Анализ и стандартизация нового лекарственного препарата с анксиолитическим действием ГБ-115 (стр. 1 )

На правах рукописи

Анализ и стандартизация нового лекарственного препарата с анксиолитическим действием ГБ-115

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени » Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Кандидат фармацевтических наук

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор, профессор

кафедры фармацевтической и токсикологической химии

фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ

имени

Кандидат фармацевтических наук, заместитель

начальника Испытательного центра экспертизы

качества лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП»

Минздравсоцразвития России

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени » Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится «18» апреля 2012 г. в__________часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени г. Москва, Трубецкая ул., строение 1, НИЦ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан « »____________2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор фармацевтических наук,

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Анксиолитики занимают особое положение среди современных психотропных препаратов в связи с оригинальной и широкой фармакологической активностью и чрезвычайной распространенностью.

Препараты с анксиолитическим действием широко используются не только в психиатрии, но и в других областях медицины, в том числе амбулаторно здоровыми людьми при эпизодических психологических трудностях, в конфликтных и экстремальных ситуациях. Их применяют в психиатрии, неврологии, хирургии, акушерстве, клинике внутренних болезней, педиатрии, дерматологии и т. д. Анксиолитики (транквилизаторы) также применяются и при лечении алкоголизма. Однако при назначении с этой целью препаратов бензодиазепинового ряда, может возникнуть бензодиазепиновая зависимость, сменяющая алкогольную. Этот факт находит свое объяснение в вовлеченности ГАМК-А - бензодиазепинового рецепторного комплекса в механизме формирования алкогольной зависимости. Поэтому поиск новых лекарственных средств с анксиолитическим действием, не являющихся лигандами к данному рецепторному комплексу, достаточно актуален.

В НИИ Фармакологии РАМН был синтезирован новый лекарственный препарат пептидной структуры с анксиолитическим действием – ГБ-115. В ходе исследований была изучена фармакологическая активность нового препарата. Установлено, что ГБ-115 является антагонистом ССК-2 рецепторов, обладает свойствами селективного анксиолитика с принципиально новым механизмом действия – модулирующим влиянием на функциональную активность холецистокининовой системы. Препарат не обладает гипноседативным, миорелаксирующим и амнезирующим эффектами. Выявлена антиалкогольная активность ГБ-115 на стадии развившейся физической зависимости. Показано, что препарат не потенцирует действие этанола.

Для внедрения препарата в медицинскую практику, наряду с фармакологическими испытаниями, необходимо разработать методы контроля его качества и стандартизации, и на их основе – нормативную документацию на субстанцию и твердую дозированную лекарственную форму – таблетки дозировкой 1 мг.

Цель исследований. Целью настоящей работы являлось изучение физико-химических свойств, спектральных и хроматографических характеристик, разработка методик фармацевтического анализа и научно-обоснованных норм качества, а также создание нормативной документации на субстанцию и лекарственную форму ГБ-115.

Задачи исследований

·  изучить физические, химические и физико-химические свойства, определить фармакопейные показатели качества субстанции и лекарственной формы ГБ-115;

·  изучить спектральные характеристики образцов субстанции ГБ-115 методами УФ-, ИК-, ЯМР1Н-спектроскопии, оценить возможность использования этих методов для подтверждения структуры и идентификации субстанции и в лекарственной форме;

·  изучить хроматографическое поведение ГБ-115 и промежуточных продуктов его синтеза с помощью тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), разработать методики определения посторонних примесей в субстанции и лекарственной форме ГБ-115; определить содержание остаточных растворителей в субстанции с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ);

·  разработать методики количественного определения ГБ-115 в субстанции и лекарственной форме;

·  изучить стабильность субстанции и лекарственной формы препарата в процессе хранения в естественных условиях и методом «ускоренного старения», а также под действием различных внешних факторов;

·  установить нормы качества субстанции и твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115.

Научная новизна. Изучены физико-химические свойства нового оригинального анксиолитика ГБ-115, а также его спектральные характеристики с использованием методов УФ-, ИК-, ЯМР1Н-спектроскопии.

Исследована хроматографическая подвижность ГБ-115 и возможных примесей методом тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, выбраны оптимальные условия хроматографирования, позволяющие добиться разделения ГБ-115 и примесей.

Показано, что применение метода кислотно-основного титрования в неводных растворителях для количественного определения субстанции ГБ-115 затруднено. Удовлетворительных результатов удалось добиться при применении для количественного определения ГБ-115 в субстанции метода определения общего азота по Къельдалю.

