Изучение биохимического состава, биологической ценности и структуры белковых продуктов, полученных из жмыхов семян льна (стр. 1 )

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА

Анна Леонидовна

ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА,

БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ И СТРУКТУРЫ БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ЖМЫХОВ СЕМЯН ЛЬНА

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Тверь – 2007

Работа выполнена на кафедре биомедицины Тверского государственного университета.

Научный руководитель доктор биологических наук,

профессор

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

доктор биологических наук

Ведущая организация Всероссийский научно-исследовательский институт льна

Защита состоится « 3 » октября 2007 г. в 1400 на заседании диссертационного совета К 212.263.01 в Тверском государственном университете г. Тверь, пр. Чайковского, 70 а, корп. 5, ауд. 318.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета 4 а.

Автореферат разослан «___» _____________ 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Анализ структуры питания населения России за последние десять лет свидетельствует о тенденции неуклонного снижения потребления белка животного происхождения, что обусловлено, в том числе, высокой себестоимостью продуктов животноводства в сравнении с продукцией растениеводства (Рогов, 2000; Нечаев, 2003). Мясо – ценнейший источник белков – относится к числу наиболее трудновоспроизводимых продуктов питания. В связи с этим возрастает актуальность рационального использования растительных белков, в том числе для интенсификации производства мясопродуктов.

В настоящее время в качестве источника растительного белка наиболее широко используются бобовые и масличные культуры (Плешков, 1985). Лидером по производству белка является соя (Доморощенкова, 2001). Высокая требовательность сои к природно-климатическим условиям, а также наличие в ней антипитательных компонентов (Петибская и др., 1998,2000; Лобанов и др., 2005), в том числе белковой природы, делает ее возделывание в северных регионах нашей страны нецелесообразным.

При выборе источников растительного белка необходимо учитывать региональные ресурсы. В 16 субъектах Российской Федерации, в том числе и в Тверской области (Виноградов и др., 2001; Ущаповский, 2001), приоритетной культурой является лен. В нашей стране лен - старейшая волокнистая и масличная культура, пригодная к возделыванию практически в любой зоне (Лисицын и др., 2002). Ценнейшим продуктом, получаемым при переработке льносемян, является льняное масло, богатое полиненасыщенными жирными кислотами. Льняное масло является лечебно-профилактическим средством при некоторых онкологических заболеваниях, борьбе с липидемическими отложениями, атеросклерозом и другими заболеваниями. Отжим льняного масла, составляющего до 50% массы семени, производят методом холодного прессования, что позволяет сохранить все его ценные компоненты в неизменном виде. Содержание белка в отходах льняного маслодельного производства по данным различных источников составляет от 25 до 54% (Виноградов и др., 2001). В настоящее время льняные жмыхи вводятся в количестве 10% в корма сельскохозяйственных животных, что не позволяет в полной мере реализовать заложенный в них потенциал нутрицевтиков.

В связи с тем, что в процессе отжима масла на долю высокобелковых отходов - льняных жмыхов, приходится более 60%, их использование в качестве источника белка является перспективным направлением, позволяющим решить как проблему рациональной утилизации отходов маслодельного производства, так и проблему дефицита белка.

Количественный и качественный состав белков льна свидетельствует о перспективности его применения в качестве источника белка (Пащенко и др., 2003,2004; Щербаков и др., 1991). В белке семени льна присутствуют все незаменимые аминокислоты, причем содержание некоторых из них соответствует стандарту ФАО (Food and Agricultural Organisation of the United Nation – Организация по питанию и сельскому хозяйству при ООН) (Виноградов и др., 2001; Ущаповский, 2001). Таким образом, существуют предпосылки создания на основе льняных жмыхов белковых продуктов. В литературе есть примеры получения белковых продуктов из сои, нута, люпина, чечевицы, подсолнечника, конопли, горчицы, рапса и многих других культур, кроме льна, что определяет актуальность данного исследования.

Согласно литературным данным (Рогов, 2000; Нечаев, 2003), некоторые технологические этапы получения растительного белка, например, удаление масла экстракционным методом, снижение активности ингибиторов ферментов, приводит к денатурации белка, снижению содержания незаменимых аминокислот, в частности, полному разрушению триптофана (Доморошенкова,2001; Нечаев, 2003). В связи с этим необходимо не только разработать технологию получения белка из жмыха льна, но и изучить биохимический и аминокислотный состав белковых продуктов на его основе, а также исследовать влияние отдельных технологических стадий на структуру белка, так как от этого во многом зависит его биологическая ценность.

Таким образом, актуальность работы заключается в создании научно-методической основы получения растительного белка из жмыха семян льна и изучении биохимического состава и биологической ценности целевых и промежуточных продуктов, получаемых из жмыха семян льна.

