Клиническое значение маркеров ангиогенеза для определения тяжести гестоза (стр. 2 )

Иммунохимическое исследование проводилось в лаборатории биокатализа на базе Института биоорганической химии им. и (зав. лабораторией – член-корр. РАН, д. х.н., профессор ). Исследование включало определение VEGF-А, плацентарного фактора роста (PlGF) и растворимого рецептора VEGF (sFlt-1, sVEGF-R1) в сыворотке крови пациенток методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Использовались стандартные наборы реактивов фирмы Bender MedSystems GmbH sVEGF-R1 человека (BMS268/2), свободного VEGF-A человека (BioLISA BMS277BL) и свободного PlGF человека фирмы R&S System (DPG00). Измерение оптической плотности производили с помощью плашечного ридера «TECAN» (Австрия) при длине волны 450 нм. Построение калибровочного графика и конечный расчет концентрации VEGF-А, PlGF и sFlt-1 производили по стандартной для иммуноферментного анализа технологии.

Морфологическое исследование:

Патоморфологическое исследование проводилось в лаборатории патологии женской репродуктивной системы ГУ НИИ морфологии человека РАМН (руководитель центра профессор, Заслуженный деятель науки РФ ).

Материалом для морфологического исследования служили участки плаценты и плацентарного ложа, полученные во время операции кесарева сечения. После извлечения ребенка и отделения плаценты определялась локализация плацентарной площадки относительно стенок матки. Из центральной зоны плацентарного ложа вырезалась полоска ткани (длиной 3 см, толщиной 0.5 см и шириной 0.5 см). Это условие биопсии плацентарного ложа очень важно, поскольку именно в центральной зоне максимально выражены процессы инвазии цитотрофобласта и гестационная перестройка, находящихся там спиральных артерий (их лучше называть маточно-плацентарными артериями). Вырезанная полоска закреплялась на плотной бумаге эндометриальной поверхностью и в таком виде фиксировалась в 10% нейтральном формалине. Кроме того, из отделившейся плаценты вырезали 3-4 фрагмента размерами 2х2х3 см и фиксировали в том же растворе формалина.

В дальнейшем, биоптаты плацентарного ложа доставляли в лабораторию, где биоптаты отделяли от картона и при дальнейшей проводке строго следили, чтобы на парафиновые блоки материал укладывался так, что в срезах был виден переход эндометриальной части в миометрий. Другие атипичные срезы отбраковывались. Кусочки плацент проводились по обычной гистологической схеме и готовились срезы толщиной 5-7 микрон; они окрашивались гематоксилином и эозином, а также азокармином по Маллори.

После предварительного просмотра микропрепаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, отбирали те блоки, в которых были видны интересующие компоненты плаценты (ткань ворсин, хориальная и базальная пластинки, клеточные островки и септы) и компоненты плацентарного ложа (инвазирующий цитотрофобласт, многоядерныегигансткие клетки, маточно-плацентарные артерии).

Из отобранных блоков делали дополнительные срезы и после их депарафинизации укладывали на стекла с полилизиновым покрытием; на них осуществлялась имунопероксидазная визуализация VEGF человека с помощью козьих поликлональных антител (Австрия) и системы визуалтзации Universal-HRP-ABC (Novocastra).

Для полуколичественной оценки степени экспрессии VEGF использована условная шкала: ± неопределенная, + слабая, ++ умеренная, +++ выраженная иммунореакция. На основе индивидуальных оценок по каждому микропрепарату в обеих группах суммировалась общая характеристика экспрессии VEGF в отдельных структурах плацент.

Иммуногистохимическое исследование срезов плацентарной ткани и плацентарного ложа матки в группе сравнения и у женщин с гестозом проводилась одновременно в строго идентичных условиях. Для иммуновизуализации инвазирующего трофобласта в составе биоптатов плацентарного ложа матки на дополнительных срезах осуществляли с помощью моноклональных антител против цитокератина-8 (С8, Novocastra) – общепризнанного маркера цитотрофобласта.

Статистическую обработку полученных данных производили по общепринятому методу вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m), стандартного отклонения (SD), 95% доверительных интервалов (CI).

Результаты исследования

Результаты иммуноферментного анализа.

По мере поступления в стационар и отбора в основную и контрольную группы у всех беременных в сроке 32-34, 35-37 и 38-40 недель производился забор крови из кубитальной вены для проведения иммуноферментного анализа и оценки содержания VEGF-А, PlGF и sFlt-1 в плазме крови. Суммируя все полученные данные о концентрации ангиогенных факторов у беременных контрольной группы в течение третьего триместра, была получена средняя величина, принятая нами за норму у здоровых беременных женщин (VEGF-А - 279±29 пг/мл, PlGF 663±43 пг/мл, растворимой формы VEGFR-1(sFlt±96 пг/мл) и оценена динамика их изменений при физиологическом течении беременности на протяжении третьего триместра (диаграмма 1).

