Анализ и стандартизация нового лекарственного препарата с анксиолитическим действием ГБ-115 (стр. 2 )

Количественное определение ГБ-115 в субстанции

Количественное определение ГБ-115 проводили методом Къельдаля по методике ГФ XII с добавлением металлического селена и растертой смеси калия сульфата и меди сульфата (в соотношении 10:1) в качестве катализаторов. Содержание ГБ-115 в образцах субстанции находилось в пределах от 98,72 до 99,84%. Результаты анализа представлены в таблице 3.

Поскольку метод определения общего азота по Къельдалю является достаточно длительным и трудоемким для рутинного анализа, нами были предприняты попытки разработки методик количественного определения субстанции ГБ-115 с помощью методов УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ, с использованием рабочего стандартного образца (РСО). В качестве РСО был выбран один из исследованных образцов ГБ-115.

Таблица 3

Результаты количественного определения образцов субстанции ГБ-115

№ серии
Количественное содержание, %	99,15	98,87	99,22	99,37	99,8
Метрологические характеристики (n=5, P=95)	S=0,37 Sхср=0,17 ∆X=0,44 ε=0,44%	S=0,26 Sхср=0,12 ∆X=0,3 ε =0,3%	S=0,41 Sхср=0,18 ∆X=0,47 ε =0,47%	S=0,32 Sхср=0,14 ∆X=0,37 ε =0,37%	S=0,3 Sхср=0,13 ∆X=0,34 ε =0,34%

В УФ-спектрах РСО ГБ-115 в этиловом спирте 95% в диапазоне длин волн от 230 до 350 нм наблюдалось два максимума поглощения при 282±2 нм и 290±2 нм, при этом наиболее выраженным являлся максимум при 282 нм. Эта длина волны и была выбрана в качестве аналитической.

Линейная зависимость величины оптической плотности от концентрации растворов ГБ-115 в спирте этиловом 95% наблюдалась в интервале от 0,02 до 0,06 мг/мл, коэффициент корреляции 0,999 (рис. 4). При концентрации 0,05 мг/мл оптическая плотность составляла около 0,65, эта концентрация была выбрана рабочей.

Рис. 4. Линейная зависимость оптической плотности ГБ-115 от концентрации (282 нм)

На модельных растворах РСО ГБ-115 с концентрацией от 0,04 до 0,06 мг/мл было показано, что относительная ошибка однократного определения количественного содержания ГБ-115 не превышала 2% (табл. 4).

Содержание ГБ-115 в серийных образцах субстанции, определенное с помощью метода УФ-спектрофотометрии, составило от 98,7 до 102%, относительная ошибка определения не превышала 2%.

Таблица 4

Результаты количественного определения РСО ГБ-115 в модельных растворах методом УФ-спектрофотометрии

Взято ГБ-115, г (m1)	Найдено ГБ-115, г (m2)	Абсолютная ошибка, г (d= m2–m1)	Относительная ошибка, % Х =(d´100/m1)	Найдено ГБ-115 (в % от m1)	Метрологические характеристики (P=95%, n=9)
0,0202	0,0198	-0,0004	1,98	98,02	= 99,60 = 1,06 = 0,35 = 0,97 = 0,98%
0,0213	0,0211	-0,0002	0,94	99,06
0,0224	0,0224	0	0	100,00
0,0239	0,0237	-0,0002	0,84	99,16
0,0251	0,0250	-0,0001	0,40	99,60
0,0264	0,0269	+0,0005	1,89	101,89
0,0275	0,0275	0	0	100,00
0,0288	0,0285	-0,0003	1,04	98,96
0,0307	0,0306	-0,0001	0,33	99,67

Разработку методики количественного определения ГБ-115 методом ВЭЖХ проводили в условиях определения посторонних примесей в субстанции ГБ-115, что гарантировало специфичность методики. Аналитическая длина волны (282 нм) соответствовала положению специфического максимума УФ-спектров растворов ГБ-115 в подвижной фазе (рис. 5).

Рис. 5. УФ-спектр раствора ГБ-115 (0,05 мг/мл) в подвижной фазе.

Линейная зависимость площади пика от концентрации растворов ГБ-115 наблюдалась в пределах интервала от 0,01 до 0,8 мг/мл (коэффициент корреляции 0,999) (рис. 6). Исходя из полученных данных, нами была выбрана рабочая концентрация растворов – 0,1 мг/мл.

Определение точности и сходимости результатов было проведено на модельных растворах РСО ГБ-115 с концентрацией от 0,08 до 0,12 мг/мл. В качестве стандартного раствора использовали раствор РСО ГБ-115 с концентрацией 0,1 мг/мл. Результаты исследований представлены в табл. 5.

Как видно по полученным данным, относительная ошибка однократного количественного определения ГБ-115 в субстанции не превышает 2,5%.

Рис. 6. Линейная зависимость площади пика ГБ-115 от концентрации в диапазоне от 0,01 до 0,8 мг/мл

По разработанной методике были проанализированы серийные образцы субстанции ГБ-115. Содержание ГБ-115 в субстанции составляло от 99,5 до 102,0% при относительной ошибке определения, не превышающей 2%.

Таким образом, нами была подтверждена возможность проведения количественного анализа субстанции ГБ-115 с помощью методов УФ-СФМ и ВЭЖХ. Несмотря на то, что относительная ошибка определения методики УФ-СФМ ниже, чем относительная ошибка методики ВЭЖХ, в качестве основной была выбрана методика ВЭЖХ из-за ее специфичности и универсальности, позволяющей проводить качественный и количественный анализ в одних и тех же условиях. Однако следует отметить, что применением методов УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ для количественного анализа субстанции ГБ-115 возможно лишь при наличии стандартного образца.

