Создание и биофармацевтическое обоснование термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина (стр. 3 )

6.1. Изучение биологической активности Докс-ТЛ на клетках in vitro

Результаты оценки действия свободного Докс, пустых ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ на клетки меланомы B-16 in vitro представлены на рис. 7. Видно, что при 42,5 °C Докс высвобождался из ТЛ в среду и вызывал значительное повреждение и гибель клеток.

Рис. 7. Выживаемость клеток меланомы B-16. Инкубация (t = 1 ч при 37 °C и 42,5 °C) в присутствии свободного Докс и Докс-ТЛ трех стандартных серий. Данные оценены по отношению к контролю при 37 °C.
1 – ТЛ серии 071 °C) 2 – Докс (37 °C) 3 – Докс-ТЛ серии 071 °C) 4 – Докс-ТЛ серии 081 °C) 5 – Докс-ТЛ серии 091 °C)	6 – ТЛ серии 071,5 °C) 7 – Докс (42,5 °C) 8 – Докс-ТЛ серии 071,5 °C) 9 – Докс-ТЛ серии 081,5 °C) 10 – Докс-ТЛ серии 091,5 °C)

При воздействии свободного Докс, ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ в дозе 10 мкг/мл на клетки V-79 китайского хомячка также наблюдали усиление степени повреждения клеток термолипосомальным Докс в сочетании с ГТ. После прогревания клеток с Докс-ТЛ их выживаемость снизилась в 3 раза.

Из результатов биологических экспериментов in vitro следует, что пустые ТЛ не обладают цитотоксическим действием. Инкапсулирование Докс в везикулы снижает его цитотоксичность при физиологической температуре. Под влиянием ГТ Докс высвобождается из ТЛ и оказывает заметный угнетающий эффект на рост клеток.

6.2. Изучение биологической активности Докс-ТЛ in vivo

В исследовании на меланоме B-16 наименьшую скорость роста опухоли наблюдали в группе животных, которым провели сеанс ГТ на фоне введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг. Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ на меланоме B-16 представлена в табл. 6. Из табл. 6 видно, что противоопухолевая активность Докс-ТЛ (9 мг/кг) в сочетании с ГТ оказалась выше, чем противоопухолевая активность Докс-ТЛ (9 мг/кг) и ГТ, используемых в монотерапии. Наибольшая выживаемость наблюдалась у животных, которым ввели Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг + ГТ.

Таблица 6

Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ на меланоме B-16

Группы животных	ТРО, %
Дни после окончания лечения
1	3	7	12	14
1	Докс (9 мг/кг)	15	39	44	46	53
2	Докс-ТЛ (4,5 мг/кг)	11	29	3	23	23
3	Докс-ТЛ (9 мг/кг)	15	39	13	25	27
4	ГТ	25	58	64 *	67 *	73 *
5	Докс (9 мг/кг) + ГТ	30	66	78 *	79 *	75 *
6	Докс-ТЛ (4,5 мг/кг) + ГТ	30	65	90 *	89 *	88 *
7	Докс-ТЛ (9 мг/кг) + ГТ	35	72	91 *, **	96 *, **	96 *, **

Примечания: * p < 0,05 по отношению к контролю;

** p < 0,05 по отношению к ГТ и Докс (9 мг/кг) + ГТ.

В исследовании на карциноме Эрлиха линии ELD наименьшую скорость роста опухоли наблюдали в группе мышей, которым провели ГТ спустя 15-20 мин после введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг. Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг на карциноме Эрлиха линии ELD представлена в табл. 7. Как видно из табл. 7, торможение роста карциномы Эрлиха при воздействии ГТ спустя 15-20 мин после введения Докс-ТЛ было статистически достоверно выше, чем при воздействии ГТ спустя 15-20 мин после введения свободного Докс, за счет большей избирательности действия Докс-ТЛ. Кроме того, выявлена более низкая терапевтическая эффективность при воздействии ГТ через 10-12 мин и 35-40 мин после введения Докс-ТЛ. Наибольшую выживаемость наблюдали в группе животных, которым провели сеанс ГТ через 15-20 мин после введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг.

Таким образом, оптимальный интервал между введением Докс-ТЛ и началом сеанса ГТ в проведенном исследовании составил 15-20 мин.