Впервые изучена стабильность субстанции под действием солнечного света, 90% относительной влажности воздуха, окислителей, разбавленных растворов кислот и щелочей. Показано, что препарат устойчив к условиям повышенной влажности, а также к действию разбавленных растворов неорганических кислот, и неустойчив к действию солнечного света и разбавленных растворов щелочей.

Изучены физико-химические свойства, спектральные характеристики и хроматографическая подвижность твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115, определены основные фармакопейные показатели ее качества.

Изучена стабильность субстанции и лекарственной формы ГБ-115 при хранении методом «ускоренного старения» и в естественных условиях, установлены их сроки годности.

Практическая значимость работы. Разработаны методики аналитического контроля субстанции и твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115, установлены научно-обоснованные нормы качества. Разработанные методики внедрены в опытно-технологическом отделе НИИ фармакологии имени РАМН для анализа субстанции и твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115.

Оформлены проекты ФСП на субстанцию и таблетки ГБ-115, 1 мг.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2010) и на 5-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, июнь 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, Перечня рекомендованного ВАК.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с плановой темой № гос. рег. 01.2.006.06602 «Экспериментальное изучение механизмов развития алкоголизма и наркоманий, разработка средств и методов рациональной фармакотерапии» НИИ фармакологии имени РАМН. Базой проведения исследований являлась аналитическая группа опытно-технологического отдела НИИ фармакологии РАМН.

Личный вклад автора. Экспериментальные исследования выполнены автором лично. Изучены физико-химические свойства, разработаны и валидированы методики фармацевтического анализа субстанции и лекарственной формы ГБ-115. Проведена статистическая обработка полученных результатов. Установлены научно обоснованные нормы качества изучаемого лекарственного препарата и разработаны проекты ФСП.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Основные положения, выносимые на защиту:

·  Экспериментальное обоснование возможности использования физико-химических свойств и спектральных характеристик образцов субстанции и лекарственной формы ГБ-115 в контроле их качества;

·  Результаты хроматографического анализа ГБ-115 и вероятных технологических примесей в субстанции и лекарственной форме методом обращено-фазовой ВЭЖХ;

·  Экпериментальное обоснование выбора метода Къельдаля для количественного определения ГБ-115 в субстанции и методов УФ-СФМ и ВЭЖХ для количественного анализа таблеток ГБ-115;

·  Методики качественного и количественного анализа ГБ-115 в субстанции и лекарственной форме и их валидационные характеристики;

·  Оценка стабильности субстанции и лекарственной формы ГБ-115 под действием факторов окружающей среды, 90% относительной влажности воздуха, разбавленных растворов кислот и щелочей и результаты определения сроков годности методом «ускоренного старения» и при хранении в естественных условиях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «объекты и методы исследования», двух глав экспериментальных исследований, списка литературы и двух приложений. Работа изложена на 189 страницах машинописного текста, содержит 44 таблицы и 30 рисунков. Библиография включает 153 источника, из них 102 отечественных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектами исследований являлись образцы субстанции нового оригинального анксиолитика ГБ-115, исходный продукт его синтеза - фенилгексановая кислота (ФГК) и промежуточные продукты его синтеза– N(6-фенилгексаноил)глицин (ФГГ), L-триптофана хлорогидрат (ТХ), ГБ-111, а также твердая дозированная лекарственная форма – таблетки 1 мг.

С25Н30N4O3 Мм 434,52

Рис.1 Структурная формула ГБ-115

В процессе исследований были использованы методы ИК-, УФ-, ЯМР1Н-спектроскопии, тонкослойной хроматографии (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газожидкостной хроматографии (ГХ), титриметрические методы анализа.

Изучение физико-химических свойств и спектральных характеристик субстанции ГБ-115

Определение внешнего вида, растворимости, цветности, потери в массе при высушивании, температуры плавления образцов субстанции ГБ-115 проводили по методикам ГФ XII издания, часть 1.

По внешнему виду все образцы субстанций ГБ-115 представляли собой белый или белый с желтоватым или кремоватым оттенком кристаллический порошок, очень легко растворимый в диметилформамиде, легко растворимый в ледяной уксусной и муравьиной кислотах, мало растворимый в этаноле, очень мало растворимый в ацетонитриле, практически нерастворимый в воде.

