3.2. Выбор оптимального соотношения препарат : суммарные липиды для загрузки Докс в везикулы
Проводилась сравнительная оценка эффективности загрузки Докс в ТЛ с молярным соотношением компонентов мембраны DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 = 9 : 1 : 0,2 : 0,02 и разными весовыми соотношениями препарат : суммарные липиды, а также оценка агрегационной устойчивости полученных Докс-ТЛ при комнатной температуре. Полученные результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
Включение Докс в ТЛ при разных весовых соотношениях препарат : суммарные липиды, размеры везикул и их агрегационная устойчивость
Весовое соотношение препарат : суммарные липиды | Концентрация Докс в дисперсии ТЛ, мг/мл | Включение Докс в ТЛ, % | Диаметр Докс-ТЛ, нм | Агрегационная устойчивость Докс-ТЛ, дни |
0,13:1 | 0,4 | 94,3 | 163 ± 9 | 7-8 |
0,20:1 | 0,6 | 91,9 | 158 ± 9 | 7 |
0,30:1 | 0,9 | 93,6 | 165 ± 10 | 3-4 |
0,40:1 | 1,2 | 93,5 | 170 ± 5 | 3 |
0,50:1 | 1,5 | 88,6 | 210 ± 5 | 2 |
0,60:1 | 1,8 | 86,0 | 180 ± 9 | 2 |
0,70:1 | 2,1 | 82,8 | 181 ± 10 | образование осадка в процессе загрузки Докс в ТЛ |
Как видно из табл. 2, включение Докс в ТЛ оставалось высоким при весовых соотношениях препарат : суммарные липиды от 0,13:1 до 0,70:1. Однако агрегационная устойчивость Докс-ТЛ заметно снизилась при увеличении весового соотношения препарат : суммарные липиды от 0,30:1 до 0,70:1. Поэтому для получения агрегационно устойчивого препарата с наибольшей степенью инкапсулирования Докс в везикулы рациональнее использовать весовые соотношения препарат : суммарные липиды 0,13:1 и 0,20:1.
3.3. Изучение влияния размеров ТЛ на включение Докс
Размер везикул определяет их поведение в живых системах, а также влияет на стабильность липосомальных препаратов во время хранения. В данном исследовании изучали влияние размеров ТЛ на включение в них Докс. Наблюдения проводили в течение трех суток после получения термолипосомальной дисперсии с препаратом.
Результаты оценки эффективности инкапсулирования Докс в ТЛ-200, полученные после экструзии через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм, и ТЛ-100, полученные после последовательной экструзии через мембраны с размером пор 200 нм и 100 нм, представлены в табл. 3.
Как видно из табл. 3, включение Докс в свежеприготовленные ТЛ-200 и ТЛ-100 было довольно высоким (от 86 % до 89 %). На вторые и третьи сутки после приготовления включение препарата в ТЛ-200 увеличилось на 3,0 % и 4,0 % соответственно. В то же время, включение Докс в ТЛ-100 на вторые и третьи сутки уменьшилось на 1,2 % и 2,6 % соответственно. Исходя из этих данных, предположили, что Докс вытекает из более мелких везикул с течением времени. Таким образом, для получения стабильного препарата с наибольшей степенью инкапсулирования Докс в ТЛ экструзию ТЛ рациональнее проводить через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 200 нм.
Таблица 3
Размеры везикул и включение Докс в ТЛ-200 и ТЛ-100
ТЛ | Первые сутки | Вторые сутки | Третьи сутки | |||
Размер Докс-ТЛ, нм | Включение Докс в ТЛ, % | Размер Докс-ТЛ, нм | Включение Докс в ТЛ, % | Размер Докс-ТЛ, нм | Включение Докс в ТЛ, % | |
ТЛ-200 | 159 ± 8 | 89,3 | 160 ± 7 | 92,3 | 162 ± 7 | 93,3 |
ТЛ-100 | 124 ± 5 | 88,7 | 125 ± 4 | 87,5 | 129 ± 7 | 86,1 |
3.4. Выбор оптимального криопротектора для замораживания и лиофилизации термолипосомального Докс
Изучалось влияние различных криопротекторов на включение Докс в свежеприготовленные, замороженные и лиофилизированные ТЛ, а также на размеры везикул. Полученные результаты представлены в табл. 4.