Таблица 7

Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг на карциноме Эрлиха линии ELD

Группы животных	ТРО, %
Дни после окончания лечения
1	4	7	9	14	15
1	Докс-ТЛ	+2 ♦	+9 ♦	+1 ♦	+15 ♦	+9 ♦	+32 ♦
2	ГТ	14	46	54 *	60 *	66 *	62
3	Докс + ГТ через 15-20 мин	17	54	64 *	68 *	63 *	56
4	Докс-ТЛ + ГТ через 10-12 мин	19	58	69 *	71 *	58 *	49
5	Докс-ТЛ + ГТ через 15-20 мин	27	72	85 *, **	86 *, **	84 *, **	80
6	Докс-ТЛ + ГТ через 35-40 мин	23	67	77 *	80 *	77 *	74

Примечания: ♦ знак «+» означает стимуляцию роста опухоли;

* p < 0,05 по отношению к контролю;

** p < 0,05 по отношению к ГТ и Докс + ГТ через 15-20 мин.

По результатам биологических экспериментов in vivo можно заключить, что пустые ТЛ не обладают токсическим действием, а инкапсулирование Докс в ТЛ не повышает его токсичность. Лиофилизированный термолипосомальный Докс в дозе 9 мг/кг в комбинации с ГТ вызывает более высокий терапевтический эффект, чем свободный Докс в тех же условиях.

ВЫВОДЫ

1.  Установлен оптимальный состав термолипосомальной мембраны – дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) : дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) : холе-стерин (Chol) : дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) : α-токоферола ацетат (α-TA) = 9:1:0,2:0,02:0,2 с весовым соотношением препарат : суммарные липиды – 0,13-0,20 : 1. Масштабирована технология получения водной дисперсии термолипосомального доксорубицина с размером частиц 170 ± 20 нм и эффективностью инкапсулирования препарата в свежеприготовленные везикулы – 87-94 %.

2.  Разработана методика очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося доксорубицина на хроматографической колонке для оценки эффективности инкапсулирования цитостатика в везикулы.

3.  Для стабилизации дисперсии термолипосомального доксорубицина в процессе хранения разработан режим ее лиофилизации с криопротектором – 4 % раствором сахарозы.

4.  Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином, определена их чувствительность и воспроизводимость, в том числе:

−  спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме с использованием РСО доксорубицина при длине волны 252 ± 2 нм;

−  хроматографическое определение доксорубицина, липидов и сахарозы в составе лекарственной формы.

Для качественного анализа термолипосомального препарата методом ТСХ предложены следующие системы растворителей: хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2) для определения липидов и доксорубицина; 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) или изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4) для определения сахарозы.

5.  Выбраны критерии качества лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата в хранении при температуре −18 °C в течение одного года, исследования продолжаются.

6.  В доклинических испытаниях показано, что «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.  , , Оборотова включения доксорубицина в термочувствительные стерически стабилизированные липосомы // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 1 (6). – С. 74.

2.  , , Оборотова термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 1 (6). – С. 78.

3.  , , Тарасова оптимального состава термочувствительных стерически стабилизированных липосом // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 1 (6). – С. 78.

4.  , Оборотова и стандартизация термочувствительной стерически стабилизированной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (20 апреля 2007 г., Москва). М.: Журнал РАСМИРБИ. – 2007. – № 2 (22). – С. 58.

5.  , , Оборотова и стандартизация лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Тезисы VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (26-27 апреля 2007 г., Киев). Киев. – 2007. – С. 76.

6.  , , Тарасова растворителей на регидратацию лиофилизированных термолипосом с доксорубицином // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (17-19 марта 2008 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 1 (7). – С. 32.

7.  , , Тарасова замораживания термочувствительных липосом с доксорубицином // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (17-19 марта 2008 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 1 (7). – С. 32.

8.  , , Оборотова липосомальная форма доксорубицина // Материалы VII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (25 апреля 2008 г., Москва). М.: Журнал РАСМИРБИ. – 2008. – № 2 (25). – С. 37-38.

9.  , , Вайнсон А. А., , Барышников эффект включенного в термолипосомы доксорубицина в условиях гипертермии. – М.: Медицинская радиология и радиационная безопасность. – 2008. – № 4 (53). – С. 7-12.

10.  , Оборотова доставка препаратов в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии. – М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 3 (7). – С. 4-12.

11.  , , Вайнсон А. А., , Барышников и изучение противоопухолевой активности термолипосомального доксорубицина // Материалы XII Российского онкологического конгресса (18-20 ноября 2008 г., Москва). М.: Издательская группа ГУ РОНЦ им. РАМН. – 2008. – С. 142.

12.  , Оборотова подходы к использованию термочувствительных липосом и локальной гипертермии. – М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 4 (7). – С. 71-79.

13.  , , Барышников  биологической активности термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина in vitro и in vivo // Тезисы докладов 3-го съезда токсикологов России (2-5 декабря 2008 г., Москва). М.: М-во здравоохранения и соц. развития Российской Федерации [и др.]. – 2008. – С. 530-531.