Поскольку субстанция ГБ-115 практически не растворима в воде, для оценки показателей качества «Прозрачность» и «Цветность» были приготовлены 0,5% растворы субстанций в этиловом спирте. Приготовленные растворы были прозрачными или по мутности не превышали эталон I, а по показателю «Цветность» - бесцветными или по цветности не превышали эталон GY6.

Значение удельного вращения образцов ГБ-115 лежало в интервале от -9 до -9,90 º (5% растворы в диметилформамиде). Предварительно высушенные до постоянной массы образцы препарата плавились в интервале 177,5-182,5 °С в пределах 1-2 °С, с видимым разложением. Потеря в массе всех образцов ГБ-115 не превышала 0,5 %.

УФ - спектры 0,004% раствора образцов препарата в спирте этиловом 95% в области длин волн от 250 до 350 нм имели два максимума поглощения при длинах волн 282±2 нм, 290±2 нм (рис.2).

Рис. 2. УФ-спектр раствора ГБ-115 в этаноле 95% (0,004%)

В ИК-спектре (KBr, см-1) присутствуют следующие характеристические полосы поглощения (см –1): 3402 – свободная NH2-группа, ассоциированные NH-группы обнаруживаются в виде широкой диффузной полосы с максимумами при 3360 и 3197, валентные колебания протона в С-Н-группах наблюдаются при , интенсивные полосы поглощения при 1672 и 1625 соответствуют валентным колебаниям С=О амидных карбонилов. Характерная для индольного цикла полоса обнаруживается при 1505 (С=С связи). Полосы при 1420 и 1350 соответствуют колебаниям С-N- связей (полоса Амид II), валентные колебания связи С-N в амидах (амид III) проявляются при 1240 и 1201. Полоса при 738 соотносится с орто-замещением в бензольном кольце, интенсивная полоса 697 принадлежит деформационным колебаниям связи N-H (в RNH2 ). ИК-спектры всех образцов субстанции были практически идентичны.

В спектрах ПМР образцов субстанции ГБ-115, снятых в растворе диметилсульфоксида – d6 (ДМСО-d6) с концентрацией растворов 2% (эталон измерений химических сдвигов – тетраметилсилан (ТМС)) присутствовали сигналы всех фрагментов молекулы. Характерными являются следующие полосы (м. д.): 1,24 (2Н, м. СН2ц); 1,51 (4Н, м, СН2ц, СН2ц); 2,08 (2Н, т, СН2ц); 2,53 (2Н, т, СН2ц); 2,94 и 3,15 (2Н, два д. д. СН2b Тrр); 3,55 и 3,75 (2Н, два д. д., СН2 Gly); 4,45 (1Н, м, СНaТrр); 6,90-7,35 и 7,55 (9Н, м, АrН); 7,11 и 7,43 (2Н, два с NH2); 7,18 (1Н, с, СН = Тrр); 7,93 (1Н, д, NH Тrр), 8,02 (1Н, т, NH Gly); 10,81 (1Н, с, NHa Тrр). ПМР-спектры всех образцов субстанции были практически идентичны.

На основании проведенных исследований было сделано заключение о возможности использования метода УФ-, ИК и ПМР-спектроскопии для идентификации ГБ-115.

Хроматографические методы в анализе субстанции ГБ-115

Хроматографическая подвижность ГБ-115 и его вероятных технологических примесей была изучена с помощью методов ТСХ и ВЭЖХ.

Анализ методом ТСХ проводили на пластинках Kiesilgel 60 F254 (Merk) в системе хлороформ: этанол: ледяная уксусная кислота: вода в соотношении (30: 10: 0,3: 0,5). Обнаружение полученных зон адсорбции проводили в камере, насыщенной парами йода и под УФ-светом с длиной волны 254 нм.

Параметры разделения и пределы обнаружения ГБ-115 и веществ-свидетелей технологических примесей представлены в таблице 1.

При определении посторонних примесей в серийных образцах субстанции ГБ-115 на хроматографическую пластинку наносили 20 мкл (100 мкг) раствора субстанции в этиловом спирте. Для оценки содержания примесей рядом наносили растворы свидетелей вероятных технологических примесей в этиловом спирте в количестве, эквивалентном 80 мкг (ФГГ) и 20 мкг (остальные примеси). В указанных условиях примесей в образцах субстанции обнаружено не было.

