровь разводили в 7 раз в ФБ-ЭДТА, чтобы конечная концентрация лейкоцитов составляла 1.0-1.5´106 клеток/мл.

Лимфоциты периферической крови человека получали центрифугированием 1 мл разведенной цитратной крови в градиенте фиколл-верографин по [Хейфец и Абалакин, 1973]. Полученную суспензию разводили в ФБ-ЭДТА до концентрации лимфоцитов 1.5´106 клеток/мл.

В работе использовались самцы мышей аутбредного стока NMRI. Цельную кровь получали путем декапитации животных. Далее лейкоциты отмывали и разводили в ФБ-ЭДТА до концентрации 1´106 клеток/мл.

Импульсное ЭМИ СВЧ БПМ.

Для облучения образцов крови человека, суспензий лимфоцитов крови человека и эритроцитов лягушки использовали экспериментальный стенд "РОДОН" на основе импульсного магнетрона типа МИ-ГГц, длительность импульса 180 нс, импульсная мощность 65±5 кВт, частота следования импульсов 50 Гц, средняя мощность 400±10 мВт). Суспензию клеток облучали в течение 40 мин в специальных пластиковых кюветах цилиндрической формы диаметром 10 мм и высотой 1 мм, помещаемых внутрь волновода сечением 23×3.4 мм2 на расстоянии 25-30 мм от фланца волновода. При средней падающей мощности 400 мВт и объеме образца 50 мкл средняя скорость роста температуры в кювете составляла около 0.37±0.01оС/с, соответствующая средняя удельная поглощенная мощность (УПМкВт/кг, величина стационарного перегрева в среднем составила около 3.5±0.1оС.

Суспензию эритроцитов лягушки, приготовленную для облучения, делили на три части: 1) отрицательный контроль (образец помещался в неподключенный к установке отрезок волновода при стационарной температуре 25±1оC); 2) имитация воздействия (образец помещался в неподключенный к установке отрезок волновода при температуре 29±1оC, имитация повышения температуры при облучении); 3) облучение. В начале облучения ИЭМИ СВЧ температура клеточной суспензии была 25±1oС. Затем за 10-15 с температура увеличивалась до стационарного уровня 29±1oС, который поддерживался до окончания экспозиции в течение 40 мин. Непосредственно после указанных воздействий (1 – 3) аликвоты по 40 мкл от каждой части суспензии использовали для приготовления препаратов для микроскопии.

Суспензию лимфоцитов, выделенных из крови доноров, делили на несколько частей: 1) отрицательный контроль (образец помещался в неподключенный к установке отрезок волновода при стационарной температуре 23±1оC); 2) имитация воздействия (образец помещался в неподключенный к установке отрезок волновода при температуре 27±1оC, имитация повышения температуры при облучении); 3) облучение; 4) второй отрицательный контроль (образец инкубировали при температуре 37±0.5оC); 5) положительный контроль (клетки инкубировали при 37±0.5оC в присутствии этилметансульфоната (ЭМС, 5 мМ), рекомендованного препарата для проведения положительных контролей для оценки чувствительности "комета-теста" [Hartmann et al., 2003]). Непосредственно после указанных воздействий аликвоты по 30 мкл от каждой части суспензии разводили в соотношении 1:1 в ФБ-ЭДТА и использовали для приготовления препаратов для микроскопии.

В отдельной серии экспериментов по окончании облучения аликвоты по 30 мкл отбирались от каждой части суспензии, к ним добавляли равный объем ФБ-ЭДТА (предварительно прогретого при 37оС), помещали на 30 мин в инкубатор при 37±0.5оС и затем готовили препараты для микроскопии.

Импульсное ЭМИ КВЧ БПМ.

Для облучения образцов крови мыши использовали генератор на основе импульсного магнетрона (37 ГГц, длительность импульса 60 нс, импульсная мощность 20 кВт, частота следования импульсов 50 Гц, интенсивность 0.24 Вт/см2). Расчетная средняя УПМ составила 4 кВт/кг. Суспензию клеток (по 200 мкл) в течение 20 мин облучали в специальных пластиковых кюветах цилиндрической формы диаметром 10 мм и высотой 5 мм, помещаемых на открытый конец волновода сечением 7.2´3.4 мм2. Облучение проводили при различных температурных условиях: 0; +4; +25оС. Контрольные препараты содержали в аналогичных условиях, но не облучали.

Облучение образцов ионизирующим излучением.

Облучение препаратов (слайдов) с эритроцитами лягушки проводили на ГУБЭ (Гамма установка биологическая экспериментальная, источник γ-радиации 60Со) в дозах 50, 100 и 200 сГр (мощность дозы 40 сГр/мин).

Готовые препараты с лейкоцитами цельной крови или изолированными лимфоцитами крови человека облучали на РУТ-15 (Рентгеновская установка терапевтическая 15, рентгеновские лучи) в дозах 1.5, 2.74 и 5.48 Гр (мощность дозы 1.17 Гр/мин). Препараты с лейкоцитами цельной крови мыши облучали на РУТ-15 в дозе 4 Гр (мощность дозы 1 Гр/мин, фокусное расстояние 37 см).

Во всех случаях облучение проводили на льду, чтобы исключить влияние ферментов репарации.

Обработка образцов алкилирующим агентом.

Образцы крови обрабатывали алкилирующим агентом ЭМС в концентрации 5 мМ в течение 40 мин при 20±1оС (лягушка) или в концентрации 1-10 мМ в течение 20 мин при 37±0.5оC (человек).

Инкубация при различных температурах.

Учитывая увеличение температуры при облучении образцов ИЭМИ БПМ, в отдельной серии экспериментов исследовали влияние различных температурных условий на индукцию повреждений ДНК в клетках. Аликвоты суспензии эритроцитов лягушки инкубировали в течение 40 мин при температурах 20, 25 и 30оС. Образцы крови человека или суспензии лимфоцитов инкубировали в течение 40 мин при 23, 27, 33 и 37оС. Затем из каждой части суспензии готовили по 3 препарата для "комета-теста".