Создание и биофармацевтическое обоснование термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина (стр. 1 )

На правах рукописи

СОЗДАНИЕ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ

ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА

14.04.01 – технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Учреждения Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени РАМН (РОНЦ им. РАМН).

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук,

профессор

доктор медицинских наук,

профессор

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор

доктор фармацевтических наук,

профессор

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии имени РАМН

Защита диссертации состоится «____» ________________ 2010 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени Росздрава г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГОУ ВПО ММА им. Росздрава г. Москва, Нахимовский проспект.

Автореферат разослан «____» _______________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09

доктор фармацевтических наук,

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Антрациклиновый антибиотик доксорубицин обладает высокой противоопухолевой и противолейкозной активностью при низкой избирательности действия. Одной из характерных токсикологических особенностей препарата является кардиотоксичность. Включение цитостатика в липосомы позволяет оптимизировать его противоопухолевый эффект. В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке присутствует несколько липосомальных форм доксорубицина: Доксил®, Келикс®, в состав которых входит полиэтиленгликоль (ПЭГ), защищающий липосомы от обнаружения и захвата фагоцитарной системой, поэтому ПЭГ-липосомы позволяют поддерживать более высокую концентрацию доксорубицина в крови в течение длительного времени.

С целью увеличения избирательности противоопухолевого действия доксорубицина актуальны исследования по созданию термочувствительных липосом, используемых в комбинации с локальной гипертермией. Термолипосомы высвобождают цитостатик в процессе нагревания опухоли до температуры 40-43 °C. При этой температуре в липосомальной мембране образуются поры, через которые инкапсулированный доксорубицин проникает в окружающее пространство. Новый препарат ThermoDox®, созданный компанией Celsion Corporation совместно с Duke University (США), в сочетании с высокочастотной аблацией проходит III фазу клинических испытаний при гепатоцеллюлярном раке, а с нагревом токами сверхвысокой частоты (СВЧ-нагревом) – I-II фазы клинических испытаний при рецидивирующем раке молочной железы.

В РОНЦ им. РАМН совместно с МИТХТ им. разработана модель термолипосомального доксорубицина, однако ее существенным недостатком изначально являлась невысокая эффективность инкапсулирования цитостатика в везикулы, для увеличения которой потребовалась модификация технологии получения лекарственной формы. Данная работа посвящена оптимизации состава, технологии производства и разработке методов анализа термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина.

Цель и задачи исследования. Получение термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина для увеличения селективности доставки препарата в опухоль.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1.  Оптимизировать технологию получения термолипосомального доксорубицина с высокой степенью загрузки цитостатика в везикулы: выбрать подходящий состав термолипосомальной мембраны и соотношение препарат : суммарные липиды.

2.  Разработать методику очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося цитостатика.

3.  Подобрать криопротектор, разработать режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина и наработать лиофилизированный препарат в количестве, достаточном для проведения химико-фармацевтических и биологических исследований.

4.  Разработать методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином.

5.  Выбрать критерии качества готового препарата, провести его стандартизацию и изучить стабильность в процессе хранения.

6.  Провести оценку биологической активности лиофилизированного термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.

Научная новизна исследования. Разработан состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина. Изучено влияние различных криопротекторов на стабильность термолипосом с доксорубицином до и после лиофилизации, а также в процессе замораживания до температуры –18 °C. Разработан режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина. Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином. Выбраны критерии и параметры качества лиофилизированного термолипосомального доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг». Показана стабильность лекарственной формы в процессе хранения в течение одного года при температуре −18 °C. В биологических экспериментах показано, что термолипосомальный препарат в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования. Создана новая термочувствительная липосомальная лекарственная форма высокоактивного противоопухолевого антибиотика доксорубицина для использования в комбинации с локальной гипертермией. В экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo выявлено преимущество новой лекарственной формы перед субстанцией доксорубицина. Разработан проект ФСП, в соответствии с которым проведена стандартизация препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг».

В РФ в настоящее время липосомальные лекарственные формы не производятся. Разработка и производство собственного высокоэффективного препарата для лечения онкологических больных позволит расширить его доступность для широкого круга отечественных пациентов, повысив тем самым лекарственную безопасность страны.

Внедрено в учебный процесс методическое пособие «Липосомальные формы лекарственных препаратов» для системы послевузовского профессионального образования провизоров.