Диаграмма 1. Концентрации ангиогенных факторов у пациенток с физиологическим течением беременности (пг/мл)

Определено, что по мере прогрессирования неосложненной беременности отмечается достоверное снижение концентрации PlGF с 751±23 до 585±14 пг/мл, средняя концентрация sFlt-1 повышается с 1296±52 до 1737±61 пг/мл, а концентрация VEGF-А достоверно не изменяется (279±29 пг/мл). У беременных с гестозом были выявлены значимые изменения концентраций факторов ангиогенеза. По мере прогрессирования гестоза определялось снижение концентраций PlGF с 360±18 пг/мл при начальных формах гестоза до 201±16 пг/мл при его тяжелых формах. Гестоз средней и тяжелой степени характеризовался резким снижением PlGF в 2-3 раза по сравнению с контрольной группой (с 663±43 пг/мл до 245±28 пг/мл и 201±16 пг/мл). Исследование концентрации VEGF-А в сыворотке крови женщин основной группы с различной степенью тяжести гестоза показало снижение VEGF-А в сыворотке с 51±9 пг/мл при начальных формах гестоза до 26±2 пг/мл при его тяжелых формах (таблица 5).

Таблица 5. Концентрации VEGF, PlGF и sFlt-1 у пациенток с гестозом.

Исследуемые факторы (пг/мл)	Группа контроля	Гестоз I	Гестоз II	Гестоз III
VEGF	279±29	51±9*	39±5*	26±3*
PlGF	663±43	360±18*	245±28*	201±16*
sFlt-1	1509±96	3926±214*	5512±312*	6904±310*

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: * - p < 0,05, при сравнении уровней ангиогенных факторов между группами.

При гестозе средней и тяжелой степени отмечается десятикратное снижение VEGF-А в сыворотке по сравнению с контрольной группой.

Следует отметить, что в большинстве случаев гестоза среднего и тяжелого течения концентрация VEGF-А была нулевой (подпороговой), поскольку используемый нами метод иммуноферментного анализа выявляет только свободный (биологически активный VEGF-А) с минимальной определяемой концентрацией VEGF-А - 7.3 пг/мл. Как видно из таблицы №5 концентрация VEGF-А значительно снижается при гестозе средней степени тяжести, вплоть до полного его отсутствия в периферическом кровотоке при тяжелом гестозе.

При исследовании уровня sFlt-1, концентрация его при легких формах составила 3926±214 пг/мл, а при тяжелом гестозе - 6904± 310 пг/мл.

Таким образом, для беременных основной группы при легком, среднем и тяжелом течении гестоза характерно значительное достоверное повышение концентраций sFlt-1 в периферической крови.

В основной группе у%) беременной с уровнем среднего артериального давления (САД) менее 110 мм. рт. ст. концентрации sFlt-1 и PlGF составили 3403±290 и 331±20 пг/мл соответственно. У,8%) беременных САД находилось в пределах 111-119 мм. рт. ст., а уровень sFlt-1 и PlGF у данных пациенток составил 4749±365 и 270±15 пг/мл, что достоверно отличается от данных предыдущей группы (p<0,05). Максимальное изменение концентрации sFlt-1 и PlGF выявлено у беременных, САД у которых превышало 120 мм. рт. ст. (5677±397 и 204±17 пг/мл, p<0,05). Результаты проведенного анализа показали, что при САД выше 120 мм. рт. ст. определяются самые высокие концентрации sFlt-1 и самые низкие концентрации PlGF, что всегда свидетельствует о тяжелом течении гестоза.

Уровни sFlt-1 и PlGF в зависимости от тяжести артериальной гипертензии приведены в таблице №6.

Таблица 6. Зависимость уровней sFlt-1 и PlGF от выраженности артериальной гипертензии у беременных основной группы, M ± m

САД	n, абс(%)	Уровень sFlt-1 пг/мл	Уровень PlGF пг/мл
До 110 мм рт. ст.	31 (41,9)	3403±290	331±20
111-119 мм рт. ст.	28 (37,8)	4749±365*	270±15 *
120 и > мм рт. ст.	12 (17,6)	5677±397*	204±17*

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: * - p < 0,05; × - p> 0,05 (по сравнению с беременными с меньшими показателями САД).

Как указывалось ранее, в основной группе было,6 %) беременных, у которых протеинурия отсутствовала (у 11 – в 1-ой подгруппе и 2 – во 2-ой подгруппе). Концентрация sFlt-1 и PlGF у этих пациенток составила соответственно 3207±213 и 317±19 пг/мл.

У,2 %) беременных основной группы величина протеинурии не превышала 0,132 г/л включительно. Уровни sFlt-1 и PlGF у данных пациенток достоверно не отличались от тех же показателей у беременных без протеинурии и составили пг/мл 3542±228 и 295±17 соответственно (p > 0,05).

При величине протеинурии 0,132-1,0 г/л включительно (21 беременных – 28,4 %), концентрации sFlt-1 и PlGF были достоверно выше, чем у предыдущих пациенток – 4534±314 и 249±18 пг/мл соответственно (p < 0,05).

