Изучение биохимического состава, биологической ценности и структуры белковых продуктов, полученных из жмыхов семян льна (стр. 2 )

Проведенные исследования позволили установить зависимость между содержанием белка и углеводов. Наши эксперименты показали (табл.1,2), что чем выше содержание белка, тем ниже содержание редуцирующих сахаров, что хорошо согласуется с литературными данными (Щербаков, 1991). Семена льна, из которых был получен костромской жмых, являются более зрелыми, так как содержат максимальное количество сырого протеина – 36,91% и минимальное редуцирующих сахаров и гемицеллюлоз, соответственно, 2,23% и 13,47% (табл.2).

Таким образом, проведенные исследования общего количества азота и белка, а также различных его форм в исходном сырье в зависимости от сорта льна и зоны его выращивания выявило преимущества льняного жмыха перед льняным семенем в качестве источника получения белка различного назначения. Полученные результаты позволили теоретически обосновать и практически реализовать технологию выделения белка из жмыха льна.

2. Разработка технологии выделения белка из жмыха льна

Как показали проведенные исследования, льняные жмыхи содержат более 30% белка, что позволяет рассматривать их в качестве дешевого растительного сырья для получения протеина. Белки льна представлены преимущественно альбуминами и глобулинами, характеризующимися полноценным аминокислотным составом (Виноградов, 2000; Ущаповский, 2001). Это явилось предпосылкой разработки технологии получения белка из жмыха льна. В основе технологии лежит принцип последовательной экстракции различных белковых фракций из жмыха семян льна (рис.1). Разработанная технология позволяет получать льняной белковый концентрат (содержание белка более 70%) либо изолят (содержание белка около 90%). Технология защищена патентом № 000. На базе отходов разработанной технологии получения льняного белка может быть получен соломобелковый корм для крупного рогатого скота (патент № 000).

Рис.1 Технологическая схема выделения белка из жмыха льна

3. Характеристика целевых и промежуточных белковых продуктов

В результате проведения последовательной солевой и щелочной экстракции в раствор удалось перевести 67,06% белка от исходного его количества в льняном жмыхе. Выход белка в ходе солевой экстракции составил 44,95%, а щелочной – в 2 раза меньше – 22,11% от его содержания в льносырье, что хорошо согласуется с литературными данными о фракционном составе белков льна (Барбашов, 2004).

Проведенные эксперименты позволили установить, что солевой и щелочной белковые экстракты имеют низкую концентрацию белка (0,83 и 0,41%), в связи с чем необходимо их концентрирование. В результате осаждения белка соляной кислотой удается повысить концентрацию белка в солевом белке-сырце до 30, а в щелочном белке-сырце до 62% (табл.3). Фактически, щелочной белок-сырец по содержанию белка соответствует категории белковой муки (более 50% белка).

Таблица 3

Содержание белка в целевых продуктах, полученных из льняного жмыха

показатель	солевая экстракция
солевой белковый раствор	солевой белок-сырец
азот, %	белок, %	азот, %	белок, %
содержание азота/белка в а. с.в., %	1,44±0,03	9,01±0,14	4,69±0,16	29,32±1,00
концентрация азота/белка в растворе, %	0,14±0,003	0,83±0,03	-	-
количество азота/белка относительно массы навески, %	14,43±0,22	13,75±0,21	13,87±0,19	9,33±0,14
количество азота/белка относительно общего содержания его в навеске, %	44,95±0,71	44,95±0,68	31,21±0,32	31,21±0,32
	щелочная экстракция
щелочной белковый раствор	щелочной белок-сырец
азот, %	белок, %	азот, %	белок, %
содержание азота/белка в а. с.в., %	0,97±0,01	6,05±0,08	9,89±0,052	61,83±0,32
концентрация азота/белка в растворе, %	0,065±0,0014	0,41±0,04	-	-
количество азота/белка относительно массы навески, %	1,08±0,001	6,77±0,10	0,92±0,001	5,72±0,023
количество азота/белка относительно общего содержания его в навеске, %	22,13±0,34	22,11±0,31	18,68±0,08	18,70±0,083

Дальнейшее повышение концентрации белка осуществляется промывкой различными растворителями. Максимального увеличения концентрации белка позволяет добиться промывка горячей водой. После ее проведения солевой и щелочной белковый продукт соответствует категории белкового концентрата с содержанием белка, соответственно, 73,31 и 78,56% (табл.4).