Апробация работы. Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: VI, VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (24-26 марта 2007 г., 17-19 марта 2008 г. и 21-22 апреля 2009 г., Москва); VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (26-27 апреля 2007 г., Киев); The 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show, NSTI Nanotech 2008, 11th Annual Conference (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies, NanoBio 2June 2008, Saint-Petersburg, Russia); XII и XIII Российском онкологическом конгрессе (18-20 ноября 2008 г. и 17-19 ноября 2009 г., Москва); The 2008 Materials Research Society (MRS) Fall Meeting (December 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); III съезде токсикологов России (2-5 декабря 2008 г., Москва); Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2008 и Rusnanotech 2декабря 2008 г. и 6-8 октября 2009 г., Москва); Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (18-19 февраля 2009 г., Москва); IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск); Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск).

Апробация диссертационной работы прошла 28 сентября 2009 г. в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 5 статей, 5 тезисов докладов на английском языке и 20 тезисов на русском языке.

Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО РОНЦ им. РАМН по теме: «Разработка и создание новых лекарственных форм для медицинской промышленности» (№ гос. регистрации 01.200.316267), а также в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на гг.

Положения, выносимые на защиту:

1.  Состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина.

2.  Методики химико-фармацевтического анализа: спектрофотометрическое определение содержания доксорубицина в лекарственной форме и хроматографическое определение компонентов лекарственной формы.

3.  Результаты контроля качества шести наработанных серий препарата и изучения их стабильности в процессе хранения при температуре −18 °C.

4.  Результаты оценки эффективности действия термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав результатов собственных исследований, общего заключения, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 244 страницах машинописного текста, содержит 92 рисунка и 54 таблицы. Библиографический список включает 318 наименований, в том числе 278 – на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

1. Получение термолипосом с инкапсулированным доксорубицином (Докс-ТЛ)

В результате проведенных экспериментов разработаны следующие прописи Докс-ТЛ:

Пропись 1 на 40 мл:		Пропись 2 на 40 мл:
Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC)	105,28 мг	Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC)	103,98 мг
Дистеароилфосфатидилхолин (DSPC)	12,60 мг	Дистеароилфосфатидилхолин (DSPC)	12,44 мг
Дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000)	0,90 мг	Дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000)	0,88 мг
Холестерин (Chol)	1,24 мг	Холестерин (Chol)	1,22 мг
		α-токоферола ацетат (α-TA)	1,48 мг
	120 мг		120 мг
Доксорубицин	16 мг	Доксорубицин	16 мг

Молярные соотношения компонентов термолипосомальной мембраны:

Пропись 1 – DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 = 9 : 1 : 0,2 : 0,02;

Пропись 2 – DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 : α-TA = 9 : 1 : 0,2 : 0,02 : 0,2.

Весовое соотношение препарат : суммарные липиды составляло 0,13 : 1.

Для получения пустых термолипосом (ТЛ) использовали метод обращения фаз. Липиды (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), Lipoid GmbH, Германия), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевая соль (DSPE-PEG-2000) и холестерин (Avanti Polar Lipids, Inc., США) растворяли в хлороформе. В случае прописи 2 с целью предотвращения окисления липидов добавляли α-токоферола ацетат. Органический растворитель упаривали под вакуумом до образования липидной пленки. Высушенную липидную пленку гидратировали раствором сульфата аммония при постоянном перемешивании и нагревании до 50 °C. Образовавшуюся дисперсию мультиламеллярных везикул (МЛВ) экструдировали через поликарбонатные мембраны Nuclepore (Whatman, Великобритания) с размером пор 200 нм при температуре 50 °C с помощью мини-экструдера Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США). Доксорубицин (Докс), (Россия) загружали в ТЛ против градиента сульфата аммония. Градиент концентрации сульфата аммония формировался при двадцатикратном разбавлении термолипосомальной дисперсии 10 мМ буфером HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота), AppliChem GmbH (Германия) с криопротектором – 4 % сахарозой (pH 8,4).

Свежеприготовленную дисперсию Докс-ТЛ подвергали стерилизующей фильтрации под давлением через нейлоновые мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,22 мкм (Pall Corporation, США). Для стабилизации Докс-ТЛ проводили их сублимационную сушку. Анализ среднего диаметра везикул и оценку их распределения по размерам проводили с использованием метода корреляционной спектроскопии светорассеяния (динамического лазерного светорассеяния) на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США).

Рис. 1. Гель-фильтрация образцов пустых ТЛ, 10 мМ буфера HEPES с 4 % сахарозой и Докс-ТЛ.