Таблица 1

Параметры разделения и пределы обнаружения ГБ-115 и веществ-свидетелей

Соединение	Значение Rf	Предел обнаружения, мкг	Коэффициент разделения (η)*
УФ-свет	Пары йода
ТХ (1)	0,27	2	2	---
ФГГ (2)	0,47	25	25	h(1 и 2) = 3,2
ГБ-	0,60	1,5	1,5	h(2 и 3) = 2,3
ГБ-	0,64	1	1	h(3 и 4) = 0,55
ФГК (5)	0,87	18	18	h(4 и 5) = 3,4

*рассчитывается как отношение разности величин Rf соседних зон адсорбции, умноженной на длину пробега системы растворителей (мм) к половине суммы длины продольного сечения соседних зон адсорбции (мм)

Разработку методики ВЭЖХ проводили на жидкостных хроматографах LC-10AT (Shimadzu, Япония) и Golden System (Beckman, США) со спектрофотометрическими детекторами с переменной длиной волны на колонке 250 х 4,6 мм, заполненной сорбентом С18 с размером частиц 5 мкм (Luna C18(2), Phenomenex). Элюирование проводили в изократическом режиме, температура колонки комнатная, аналитическая длина волны 215 нм, пробы растворяли в подвижной фазе.

Оптимальное разделение ГБ-115 и примесей наблюдалось в подвижной фазе ацетонитрил – вода (рН 3,15, H3PO4) в соотношении 400:450. В выбранных условиях относительные времена удерживания ТХ, ФГГ, ФГК и ГБ-111 составляли: 0,23; 0,80; 1,62 и 2,83 соответственно. Хроматограмма модельной смеси представлена на рис. 3.

Содержание посторонних примесей рассчитывали относительно раствора РСО ГБ-115 с концентрацией 0,01 мг/мл.

Рис. 3. Хроматограмма модельного раствора ГБ-мг/мл) и примесей (1 – ТХ, 2 – ФГГ, 3 – ГБ-115, 4 – ФГК, 5 – ГБ-111, по 0,01 мг/мл каждого соединения).

Для проверки пригодности готовили раствор ГБ-115 и ФГК с концентрацией каждого соединения 0,1 мг/мл. Пригодность хроматографической системы оценивали по следующим параметрам: коэффициент разделения между пиками ГБ-115 и ФГК составляет не менее 5; значение коэффициента асимметрии пика ГБ-115 (Q) не более 1,5; число теоретических тарелок (N) не менее 8000 и составило 8388, относительное стандартное отклонение результатов отдельных измерений площадей пиков ГБ-115 не должно превышать 2%.

С помощью разработанной методики в субстанции ГБ-115 было обнаружено до пяти индивидуальных примесей в образце (табл. 2).

Содержание индивидуальной примеси во всех образцах ГБ-115 не превышало 0,23 %, а суммарное содержание примесей не превышало 0,6%.

С помощью метода добавок было показано, что примесь с относительным временем удерживания 0,80 является примесью ФГГ.

Таблица 2

Содержание посторонних примесей в образцах субстанции ГБ-115

Номер серии	Содержание и относительные времена удерживания примесей (%)	Сумма примесей (%)
tотн =0,80	tотн =0,85	tотн=1,32	tотн =1,41	tотн =1,32	tотн=1,84	tотн=1,92
	0,23	0,05	0,17	-	-	0,05	0,07	0,57
	-	0,13	-	0,11	-	-	-	0,24
	-	0,19	-	0,15	-	-		0,34
	0,06	0,04	0,05	-	-	-	-	0,15
	0,05	0,03	0,05	-	-	-	-	0,13

Метод ГЖХ в анализе субстанции ГБ-115

Исследование проводилось на газовом хроматографе Chrom 5 с пламенно-ионизационным детектором (Чехословакия), на стеклянной набивной колонке длинной 2,4 м и внутренним диаметром 3 мм, сорбент - 15% ПЭГ 1500 на Chromaton N-AW-DMCS (0,200 – 0,250 мм). Скорость потока газа носителя (азота) 50 мл\мин, скорость потока водорода 50 мл\мин, скорость потока воздуха 500 мл\мин, температура испарителя – 120°С, температура детектора – 120°С, температура термостата программируемая, с повышением от 70 до 120°С в течение 15 мин. Указанные условия позволяли разделить этанол, ацетон, этилацетат, изопропиловый спирт и н-бутанол. В качестве внутреннего стандарта при приготовлении проб использовали н-бутанол. В образцах субстанции ГБ-115 остаточных растворителей обнаружено не было.