Таблица 5

Результаты количественного определения ГБ-115 в модельных растворах методом ВЭЖХ

Взято ГБ-115, г (m1)	Найдено ГБ-115, г (m2)	Абсолютная ошибка, г (d= m2–m1)	Относительная ошибка, % Х = (d´100/m1)	Найдено ГБ-115 (в % от m1)	Метрологические характеристики (P=95%, n=9)
0,0198	0,0202	+0,0004	2,02	102,02	= 100,67 = 1,76 = 0,59 = 1,35 = 1,35%
0,0215	0,0210	-0,0005	2,33	97,67
0,0229	0,0234	+0,0005	2,18	101,18
0,0236	0,0239	+0,0003	1,27	101,27
0,0251	0,0255	+0,0004	1,59	101,59
0,0271	0,0272	+0,0001	0,34	100,34
0,0274	0,0276	+0,0002	0,73	100,73
0,0289	0,0283	-0,0006	2,08	97,92
0,0302	0,0309	+0,0007	2,33	102,33

Изучение стабильности и установление сроков годности субстанции ГБ-115

Показано, что при хранении в условиях 90% относительной влажности субстанция практически не поглощает влагу, при этом качество субстанции по показателям «Внешний вид» и «Посторонние примеси» по сравнению с исходными образцами не изменяется. Субстанция ГБ-115 не гигроскопична и устойчива к действию 90% относительной влажности.

Изучение фотолитической стабильности субстанции было проведено в условиях, обеспечивающих воздействие на испытуемые образцы прямого солнечного света. Пробы были отобраны по истечении 60 дней экспозиции и оценены по показателям «Внешний вид» и «Посторонние примеси» методом ВЭЖХ. Субстанция ГБ-115 приобрела светло-коричневый цвет. На хроматограммах испытуемого раствора было обнаружено более двадцати неидентифицированных примесей (суммарное содержание около 3,6%), в их числе примесь ФГГ в содержании 0,07%. Субстанция ГБ-115 неустойчива к действию солнечного света, что необходимо учитывать при ее хранении.

Устойчивость ГБ-115 к окислителям изучали при воздействии на субстанцию ГБ-115 3 % растворов водорода пероксида. В испытуемом растворе после двух месяцев хранения наблюдалось незначительное увеличение содержания посторонних примесей. Суммарное содержание примесей в испытуемом образце составляло около 0,52%, а в контрольном – около 0,38%.

Таким образом, молекула ГБ-115 относительно устойчива к процессу окисления в условиях эксперимента.

Стабильность ГБ-115 была также изучена в 0,1 М растворах соляной кислоты и натрия гидроксида, пробы хранили при комнатной температуре в течение 1, 2 недель, 1 и 2 месяцев.

Показано, что после 2 месяцев в 0,1 М растворе HCl хроматографическая чистота ГБ-115 не изменялась, и появления дополнительных примесей не наблюдалось. Тогда как в 0,1 М NaOH дополнительные примеси начали появляться уже через неделю, что указывало на неустойчивость ГБ-115 к щелочному гидролизу. Через 2 месяца суммарное содержание примесей составило около 6,5%.

Установление сроков годности субстанции ГБ-115 было проведено методом «ускоренного старения» при температуре 60°С. Показано, что качество образцов субстанции ГБ-115 после хранения методом «ускоренного старения» в течение срока, эквивалентного 2 годам хранения в естественных условиях, по всем показателям практически не изменилось. Установлен предварительный срок годности для субстанции ГБ-года.

На основании результатов проведенных анализов были установлены нормы качества на субстанцию ГБ-115 (табл. 6).

Таблица 6

Нормы качества субстанции ГБ-115

ПОКАЗАТЕЛИ	МЕТОДЫ	НОРМЫ
Описание	Визуальный	Белый или белый с желтоватым или кремоватым оттенком кристаллический порошок без запаха
Растворимость	ГФ ХII, вып. 1, с. 92	Очень легко растворим в диметилформамиде, легко растворим в муравьиной и уксусной кислотах, мало растворим в этаноле и изопропиловом спирте, практически нерастворим в воде.
Подлинность	ИК-спектроскопия	Полосы поглощения в ИК-спектре препарата должны совпадать с полосами поглощения прилагаемого рисунка.
УФ-спектроскопия	0,05% раствор в спирте этиловом 95% в области длин волн от 250 до 350 нм должен иметь максимумы поглощения при 282±2нм и 290±2 нм
Температура плавления	ГФ ХII, вып. 1, с. 29	От 177,0 до 182,0 ºС
Прозрачность раствора	ГФ ХII, вып. 1, с. 98	Прозрачный или не более эталонного раствора I (5 % раствор в этаноле)
Цветность раствора	ГФ ХII, вып. 1, с. 93	Бесцветный или не более GY6 (5 % раствор в этаноле)
Удельное вращение	ГФ ХII, вып. 1, с. 54	От -8,5 до -10,5° (5% раствор в хлороформе)
Посторонние примеси	ВЭЖХ	Единичной примеси не более 0,5%. Суммарное содержание примесей не более 1%
Потеря в массе при высушивании	ГФ ХI, вып. 1, с. 176	Не более 0,5%
Сульфатная зола и тяжелые металлы	ГФ ХII, вып. 1, с. 115, с. 121	Не более 0,1% Не более 0,001%
Микробиологическая чистота	ГФ ХII, часть 1, с.162	Категория 2.2
Количественное определение	Метод Къельдаля ГФ XII вып. 1, с.101	От 99 до 101%
Упаковка	В соответствии с ФСП
Маркировка	В соответствии с ФСП
Хранение	В защищенном от света месте, при температуре не выше + 30°С
Срок годности	2 года

Анализ и стандартизация твердой дозированной лекарственной