Термолипосомальную дисперсию Докс очищали от не включившегося в везикулы препарата методом колоночной хроматографии (гель-фильтрации) с целью количественного определения содержания цитостатика в дисперсии и оценки эффективности его инкапсулирования в ТЛ. На хроматографическую колонку C 10/20, заполненную сефадексом G-50 Superfine (Amersham Biosciences, Швеция), наносили 1 мл дисперсии Докс-ТЛ. В качестве элюента использовали 0,15 М раствор хлорида натрия, скорость элюции составляла 0,3-0,4 мл/мин. Процесс очистки контролировали с помощью детектора UVis-920 и рекордера REC 111 (Amersham Biosciences, Швеция), фиксировавшего разделение в виде пиков. На выходе из колонки получали три фракции (рис. 1): I фракция – очищенный термолипосомальный Докс (первый пик на рис. 1), II фракция – буфер HEPES с 4 % сахарозой (второй пик на рис. 1); III фракция – не включившийся в везикулы Докс (третий пик на рис. 1). Видно, что термолипосомальный Докс начинал сходить через 16-20 мин после нанесения на колонку, 10 мМ буфер HEPES с 4 % сахарозой выходил спустя 39-42 мин, а не включившийся в везикулы Докс – через 59-60 мин. Процесс гель-фильтрации термолипосомального Докс в целом занимал около 1 ч 30 мин-1 ч 40 мин.

2. Количественный анализ Докс-ТЛ

Содержание Докс в ТЛ определяли методом спектрофотометрии с использованием рабочего стандартного образца (РСО) Докс при длине волны 252 ± 2 нм. Измерение оптической плотности спиртовых растворов Докс-ТЛ и РСО Докс проводили относительно 95 % этилового спирта в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм.

Содержание Докс (Х, мг) рассчитывали по формуле:

X = (1),

где D – оптическая плотность раствора образца; Do – оптическая плотность РСО Докс; C – величина разбавления образца; Co – величина разбавления РСО Докс; а – навеска РСО Докс, мг.

Эффективность включения Докс в ТЛ (B, %) вычисляли по формуле:

B = × 100 % (2),

где D1 – оптическая плотность раствора фракции с очищенным термолипосомальным Докс; D – оптическая плотность раствора исходной термолипосомальной дисперсии; C1 – величина разбавления фракции с очищенным термолипосомальным Докс; C – величина разбавления исходной термолипосомальной дисперсии; V1 – объем фракции с очищенным термолипосомальным Докс, мл; V – объем исходной термолипосомальной дисперсии, нанесенной на колонку, мл.

3. Изучение противоопухолевой активности Докс-ТЛ in vitro и in vivo

Изучение биологической активности свободного Докс и Докс-ТЛ проводили на культурах клеток меланомы В-16 мышей и V-79 китайского хомячка. Критериями активности служили снижение скорости роста клеток (оценка – по степени конверсии красителя АламарБлю, который при метаболизме в клетках меняет цвет с синего на красный) и степень сохранения ими способности к неограниченному делению (образованию макроколоний, рассматриваемому как критерий выживаемости клеток). Препараты вводили в суспензию клеток меланомы В-16 в дозах, соответствующих 1-15 мкг/мл Докс, а в суспензию клеток V-79 китайского хомячка – в дозе 10 мкг/мл Докс. Клетки с препаратами инкубировали в течение 1 ч при 37 °C или 42,5 °C.

Исследования in vivo проводили на меланоме В-16 и солидной карциноме Эрлиха линии ELD, привитых мышам в мышцу голени за 8 дней до начала эксперимента. В день опыта диаметр растущей опухоли голени составлял 7-9 мм. Каждая экспериментальная группа состояла из 6 животных, контрольная – из 8-10 животных. Свободный Докс и Докс-ТЛ вводили мышам в ретроорбитальный синус из расчета 9 мг/кг Докс и 4,5 мг/кг Докс. Локальную гипертермию (ГТ) голени с опухолью проводили в водяном ультратермостате и начинали через 20 мин после введения животным препаратов в случае меланомы В-16, а в случае карциномы Эрлиха – через 10-12 мин, 15-20 мин и 35-40 мин после введения препаратов. Продолжительность ГТ составляла 30 мин при 43 °C. Наблюдение за животными состояло в измерении габаритных размеров опухолей, которое проводили трижды в неделю в течение нескольких недель после лечения, и фиксации момента гибели животных. Динамику роста опухоли в разных группах животных рассчитывали как отношение средних габаритных объемов опухоли в день измерения (Vt) к объемам в день начала эксперимента (Vo).

Критерием оценки противоопухолевой активности препаратов служило торможение роста опухоли (ТРО, %), которое рассчитывали по формуле:

ТРО % = % (3),

где V – средний объем опухоли (мм3) в подопытной и контрольной группах соответственно, на конкретный срок.

Выживаемость животных (SA, %) в каждой группе вычисляли по формуле:

SA = % (4),

где Nd – количество выживших животных в группе на конкретный срок; No – общее количество животных в группе.