Таблица 4
Размеры везикул и эффективность включения Докс в свежеприготовленные, замороженные, лиофилизированные ТЛ
Криопротектор | Свежеприготовленные Докс-ТЛ | Докс-ТЛ после замораживания | Докс-ТЛ после лиофилизации | |||
Диаметр везикул, нм | Включение Докс в ТЛ, % | Диаметр везикул, нм | Включение Докс в ТЛ, % | Диаметр везикул, нм | Включение Докс в ТЛ, % | |
2 % сахароза | 150-160 | 90 | 150-165 | 70 | 165-173 | 49 |
4 % сахароза | 164-173 | 87 | 165-185 | 86 | 165-175 | 74 |
10 % сахароза | 175-189 | 94-95 | – | – | 184-192 | 52-53 |
3,7 % сахароза + + 0,4 % коллидон | 160-176 | 95 | – | – | 160-170 | 77 |
1,9 % сахароза + + 1,3 % мочевина | 156-170 | 86 | 153-170 | 59 | 154-400 | 52 |
3 % декстран 10 000 | 150-156 | 67-70 | 165-400 | агрегация Докс-ТЛ | 192-600 | агрегация Докс-ТЛ |
4 % глюкоза | 164-177 | 75 | 155-170 | 68 | 164-174 | 47 |
2 % ПЭГ 2000 | 147-157 | 77 | 148-155 | 57 | 185-900, до 1900 | агрегация Докс-ТЛ |
2 % сахароза + + 1 % декстран 40 000 | 150-170 | 80 | 140-153 | 62 | 154-167 | 27 |
2 % сахароза + + 1 % ПЭГ 2000 | 152-168 | 74 | – | – | 185-194 | 45 |
Из табл. 4 видно, что разные криопротекторы и формообразователи (коллидон) влияли на эффективность инкапсулирования Докс в ТЛ до лиофилизации и особенно после лиофилизации, а также на размеры везикул. После замораживания и лиофилизации наименьшее количество Докс вытекало из ТЛ с 4 % раствором сахарозы, поэтому данный криопротектор был выбран как оптимальный для замораживания и лиофилизации термолипосомального препарата.
4. Разработка режима лиофилизации Докс-ТЛ
Для стабилизации Докс-ТЛ в процессе хранения разрабатывали методику их лиофилизации, при этом исследовали разные режимы замораживания и сублимационной сушки препарата. Оценку влияния способа замораживания и сублимационной сушки термолипосомальной дисперсии на качество готового продукта проводили по таким критериям, как внешний вид лекарственной формы, остаточная влажность, размеры везикул и включение Докс в ТЛ.
На основании проведенных исследований выбрали постепенное замораживание полок сублимационной камеры Minifast DO.2 (Edwards, Великобритания) от +20 °C до −50 °C и постепенное замораживание препарата на полках до −40…−45 °C с выдержкой при данной температуре в течение 3 ч. Продолжительность замораживания составляла 6-8 ч. Изучение стабильности дисперсии при низкой температуре показало возможность краткосрочного замораживания и хранения препарата при температуре −18 °C.
В процессе масштабирования технологии получения термолипосомальной лекарственной формы Докс провели 15 сушек, при этом исследовали режимы сублимационной сушки с разным временем выдержки препарата при низкой температуре, с разной скоростью и продолжительностью сушки, а также различной температурой и продолжительностью досушивания продукта. Установили, что уменьшение температуры досушивания препарата с +20 °C до +15 °C не влияет на основные показатели качества лекарственной формы, поэтому в дальнейшем досушивание проводили при температуре +20 °C в течение 3 ч. После всех сублимационных сушек отмечали снижение эффективности инкапсулирования Докс в ТЛ на ~ 8-19 %. В наименьшей степени препарат вытекал из везикул при использовании следующего режима: постепенный нагрев полок от −50…−55 °C до 0 °C со скоростью 4-5 °C/ч, а затем нагрев от 0 °C до +20 °C со скоростью 5-6 °C/ч. Данный режим сублимационной сушки выбрали как оптимальный для получения лиофилизированного термолипосомального Докс.
Изучение влияния различных физико-химических факторов на включение Докс в лиофилизированные ТЛ показало, что после сублимационной сушки из ТЛ вытекало до 19 % Докс независимо от растворителей, использовавшихся для регидратации лиофилизата, pH растворителя, времени регидратации, а также буферов для получения исходной термолипосомальной дисперсии. Размеры частиц в процессе сушки и последующей регидратации лиофилизата соответствующим растворителем практически не менялись. В дальнейшем для регидратации лиофилизата выбрали 5 % изотонический раствор глюкозы как наиболее подходящий растворитель.
5. Стандартизация лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы Докс
Согласно требованиям ГФ XI к препаратам для инъекций выбрали следующие критерии качества лиофилизированной термолипосомальной лекарственной формы Докс: описание, растворимость (регидратация) и время растворения в растворителе для инъекций, подлинность, средняя масса содержимого флакона, размер везикул, pH, потеря в массе при высушивании, количественное определение и однородность дозирования. На основе данных критериев разработали проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и провели контроль качества шести наработанных серий препарата ( 150408) по выбранным критериям. Эти серии заложили на хранение при температуре −18 °C для установления срока годности. Результаты анализа лекарственной формы через полгода и один год хранения представлены в табл. 5.