Максимальные изменения концентраций sFlt-1 и PlGF выявлены при массивной протеинурии более 1 г/л (у 11 беременных – 14,82 %) – 7508±517 и 187±17 пг/мл, различия с предыдущими показателями высоко достоверны (p < 0,001, p < 0,05). Результаты приведены в таблице №7.

Таблица 7. Зависимость уровней sFlt-1 и PlGF от величины протеинурии у беременных основной группы, M ± m

Величина протеинурии	n, абс (%)	Уровень sFlt-1 пг/мл	Уровень PlGF пг/мл
Отсутствует	13 (17,6)	3207±213	317±19
До 0,132 г/л	29 (39,2)	3542±228×	295±17×
Более 0,132 до 1,0 г/л	21 (28,4)	4534±314*	249±18*
Более 1,0 г/л	11(14,8)	7508±517**	187±17*

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: * - p < 0,001; **- p < 0,001, × - p > 0,05 (по сравнению с беременными с меньшей протеинурией).

Результаты проведенного анализа показали, что при массивной протеинурии определяются самые высокие концентрации sFlt-1 и самые низкие концентрации PlGF, что всегда свидетельствует о тяжелом течении гестоза. Статистически достоверная разница концентрации исследуемых обоих факторов получена только в случаях протеинурии более 0,132 г/л.

Сходные результаты получены и при изучении ангиогенных факторов в зависимости от выраженности отеков у беременных с гестозом.

Отеки голеней имели место у,1 %) беременных основной группы (у 30 пациенток 1-ой подгруппы, у 8 – во 2-ой подгруппе, и у 5 – в 3-й подгруппе); концентрация sFlt-1 и PlGF у этих женщин составила в среднем 3927±201 пг/мл и 265±19 пг/мл. Выраженные распространенные отеки отмечены у%) беременных (у 5, 9 и 6 соответственно подгруппам); уровни sFlt-1 и PlGF у них достоверно выше, в среднем 5347±324 и 207±14 пг/мл соответственно (p< 0,05). Результаты анализа приведены в таблице №8.

Таблица 8. Зависимость уровней sFlt-1 и PlGF от выраженности отечного синдрома у беременных основной группы (n=74), M ± m

Отечный синдром абс(%)	n, абс (%)	Уровень sFlt-1 пг/мл	Уровень PlGF пг/мл
Отсутствует	11(14,9)	3156±176	317±18
Локальные отеки	43(58,1)	3927±201×	265±19*
Выраженные отеки	20(27)	5347±324*	207±14*

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: * - p < 0,05; × - p > 0,05.

В таблице №9 представлены результаты анализа уровней sFlt-1 и PlGF у беременных с гестозом с НМППК и без НМППК, с ЗВРП и без.

Таблица 9. Зависимость уровней sFlt-1 и PlGF у беременных при гестозе в сочетании с ЗВРП и НМППК, M ± m.

	Гестоз n=74	P	Гестоз n=74	p
ЗВУР+ n=27	ЗВУР- n=47	НМППК+ n=36	НМППК- n=38
sFlt-1 (пг/мл)	5856±146	4160±123	p < 0,005	5773±245	4087±265	P < 0,005
PlGF (пг/мл)	202±24	290±31	p < 0,005	218±21	306±26	P < 0,005

Примечание. Оценка достоверности связи между показателями: при p < 0,005 связь достоверна, при p > 0,05 связь недостоверна.

У беременных с гестозом и ЗВУР плода и нарушением маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока, выявлены более значимые нарушения концентраций ангиогенных факторов (sFlt-1 и PlGF) по сравнению с гестозом без данных осложнений (таблица №10).

Таблица 10. Уровни sFlt-1 и PlGF у беременных основной группы, родивших детей с гипотрофией, M ± m.

Фактор	Гестоз легкой ст. n=45	Гестоз средней ст. N=18	Тяжелый гестоз n=11
ЗВУР+ n=8	ЗВУР- N=37	ЗВУР+ n=10	ЗВУР- n=8	ЗВУР+ n=9	ЗВУР- N=2
sFlt-1 (пг/мл)	4256±146*	3260±123	5973±245*	5087±265	7434±315*	6559±289
PlGF (пг/мл)	252±24×	290±31	221±21×	256±26	186±18*	215±21

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: * - p < 0,05, × - p > 0,05 при сравнении концентраций sFlt-1 и PlGF у беременных, родивших гипотрофичных детей и детей с нормальным весом.

Таким образом, нами было выявлено, что при тяжелых формах гестоза отмечается достоверное снижение, вплоть до полного отсутствия VEGF-А, трехкратное снижение концентрации PlGF и 6-кратное увеличение концентрации sFlt-1 по сравнению с контрольной группой. Наиболее выраженные изменения концентраций ангиогенных факторов наблюдаются у пациенток, в клинической картине гестоза которых имели место признаки НМППК и ЗВРП.

Для выявления связи между уровнями изучаемых ангиогенных факторов и клиническими данными, а также исходами беременности и родов для матери и плода при гестозе, был проведен корреляционный анализ с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs), который применим как к количественным, так и к порядковым признакам. Результаты корреляционного анализа представлены в таблицах №№11, 12 и 13 .