Полученные данные легли в основу запатентованной технологии «Способ получения альбуминно-глобулиновго белка «линумина» из жмыха семян льна» (патент РФ № 000). Изучен аминокислотный состав льняных белковых продуктов, полученных из жмыхов. Показано, что льняной белковый концентрат, получаемый по разработанной технологии, обладает высокой пищевой ценностью и включает такие незаменимые аминокислоты, как лизин, треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, а также гистидин и аргинин, считающиеся незаменимыми в детском возрасте. Результаты работы могут быть использованы для разработки новых видов пищевых и кормовых продуктов на основе льняных белковых концентратов и изолятов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение биохимического состава и биологической ценности целевых и промежуточных продуктов, полученных из жмыха семян льна. Были поставлены следующие задачи:

1.  Изучить содержание различных форм азота в семенах и жмыхах льна, установить предпочтительность использования этих объектов в качестве источника растительного белка.

2.  Создать научно-методическую основу для получения льняного пищевого белка из жмыха семян льна.

3.  Изучить биохимический состав и биологическую ценность целевых экстракционных продуктов из жмыха семян льна.

4.  Установить исходную конформацию белков льняного жмыха, и конформацию белков целевого продукта для определения степени их денатурации в процессе реализации технологии.

5.  Изучить содержание белка в отходах производства: первичной жмыховой пасте, вторичной жмыховой пасте, первичной сывороточной воде для определения возможных путей их дальнейшей утилизации.

Научная новизна работы. Показана перспективность и принципиальная возможность использования льняных жмыхов – отходов льняного маслодельного производства в качестве регионального источника растительного белка различного назначения. Разработаны научно-методические основы для создания технологии получения растительного белка из отходов льняного маслодельного производства – жмыхов семян льна. Установлено, что разработанная технология позволяет получать как льняной белковый концентрат (70-90% белка), так и изолят (90% и более). На основании аминокислотного состава изучена биологическая ценность льняных белковых продуктов. Методом ИК-спектроскопии изучены конформационная структура белка льняного жмыха и изменения, происходящие с ней в процессе реализации технологии получения белка. Исследования биохимического состава технологических отходов получения льняного белка позволили определить возможные пути их дальнейшей утилизации в качестве соломо-белкового корма для крупного рогатого скота.

Практическая значимость. Разработана биотехнология «Способ получения альбуминно-глобулинового белка «линумина» из жмыха семян льна» (патент РФ № 000). На базе отходов льняной маслодельной промышленности получены новые льняные белковые продукты, изучен их аминокислотный состав и биологическая ценность. Установлено, что льняной белковый концентрат содержит все незаменимые аминокислоты и удовлетворяет потребность в большинстве из них более чем на 80%. Изучение биохимического состава отходов производства льняного белкового продукта позволило разработать и запатентовать «Способ получения соломобелкового корма для жвачных животных (варианты)» (патент РФ № 000). Комплексная технология получения льняного белка и соломобелкового корма позволяет высокоэффективно использовать белоксодержащие отходы льняного маслодельного производства в качестве дешевого сырья, реализуя, тем самым, региональный потенциал Тверской области.

Таким образом, практическая значимость работы заключается в получении новых белковых продуктов различного назначения, обладающих высокой биологической ценностью, с использованием регионального потенциала Тверской области – жмыхов семян льна – отходов льняного маслодельного производства. Предложенная технология является малоотходной и ресурсосберегающей, поскольку позволяет решить не только проблему пищевого и кормового белка, но и рациональной утилизации отходов льняного маслодельного производства.

Публикации. По теме диссертации было издано 19 публикаций, в том числе в журналах, рекомендуемых ВАК. Получено 2 патента на изобретение.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 5-ой Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек.» (Москва, 2003); на 6-ой Областной научно-технической конференции молодых ученых «Химия, технология и экология.» в рамках 11 региональных Каргинских чтений (Тверь, 2004); на 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2004г.); на 3-ей Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2005г.); на 2-ом и 3-ем Международном Московском конгрессе: Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2003, 2005г.); на Международной научно-практической конференции «Интенсификация машинных технологий производства и переработки льнопродукции» (Тверь, 2004г.); на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы аграрной науки и практики» (Тверь, 7-9 июня 2005г.); на Международной научно-практической конференции «Новые технологии и техника для ресурсосбережения и повышения производительности труда в сельскохозяйственном производстве» (Москва, 2005г.); на Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение национального проекта «Развитие АПК»» (Тверь, 2006г.). В 2005 г. технология получения белка «Способ получения альбуминно-глобулинового белка «линумина» из жмыха семян льна» была награждена дипломом победителя конкурса «Новые разработки 2005 года», проходившего в рамках 13-ой специализированной выставки «Ярмарка продовольствия» (г. Тверь, 2005).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на ____ листах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована ___ таблицами, ___ рисунками, включая технологическую схему получения льняного белка.