Из табл. 5 видно, что после одного года хранения в морозильной камере при температуре −18 °C серии 140208 и 150408 препарата полностью соответствовали критериям и параметрам качества, указанным в ФСП. Серия 091007 не соответствовала требованиям ФСП по критерию потеря в массе при высушивании, которая через год увеличилась на 1,59 %. Серия 071007 препарата не соответствовала требованиям ФСП по критериям потеря в массе при высушивании, которая увеличилась на 1,64 %, и средняя масса содержимого флакона (0,100 г вместо 0,088-0,098 г по ФСП). Серия 081007 после одного года хранения при температуре −18 °C соответствовала требованиям ФСП по всем критериям качества, хотя потеря в массе при высушивании в данном случае увеличилась на 1,36 %.
Таким образом, срок годности серий 081007 и 091007 препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» составил полгода, а серий 140208 и 150408 – один год. Химико-фармацевтические исследования срока годности серий 140208 и 150408 препарата продолжаются.
Таблица 5
Результаты оценки качества препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг»
Критерии качества | Пределы по ФСП | Срок хранения | Серия препарата | |||||
071007 | 081007 | 091007 | 130108 | 140208 | 150408 | |||
Описание | Сухая пористая масса красновато-розового цвета. | |||||||
Растворимость (регидратация) | Образование термолипосомальной дисперсии красновато-розового цвета после добавления к содержимому флакона 2 мл 5 % глюкозы и интенсивного встряхивания в течение 2 мин. | |||||||
Подлинность | Наличие в электронном спектре поглощения спиртового раствора Докс-ТЛ характеристических максимумов при длинах волн: 232 ± 2 нм, 252 ± 2 нм, 288 ± 2 нм, 480 ± 2 нм, 498 ± 2 нм, 530 ± 2 нм. Докс, липиды и сахарозу в составе лекарственной формы определяли с помощью ТСХ, при этом на хроматограммах отсутствовали дополнительные пятна, указывавшие на присутствие продуктов деградации. | |||||||
Средняя масса содержимого флакона, г | 0,088-0,098 | 0 | 0,096 | 0,093 | 0,095 | 0,095 | 0,096 | 0,094 |
0,5 года | 0,098 | 0,094 | 0,096 | 0,095 | 0,096 | 0,094 | ||
1 год | 0,100 | 0,094 | 0,098 | 0,095 | 0,096 | 0,095 | ||
Диаметр Докс-ТЛ, нм | Не более 250 | 0 | 171 ± 6 | 178 ± 9 | 176 ± 10 | 172 ± 5 | 172 ± 5 | 160 ± 9 |
0,5 года | 170 ± 5 | 178 ± 9 | 176 ± 10 | 172 ± 5 | 172 ± 5 | 160 ± 9 | ||
1 год | 181 ± 8 | 189 ± 8 | 189 ± 7 | 169 ± 6 | 178 ± 9 | 165 ± 9 | ||
pH | 7,30-7,80 | 0 | 7,55 | 7,62 | 7,60 | 7,65 | 7,69 | 7,58 |
0,5 года | 7,74 | 7,74 | 7,66 | 7,65 | 7,69 | 7,60 | ||
1 год | 7,56 | 7,77 | 7,68 | 7,72 | 7,62 | 7,66 | ||
Потеря в массе при высушивании, % | Не более 3,0 | 0 | 1,47 | 1,44 | 1,44 | 1,67 | 1,31 | 1,15 |
0,5 года | 2,14 | 2,03 | 1,55 | 1,67 | 1,31 | 1,17 | ||
1 год | 3,11 | 2,80 | 3,03 | 1,65 | 1,35 | 1,74 | ||
Содержание Докс, мг | 0,60-0,80 | 0 | 0,76 | 0,76 | 0,77 | 0,78 | 0,78 | 0,77 |
0,5 года | 0,77 | 0,76 | 0,77 | 0,78 | 0,78 | 0,77 | ||
1 год | 0,76 | 0,76 | 0,76 | 0,77 | 0,78 | 0,78 | ||
Однородность дозирования, % | 85-115 | 0 | 108 | 108 | 110 | 112 | 111 | 111 |
0,5 года | 110 | 108 | 110 | 111 | 112 | 111 | ||
1 год | 109 | 108 | 109 | 110 | 112 | 111 |
6. Изучение биологической активности Докс-ТЛ в сочетании с ГТ
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 |