14.  , , Вайнсон А. А., , Барышников доставка доксорубицина в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии // Rusnanotech Международный форум по нанотехнологиям: Сборник тезисов докладов научно-технологических секций (3-5 декабря 2008 г., Москва). – 2008. – Т. 2. – С. 420-422.

15.  , , Оборотова получения и анализ термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина. – М.: Химико-фармацевтический журнал. – 2008. – Том 42, № 12. – С. 30-35.

16.  , , Барышников противоопухолевой активности доксорубицина с помощью термочувствительных липосом // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 11-12.

17.  , , Оборотова оптимального соотношения препарат/липиды для загрузки доксорубицина в термолипосомы // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 11.

18.  , , Оборотова влияния криопротекторов на включение доксорубицина в термочувствительные липосомы // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 11.

19.  , , Вайнсон А. А., , Барышников исследования термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина. – М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 40-47.

20.  , , Оборотова качества термозависимой лиофилизированной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 2 (8). – С. 48.

21.  , , Оборотова метода тонкослойной хроматографии для определения фосфолипидов и доксорубицина в термозависимой липосомальной лекарственной форме // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 2 (8). – С. 50.

22.  , , Оборотова размеров термолипосом на включение доксорубицина // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 2 (8). – С. 49.

23.  , , Оборотова Н. А., Барышников термочувствительных липосом и локальной гипертермии для доставки доксорубицина в опухоль // Материалы IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск). Томск: Сибирский онкологический журнал. – 2009. – Приложение . – С. 190-191.

24.  , , Барышников оценка действия доксорубицина, инкапсулированного в термолипосомы, и свободного доксорубицина на солидные опухоли в условиях локального прогревания // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск). Томск: Сибирский онкологический журнал. – 2009. – Приложение . – С. 189-190.

25.  , , Вайнсон А. А., , Барышников противоопухолевой активности термолипосомального доксорубицина и свободного доксорубицина in vivo // Материалы XIII Российского онкологического конгресса (17-19 ноября 2009 г., Москва). М.: Издательская группа ГУ РОНЦ им. РАМН. – 2009. – С. 258-259.

26.  Tazina E. V., Polozkova A. P., Orlova O. L., Ignatieva E. V., Mescherikova V. V., Wainson A., Yarmonenko S. P., Oborotova N. A. Preparation and investigation of biological activity of thermosensitive liposomes loaded with doxorubicin // Technical Proceedings of the 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA). – 2008. – Vol. 2. – P. 53-56.

27.  Tazina E. V., Ignatieva E. V., Orlova O. L., Mescherikova V. V., Wainson A., Oborotova N. A., Baryshnikov A. Yu. Doxorubicin-encapsulated thermosensitive liposomes // The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia). SPb.: Publishing House of Politechnical University. – 2008. – P. 177-178.

28.  Tazina E. V., Ignatieva E. V., Polozkova A. P., Orlova O. L., Mescherikova V. V., Wainson A. A., Oborotova N. A., Baryshnikov А. Yu. Controlled delivery of doxorubicin to tumor by thermosensitive liposomes and local hyperthermia // Rusnanotech 2008. Nanotechnology International Forum: Abstracts of Scientific and Technological Sections (December 3-5, 2008, Moscow, Russia). – 2008. – Vol. 2. – P. 311-313.

29.  Tazina E. V., Polozkova A. P., Ignatieva E. V., Orlova O. L., Mescherikova V. V., Wainson A. A., Oborotova N. A., Baryshnikov A. Yu.: Delivery of Doxorubicin to Solid Tumors using Thermosensitive Liposomes, in Advances in Material Design for Regenerative Medicine, Drug Delivery, and Targeting/Imaging, edited by V. Prasad Shastri, A. Lendlein, L-S. Liu, S. Mitragotri, A. Mikos (Mater. Res. Soc. Symp. Proc. Volume 1140E, Warrendale, PA, 2009). Paper number 1140-HH13-14, P.1-6.

30.  Tazina E. V., Polozkova A. P., Ignatieva E. V., Orlova O. L., Mescherikova V. V., Wainson A. A., Oborotova N. A., Baryshnikov А. Yu. Nanostructural thermosensitive liposomal form of doxorubicin // Rusnanotech 2009. Nanotechnology International Forum: Abstracts of The Second International Competition of Scientific Papers in Nanotechnology for Young Researchers (October 6-8, 2009, Moscow, Russia). – 2009. – P. 816-818.