Личное участие автора. Настоящая диссертационная работа является результатом комплексных исследований, выполненных лично автором в г. Автором диссертации самостоятельно проведены экспериментальные исследования, осуществлена обработка и анализ полученных данных, разработаны основные теоретические положения, выводы и практические рекомендации. Все опубликованные работы написаны автором, или при непосредственном его участии. Доля личного участия автора в написании публикаций составляет 60-90%.

Содержание диссертации

Материалы и методы исследований

Объектами исследований являлись: 1) льняной жмых, полученный из семян льна, выращенных в Пензенской, Костромской области и Ставропольском крае, являющийся отходом льняного маслодельного производства льняного масла, получаемый методом холодного прессования на предприятие ён», г. Тверь; 2) льняной белок, получаемый в ходе реализации различных технологических стадий запатентованного «Способа выделения льняного пищевого белка «линумина» из жмыха семян льна» (патент № 000). Сюда входят такие полупродукты, как солевой белковый экстракт, щелочной белковый экстракт, солевой белок-сырец, щелочной белок-сырец, а также конечные продукты технологии: солевой белковый концентрат, щелочной белковый концентрат.

Проводились исследования побочных продуктов технологии: первичной сывороточной воды, первичной жмыховой пасты, вторичной жмыховой пасты, промывных вод.

В качестве аналога льняного белкового концентрата изучался соевый белковый концентрат и изолят фирмы ADM (США), текстурированный соевый белок фирмы Central Soya (Дания). Для рациональной утилизации отходов производства были изучены сорбционные свойства различных частей стебля пшеничной соломы.

Экстракцию белка из льняного жмыха проводили на первом этапе 7% раствором хлорида натрия, а на втором – 0,1% раствором гидроксида натрия. Для этого льняной жмых измельчали до размера частиц 0,25≥0,5 мм в лабораторной мельнице, калибровали через почвенные сита и навеску массой 10 г., взятую из фракции с указанными параметрами, заливали 7% раствором хлорида натрия в соотношении 1:10 и интенсивно перемешивали в течение 45 мин. на магнитной мешалке.

Полученную смесь центрифугировали в течение 10 мин. при 3000 об/мин. Осадок, представляющий собой жмых, заливали 0,1% раствором гидроксида натрия до достижения прежнего объема 100 мл. К надосадочной жидкости приливали соляной кислоты концентрацией 36-38% до рН=3,5 и отстаивали в течение 60 мин. Образовавшийся при этом осадок белка (белок-сырец) отделяли от надосадочной жидкости центрифугированием в течение 20 мин. при 3000 об/мин.

Полученный белок-сырец очищали от примесей полисахаридов и соли водной промывкой в соотношении 1:10 по объему. Сепарирование осуществляли центрифугированием при 3000 об/мин. в течение 20 мин. Льняной белковый концентрат высушивали, используя поток теплого воздуха. Температура потока не превышала 40ºC.

Для определения количественного содержания белка в образцах использовали наиболее широко применяемый и гостированный метод Къельдаля, основанный на минерализации навески в концентрированной серной кислоте с селеном и последующем учете азотистых веществ по продукту их распада – аммиаку (ГОСТ13496.4-93). Навески измельченного льняного жмыха и вторичной жмыховой пасты брали по 0,5±0,001, а навески льняного белкового продукта, белка-сырца и других высокобелковых продуктов – по 0,2 г.

Небелковый азот определяли, осаждая белки из водного экстракта трихлоруксусной кислотой (Ермаков и др., 1972), а затем анализировали надосадочную жидкость по методу Къельдаля. Расчет азота и белка проводился в мг навески.

Анализ аминокислотного состава проводили в соответствии с ГОСТ № 000.21-87 и ГОСТ № 000.22-90.

Определение редуцирующих сахаров и гемицеллюлоз проводили по методу Бертрана-Бьери (Петухова и др., 1989) и Ермакова (1972). Экстракцию редуцирующих сахаров проводили 80-82% этанолом, а затем заливали образец 2% соляной кислотой и нагревали для проведения 5-часового кислотного гидролиза гемицеллюлоз до редуцирующих сахаров. Расчет сахаров проводился по выпавшему осадку закиси меди. Пересчет на гемицеллюлозы проводился с использованием коэффициента 0,9 (Ермаков и др., 1972).