Таблица 4

Изменение концентрации белка в целевом продукте путем промывки различными растворителями

вид очистки	последовательная промывка
солевой белок-сырец	щелочной белок-сырец
азот,%	белок,%	потери, %	азот,%	белок,%	потери, %
белок-сырец	7,39±0,07	46,19±0,52	-	9,89±0,05	61,83±0,32	-
промывка водой, tºC	11,73±0,15	73,31±0,94	27,12	12,56±0,05	78,50±0,28	16,67
этанол после воды	11,81±0,06	73,81±0,51	0,5	11,80±0,04	73,76±0,26	-4,74
ацетон после воды и этанола	7,11±0,36	44,44±2,29	-29,37	12,73±0,14	79,57±0,87	5,81
параллельная промывка
промывка водой, t°C	11,76±0,06	73,51±0,39	27,31	12,58±0,06	78,66±0,37	16,83
промывка этанолом	8,55±0,10	53,48±0,06	7,28	11,71±0,03	73,21±0,22	11,38

«-» - снижение содержания белка в белковом продукте.

Высокая эффективность водной промывки, особенно в солевом белковом продукте, объясняется значительным содержанием в семени льна водорастворимых полисахаридов – слизей, которые в процессе экстракции переходят как в солевой, так и в щелочной белковый экстракт, но в меньшей степени.

Обработка высушенного белкового продукта методом последовательной промывки водой, этанолом, ацетоном и эфиром позволяет получить на основе солевого белка льняной белковый изолят с содержанием белка 88,75%. Щелочной белковый концентрат имеет более высокое содержание белка, чем солевой. Однако из солевого белкового концентрата возможно получение изолированного белка.

Таким образом, на базе разработанной технологической схемы возможно получение льняных белковых продуктов, соответствующих категориям белковой муки (50-70% белка), белкового концентрата (70-90% белка) и изолята (более 90%белка). Каждая технологическая стадия выделения белка оказывает определенное влияние на его структуру, вплоть до денатурации белка, разрушения некоторых незаменимых аминокислот. В связи с этим возникла необходимость изучения структуры льняного белкового продукта, выделенного из жмыха.

4. Анализ конформации белковых продуктов

Высушенные порошки целевых, промежуточных и побочных белковых продуктов, отобранные после каждой технологической стадии, были проанализированы с использованием метода ИК-спектроскопии. В качестве контрольного образца нативного белка использовали промышленный препарат изолята бычьего сывороточного альбумина.

Анализ ИК-спектров льняного жмыха позволил установить, что в нем преобладают белки, имеющие α-свернутую форму. Об этом свидетельствует положение полос поглощения амид I, амид II при 1653 см-1 и 1544 см-1 соответственно. Положение полосы поглощения амид V при 660 см-1 подтверждает нахождение незначительной части белков в неупорядоченной конформации. Причиной нарушения спиральной конформации белка является отталкивание одинаково заряженных групп аминокислотных радикалов (глутамин, аргинин), а также их большие размеры (треонин, лейцин). Присутствие перечисленных аминокислот в составе белка льна, а также фенилаланина, тирозина, лейцина и валина подтверждается ИК-спектрами белков.

 

Рис.2 ИК-спектры костромского(1), ставропольского (2), пензенского (3) льняных жмыхов

Рис.3 ИК-спектры солевого белкового экстракта (1) и солевого белка-сырца (2)

Изучение ИК-спектра солевого белкового экстракта позволило установить, что после экстракции белков хлоридом натрия конформационных изменений в молекуле белка не происходит. Об этом свидетельствует неизменное положение полос поглощения амид I, амид II, амид III, амид IV в ИК-спектре солевого белкового экстракта. В связи с тем, что молекулы соли обладают большими, чем белки электростатическими зарядами, они оттягивают на себя молекулы воды, образующие гидратную оболочку белка, в результате чего заряд на поверхности молекулы белка становится равным нулю. Для прохождения процесса денатурации белка необходимо изменение двух стабилизирующих факторов: электрического заряда и растворимости.

Анализ ИК-спектра солевого белка-сырца показывает изменение положения полос поглощения амид II, амид III, амид IV, появление полосы поглощения при 1150 см-1, расщепление полосы поглощения при 1406 см-1 на две при 1400 см-1 и 1384 см-1. Смещение полосы поглощения амид II к 1532 см-1, характерному для хаотического клубка, смещение полосы поглощения амид III к 1238 см-1 свидетельствуют об изменении конформации белка вследствие его денатурации.

Денатурационные изменения наблюдаются и в процессе щелочной экстракции. Смещение полос поглощения амид I к 1646 см-1, характерному для β-структур, отсутствие поглощения в области амид II, амид III, обусловленных колебаниями группы –CОNН - и деформационными колебаниями NH-группы в ИК-спектре щелочного белкового экстракта свидетельствует о разворачивании третичной, вторичной структуры белков до первичной.