Результаты исследований

1. Разработка методики спектрофотометрического определения содержания Докс в термолипосомальной лекарственной форме

Процедура разработки спектрофотометрической методики количественного определения действующего вещества в лекарственной форме включала следующие основные этапы:

1.  Изучение спектра поглощения электромагнитного излучения действующим веществом в спиртовом растворе, определение максимумов поглощения и их интенсивности, выбор рабочей длины волны.

2.  Проверка соблюдения основного закона светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера.

3.  Выбор рабочих концентраций исследуемых растворов, при которых оптическая плотность составляет 0,2-0,7 единиц.

4.  Изучение влияния вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственной формы, на спектральные характеристики действующего вещества.

Оптическую плотность спиртовых растворов субстанции Докс и Докс-ТЛ измеряли в диапазоне длин волн от 200 нм до 600 нм. Полученные спектры поглощения показаны на рис. 2.

Рис. 2. Спектры поглощения спиртовых растворов субстанции Докс и Докс-ТЛ.

Как видно из рис. 2, спиртовые растворы субстанции Докс и Докс-ТЛ имели шесть максимумов поглощения в области от 200 нм до 600 нм при следующих длинах волн: 234 нм, 252 нм, 288 нм, 480 нм, 496 нм и 532 нм.

В качестве аналитической выбирали длину волны, на которой пик Докс был наиболее выраженным и узким. Такой пик отмечали при длине волны 252 нм.

Линейная зависимость оптической плотности для спиртового раствора субстанции Докс при 252 нм соблюдалась в интервале концентраций от 1,21 мкг/мл до 30,88 мкг/мл, а для спиртового раствора Докс-ТЛ – в диапазоне концентраций от 1,45 мкг/мл до 30,96 мкг/мл. Оптическая плотность спиртовых растворов находилась в пределах 0,2-0,7 единиц при концентрации Докс 5-16 мкг/мл.

При изучении влияния вспомогательных веществ на оптические характеристики раствора Докс установили, что вспомогательные вещества в соотношениях, соответствовавших составу лекарственной формы, практически не влияли на поглощение Докс и не мешали его спектрофотометрическому определению.

Содержание Докс в свежеприготовленной термолипосомальной дисперсии, которое рассчитывали по значениям оптической плотности, измеренной при длине волны 252 ± 2 нм, составляло 0,388 ± 0,002 мг/мл, относительная ошибка среднего результата () не превышала 0,52 %.

В процессе исследования была проведена валидация методики количественного определения содержания Докс в ТЛ по следующим характеристикам: правильность, повторяемость (сходимость), воспроизводимость, специфичность (селективность) и линейность. Для проведения градуировки методики измеряли оптическую плотность модельных смесей с разными концентрациями Докс при длине волны 252 ± 2 нм.

Результаты количественного определения Докс в модельных смесях, а также в лекарственной форме описывались линейной зависимостью y = 0,00139 + 0,04324x с коэффициентом корреляции R = 0,99927.

2. Разработка методик хроматографического определения Докс, липидов и сахарозы в составе термолипосомальной лекарственной формы

2.1. Хроматографическое определение Докс и липидов в Докс-ТЛ

Качественный анализ термолипосомального Докс методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводили в следующих системах растворителей:

−  хлороформ – метанол – вода (60:30:5), (65:25:4), (75:25:4) и (80:20:3);

−  хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (60:35:5), (60:40:1) и (65:25:4);

−  хлороформ – метанол – вода – концентрированный аммиак (90:54:5,5:5,5);

−  хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (50:25:8:4), (25:15:4:2), (60:50:1:4), (80:20:14:6) и (90:40:12:2);

−  хлороформ – ацетон – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (6:8:2:2:1).

На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil» 10 x 10 см (Россия) и «Silica gel 60 F 254» 10 x 20 см (Merck KGaA, Германия) наносили по 20 мкл образцов Докс-ТЛ и стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС). Пластину с нанесенными пробами проявляли парами йода. Пятна липидов идентифицировали по желтой или желто-коричневой окраске, а пятно Докс – по характерной красно-розовой окраске.

Методом ТСХ установили, что лиофилизированные Докс-ТЛ по составу не отличались от свежеприготовленных Докс-ТЛ и не содержали примесей или каких-либо продуктов деградации, кроме действующего и вспомогательных веществ, что служило качественной характеристикой для оценки стабильности лекарственной формы.

Во всех исследованных системах растворителей липиды (DPPC и DSPC) имели близкие значения Rf и при хроматографировании Докс-ТЛ определялись одним пятном.