Гигроскопическую влажность устанавливали в соответствии с традиционной методикой (Разумов, 1986).

Изучение конформации белков проводили методом Фурье-ИК-спектроскопии (Пахомов, 1997). Образцы для ИК-спектроскопии готовили в виде таблеток с КВr (Эллиот, 1972). Спектры поглощения получали на Фурье-ИК-спектрометре «Equinox 55» фирмы «Bruker» (Германия). Для соотнесения полос поглощения использовали данные, представленные в работах Деханта (1976), Чиргадзе (1965), а также определяли спектры модельных соединений.

Весь полученный экспериментальный материал обрабатывали методом вариационной статистики по соответсвующим биометрическим алгоритмам с использованием критерия Стьюдента (Венецкий, 1979; Иванова, 1981).

Результаты исследований и их обсуждение

1. Характеристика биохимических особенностей накопления белка в семенах льна и возможности использования льняных жмыхов в качестве перспективного источника протеина

Первой задачей нашего исследования явилось изучение содержания белка в льняных семенах и жмыхах для определения предпочтительности использования объектов в качестве источника белка. Как известно, выбор исходного сырья является основополагающим фактором в разработке технологии.

Результаты проведенных исследований показали, что большую часть азотсодержащих соединений семян льна составляют белки, на долю которых приходится от 81 до 92% в зависимости от сорта (табл.1). Небелковые экстрактивные вещества составляют в среднем порядка 15% (табл.1).

Таблица 1

Содержание различных форм азота и белка в семени льна-долгунца различных сортов

показатели	Алексим	Белинка	Лен-долгунец**
%, а. с.в.	%, общ. азота	%, а. с.в.	%, общ. азота	%, а. с.в.	%, общ. азота
общий азот	4,39±0,09*	100	3,14±0,04	100	3,52±0,19	100
белковый азот	3,74±0,09*	85,19	2,56±0,05	80,89	3,25±0,18*	92,05
небелковый азот	0,65±0,01*	14,81	0,60±0,01*	19,11	0,28±0,01	7,95
сырой протеин	27,62±0,81*	100	19,65±0,35	100	22,02±1,21	100
белок	23,35±0,60*	85,19	16,02±0,31	80,89	20,29±1,16*	92,05
соотношение Nбелк./Nнебелк	-	5,75	-	4,23	-	11,58

*- различия достоверны при р ≤ 0,05; ** - сертификат соответствия №РОСС RU. АЕ67.С00011

Предшественниками белков являются аминокислоты, короткоцепочечные пептиды, поэтому содержание растворимых форм азота в процессе созревания семени снижается. Как показано в табл.1, минимальное количество небелкового азота содержится в семенах льна-долгунца № РОСС RU. AE.67.C00011 и составляет около 8% от общего азота, что свидетельствует о его зрелости.

Проведенные исследования показали, что содержание белка в льняных жмыхах колеблется от 30 до 37%, что в 1,4 раза превышает его содержание в семенах. Поэтому льняные жмыхи являются более перспективным сырьем в сравнении с семенами. Содержание белкового азота в льняных жмыхах выше, чем в семенах, и составляет соответственно 87% в сравнении с 81% в семенах. Более высокое количество белкового и общего азота в льняных жмыхах объяснимо с позиций сбора льна на масло и на волокно. Семена льна-долгунца, как правило, собираются в фазу ранней желтой спелости, так как волокно в этот период отличается наилучшими качественными показателями. Семена масличного льна собираются в фазе полной спелости, когда запас питательных веществ в них масла и белка максимален.

Таблица 2

Биохимический состав и содержание различных форм азота в жмыхах различных областей

показатели	пензенский жмых	ставропольский жмых	костромской жмых
%, а. с.в.	%, общ. азота	%, а. с.в.	%, общ. азота	%, а. с.в.	%, общ. азота
общий азот	4,90±0,16	100	5,27±0,11*	100	5,91±0,03*	100
белковый азот	4,32±0,02	87,76	4,62±0,10*	87,43	5,29±0,02*	89,51
небелковый азот	0,60±0,02	12,24	0,66±0,01*	12,57	0,61±0,01	10,49
сырой протеин	30,59±1,56	100	32,80±0,58*	100	36,91±0,17*	100
белок	27,00±0,13	87,76	28,87±0,64*	87,43	33,06±0,13*	89,51
соотношение Nбелк./Nнебелк	-	7,17	-	6,95	-	8,53
дисахариды	3,33±0,14*	-	2,86±0,03*	-	2,23±0,032	-
гемицеллюлозы	18,01±0,12*	-	14,44±0,13*	-	13,47±0,07	-

*- различия достоверны при р ≤ 0,05