После осаждения щелочного белка-сырца соляной кислотой в его ИК-спектре полоса поглощения амид II восстанавливается при 1529 см-1, а полоса поглощения амид I наблюдается при 1656 см-1, оба эти значения характеризуют хаотический клубок. Положение полосы поглощения амид III сдвинуто в длинноволновую область. Данные изменения характеризуют процессы частичного самопроизвольного сворачивания в термодинамически менее выгодные β-структуры (Финкельштейн, 2000). Последующее сворачивание полипептидной цепи после нейтрализации становиться возможным из-за существования областей гидрофобного связывания полипептидной цепи, не доступных для химических взаимодействий (Кушнер, 1977). Очевидно, они впоследствии становятся зародышевыми центрами формирования вторичной и третичной структуры полипептида.

 

Рис.4 ИК-спектры щелочного белкового экстракта (1) и щелочного белка-сырца(2)

Таким образом, используемые в настоящее время методы концентрирования приводят к денатурации белка, разрушению третичной и вторичной структуры. Снижение концентрации денатурирующего агента приводит к образованию водородных связей и самосборке более жестких β-структур, реализуя потенциал, заложенный в последовательности аминокислотных остатков.

Проведенные исследования позволили установить, что льняной белковый концентрат находится в конформации статистического клубка и β-структур. С позиций термодинамики β-структуры являются менее выгодной формой существования макромолекул по сравнению с α-спиралью (Финкельштейн,2000). Судя по ИК-спектрам льняных белковых продуктов, после обработки этанолом белки в конформации β-структур преобладают. Это предположение подтверждается смещением амид I и амид II полос поглощения к значениям, характеризующим β-структуры.

Как показали проведенные исследования, технологическая обработка растительных белков приводит к денатурации, и, как следствие, снижению их растворимости, изменению функциональных свойств. Денатурация белка способствует повышению доступности химических связей белка для пищеварительных ферментов, что облегчает усвоение протеинов человеческим организмом (Рогов, 2000). С другой стороны, в процессе денатурации возможно уменьшение содержания некоторых незаменимых аминокислот, образование лизиноаланина и т. п. (Нечаев, 2003), что может снижать биологическую ценность получаемых белковых продуктов. В связи с этим на следующем этапе работы было проведено определение аминокислотного состава целевых белковых продуктов.

5. Биологическая ценность льняных продуктов

Как показали проведенные исследования, в аминокислотном составе как солевого, так и щелочного льняного белкового концентрата присутствует семь незаменимых аминокислот, а также обе частично заменимые аминокислоты – гистидин и аргинин.

Щелочной белковый концентрат превосходит практически в 2 раза солевой льняной белковый концентрат по содержанию большинства незаменимых аминокислот: лизина, треонина, валина, метионина, лейцина, изолейцина. Единственной аминокислотой, содержание которой в рассматриваемых концентратах очень близко, является фенилаланин, хотя и по этому показателю льняной солевой белковый продукт уступает щелочному. Его содержится 2,22 и 2,15% соответственно.

Содержание частично незаменимых аминокислот гистидина и аргинина в льняном щелочном белковом продукте также выше и составляет 2,02 и 5,83% соответственно. Концентрация этих аминокислот в солевом белковом концентрате ниже и составляет 1,01 и 4,17% соответственно.

Сумма незаменимых аминокислот в льняном щелочном белковом концентрате составляет 34,53, а, включая и частично незаменимые аминокислоты - 47,5%. Льняной солевой белковый концентрат уступает по сумме незаменимых аминокислот льняному щелочному белковому концентрату, в нем содержится 23,65% незаменимых аминокислот от общего содержания их в белке.

На основании данных об аминокислотном составе белковых концентратов были рассчитаны скоры незаменимых аминокислот относительно эталона ФАО/ВОЗ (Нечаев,2003; Рогов,2000). Аминокислотный скор выражают в % или безразмерной величиной, представляющей собой отношение содержания незаменимой аминокислоты (а. к.) в исследуемом белке к ее количеству в идеальном белке согласно данным ФАО/ВОЗ (Нечаев,2003; Рогов,2000).

.

Таблица 5

Аминокислотный состав льняных и соевых белковых продуктов

(% от содержания белка)

незаменимые аминокислоты	Соя (Зубцов и др., 2002)	стандарт ФАО	Лен
семена	молоко	мука	семена сорта Ленок (Виноградов и др., 2001 )	солевой концентрат	щелочной концентрат
изолейцин	4,5	5,3	4,7	4,0	4,0	2,4	4,6
лейцин	7,1	8,8	7,7	7,0	7,0	3,1	6,7
лизин	5,9	3,5	5,8	5,5	2,5	1,9	3,0
метионин +цистин	1,9*	2,5	2,3	3,5	4,2	2,0	3,0
фенилаланин +тирозин	4,1*	8,0	8,5	6,0	10,7	4,6	5,9
треонин	3,4	4,5	3,6	4,0	5,1	2,0	3,3
триптофан	1,7	-	-	3,5	1,5	-	-
валин	4,5	5,0	5,2	5,2	5,2	2,9	5,4

*-данные без учета цистина и тирозина