Наиболее четкое разделение липидов и Докс в составе лекарственной формы наблюдали в системах растворителей хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2). Предел обнаружения липидов в указанных системах составил 1,0 мкг. Предел обнаружения Докс в системе хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) составил 1,0 мкг, а в системе хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2) – 0,5 мкг. Холестерин и DSPE-PEG-2000 содержались в термолипосомальной лекарственной форме в очень маленьких количествах, и поэтому в данных хроматографических системах не обнаруживались. Сахароза при проявлении парами йода также не давала никаких пятен на пластинках.

Наименее удачной оказалась хроматографическая система хлороформ – метанол – вода, в которой липиды и Докс в составе лекарственной формы не разделялись.

Хроматографическое определение Докс-ТЛ в системах хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2) показано на рис. 3-4.

Рис. 3. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе хлороформ – метанол – аммиак (65:25:4): 1 – Докс-ТЛ; 2 – DPPC (52 мкг); 3 – DSPC (6 мкг); 4 – Докс (7 мкг); 5 – Докс (7 мкг) + DSPC (6 мкг).	Рис. 4. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Sorbfil» в системе хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2): 1 – Докс-ТЛ; 2 – DPPC (52 мкг); 3 – DSPC (6 мкг); 4 – Докс (7 мкг); 5 – DPPC (52 мкг) + DSPC (6 мкг).

2.2. Хроматографическое определение сахарозы в Докс-ТЛ

Анализ Докс-ТЛ на наличие сахарозы проводили в системах растворителей 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) и изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4). На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil» или «Silica gel 60 F 254» наносили по 5 мкл образцов Докс-ТЛ, пустых ТЛ и СОВС. Хроматограммы проявляли раствором 1-нафтола в смеси 95 % этилового спирта и серной кислоты. Пятна сахарозы идентифицировали по сиреневой или черно-фиолетовой окраске.

Хроматографическое определение сахарозы, Докс-ТЛ и пустых ТЛ на пластинках «Sorbfil» и «Silica gel 60 F 254» в системах растворителей 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) и изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4) показано на рис. 5-6.

Рис. 5. ТСХ Докс-ТЛ и ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2): 1 – Сахароза (9,5 мкг); 2 – ТЛ (47,5 мкг); 3 – ТЛ (9,5 мкг); 4 – Докс-ТЛ (47,5 мкг); 5 – Докс-ТЛ (9,5 мкг).	Рис. 6. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4): 1 – Сахароза (19 мкг); 2 – Сахароза (9,5 мкг); 3 – Докс-ТЛ (19 мкг); 4 – Докс-ТЛ (9,5 мкг).

Как видно из рис. 5-6, в данных системах растворителей пятна Докс-ТЛ по форме и окраске соответствовали пятнам СОВС. Докс не мешал хроматографическому определению сахарозы в лекарственной форме. Предел обнаружения сахарозы в системе 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) составил около 0,5 мкг, а в системе изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4) – около 0,9 мкг.

3. Оптимизация технологии получения и состава Докс-ТЛ

3.1. Выбор оптимального липидного состава Докс-ТЛ

Для выбора оптимального липидного состава термолипосомальной мембраны изучали шесть составов ТЛ. Критериями выбора являлись: эффективности инкапсулирования Докс в ТЛ и размеры везикул. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Эффективность включения Докс в ТЛ разных составов и размеры везикул

№	Состав ТЛ	Молярное соотношение	Включение Докс в ТЛ, %	Диаметр везикул, нм
1.	DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 : α-TA	9:1:0,2:0,02:0,2	94,0	170 ± 15
2.	DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000	9:1:0,5:0,1	87,7	160 ± 9
3.	DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000	9:1:0,75:0,2	85,7	149 ± 7
4.	DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000	9:1:1:0,3	57,8	170 ± 6
5.	DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000	9:1:1,2:0,4	60,8	184 ± 10
6.	DPPC : DSPC : Chol	7:2:1	66,9	183 ± 8

Как видно из табл. 1, при увеличении количества холестерина и ПЭГ в составе термолипосомальной мембраны степень инкапсулирования Докс в везикулы снижалась, размеры частиц при этом менялись незначительно. В свежеприготовленные ТЛ, содержавшие DPPC : DSPC : Chol в молярном соотношении 7:2:1, включилось около 67 % Докс, а спустя 15 ч включение препарата увеличилось до 72,5 %. Включение Докс в везикулы, содержавшие DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 : α-TA в молярном соотношении 9:1:0,2:0,02:0,2, составило ~ 94 %. Следовательно, данный состав является наиболее оптимальным для получения термочувствительной липосомальной лекарственной формы Докс.