Клиническое значение маркеров ангиогенеза для определения тяжести гестоза (стр. 3 )

В первую очередь была определена связь времени начала гестоза с концентрацией PlGF и sFlt-1 сыворотке крови беременных (таблица №11).

Таблица 11. Корреляционная связь времени начала гестоза с уровнями PlGF и sFlt-1 в основной группе, n= 74.

	Уровень sFlt-1	Достоверность корреляции	Уровень PlGF	Достоверность корреляции
Начало гестоза, rs	- 0,819	p < 0,001	0,9	P < 0,001

Из таблицы видно, что между временем начала гестоза и изменением концентрацией sFlt-1 получена обратная - высоко достоверная корреляция (p < 0,001): чем раньше клинически манифестирует гестоз, тем выше уровень sFlt-1 . Для PlGF и временем начала гестоза выявлена прямая высоко достоверная связь: чем раньше появляются клинические признаки гестоза, тем ниже концентрация PlGF. Подобным образом проанализированы основные клинические показатели. Полученные результаты демонстрирует таблица №12.

Таблица 12. Связь основных клинико-лабораторных данных с уровнями sFlt-1 и PlGF пациенток основной группы, n= 74.

	Уровень sFlt-1	p	Уровень PlGF	P
Выраженность отеков, rs	0,743	< 0,001	-0,792	< 0,001
САД, rs	0,763	< 0,001	-0,747	< 0,001
Выраженность протеинурии, rs	0,577	< 0,001	-0,715	< 0,001

Примечание. Оценка достоверности связи между показателями: при p < 0,05 связь достоверна, при p > 0,05 связь недостоверна.

Обобщенные результаты корреляционного анализа следующие: выявлена прямая (sFlt-1) и обратная (PlGF) высоко достоверная корреляционная связь между концентрацией ангиогенных факторов и выраженностью отечного синдрома, величиной протеинурии и тяжестью гипертензии. Перечисленные данные получены в основной группе (n=74), и, следовательно, характеризуют общие тенденции нарастания уровня sFlt-1 и снижения PlGF при тяжелых формах гестоза. Также мы проанализировали корреляционную зависимость между уровнями sFlt-1 и PlGF в сыворотке крови пациенток с гестозом и перинатальными исходами (таблица №13).

Таблица 13. Связь морфометрических показателей и состояния новорожденных с уровнями sFlt-1 и PlGF в основной группе (n= 74).

	Уровень sFlt-1	p	Уровень PlGF	P
Вес новорожденных, rs	- 0,63	< 0,001	0,59	< 0,001
Оценка по Апгар, rs	- 0,59	< 0,001	0,67	< 0,001

Таким образом, выявлена обратная (sFlt-1) и прямая (PlGF) высоко достоверная корреляция между уровнями sFlt-1 и PlGF и перинатальными исходами: чем выше концентрация sFlt-1 (ниже PlGF) в сыворотке крови матери, тем хуже состояние новорожденного (сниженная оценка по Апгар, гипотрофия, гипоксически-ишемическое поражение ЦНС).

Корреляционный анализ показал, что при высокой гипертензии, выраженной протеинурии и массивных отеках (т. е. при гестозе средней и тяжелой степени тяжести) определяется повышение концентрации sFlt-1 и снижение концентрации PlGF в материнской крови.

В группе женщин с гестозом легкого течения проводился двукратный забор крови для иммуно-ферментного анализа концентраций ангиогенных факторов (при поступлении в стационар и перед родоразрешением; n=27).

На фоне проводимой регламентированной терапии у женщин с гестозом легкого течения (n=12) наблюдалось утяжеление гестоза, при этом определено достоверное снижение концентрации PlGF (366±17пг/мл и 229 ±19пг/мл соответственно) и достоверное повышение концентрации sFlt-1 (4013±218пг/мл и 5435±301пг/мл соответственно). В тех случаях (n=15), когда клинически не отмечалось нарастание тяжести гестоза, определялось не достоверное снижение концентрации PlGF (391±19пг/мл и 422 ±14пг/мл) и не достоверное повышение концентрации sFlt-1 (3661±189пг/мл и 4012±213пг/мл).

Таким образом:

1. В сыворотке крови беременных с гестозом определяются достоверно более высокие концентрации sFlt-1 и достоверно более низкие концентрации VEGF и PlGF по сравнению со здоровыми беременными с физиологически протекающей беременностью и степень изменения концентраций sFlt-1 и PlGF коррелирует с выраженностью отечного синдрома, тяжестью гипертензии и величиной протеинурии

2. Максимальные изменения концентраций PlGF и sFlt-1 определяются при массивной протеинурии, генерализованных отеках и тяжелой гипертензии, а также высокие уровни sFlt-1 выявлены при НМППК и ЗВРП;

3. Имеет место высоко достоверная связь между степенью изменения концентрации исследуемых ангиогенных факторов в сыворотке крови беременных с гестозом и перинатальными исходами (асфиксия и гипотрофия новорожденных);

4. При уровне sFlt-1 не выше 3926±214 пг/мл, а PlGF не ниже 360±18 пг/мл гестоз имеет легкое течение и благоприятные исходы беременности и родов для матери и плода;

5. Концентрация sFlt-1 свыше 6904±310 пг/мл, а PlGF ниже 201±16 пг/мл свидетельствует о тяжелом гестозе;

Результаты морфологического и иммуногистохимического методов исследования.

Согласно полученным результатам, при легком гестозе ФПН чаще компенсированная, а при среднем и тяжелом течении гестоза практически всегда - декомпенсированная.

При гестозе легкой степени в плаценте наблюдался стаз большого числа материнских эритроцитов, отек стромы ворсин, определялись группы тесно сближенных ворсин со спавшимся плодными капиллярами, сужения межворсинчатого пространства, содержащего единичные материнские эритроциты, что является свидетельством относительной плацентарной недостаточности. Строма большинства ворсин была отечной, разрыхленной, с фибриноидными изменениями стенок сосудов обнаруживались участки неравномерной васкуляризации стромы ворсин с преобладанием участков гиперваскуляризации. Синцитиальный покров сохранен почти на всем протяжении, в отдельных препаратах встречались участки пролиферации в виде инволютивных синцитиальных почек.

В плацентах женщин с гестозом средней степени преобладали очаговые инволютивно-дистрофические изменения стромы и эпителия ворсин с отложением фибриноида в интравиллезном пространстве, наличием очаговых псевдоинфарктов вследствие нарушения кровообращения в межворсинчатом пространстве; выявляется фокальный некроз синцитиотрофобласта и стаз большого числа материнских эритроцитов. Отмечено большое количество незрелых ворсин со снижением васкуляризации, а также тромбоз межворсинчатого пространства, который свидетельствует о выраженном нарушении кровообращения.

При гистологическом исследовании плацент беременных с тяжелым гестозом выявлены признаки декомпенсированной ФПН: снижение васкуляризации ворсин, капилляры в плаценте занимали преимущественно аксиальное положение, было значительно уменьшено число синцитио-капиллярных мембран; строма ворсин бедна клеточными элементами, преобладали явления фиброза. Эти структурные изменения являются необратимыми.

Для достижения поставленных задач было изучено иммуногистохимическое распределение VEGF в различных компонентах плацент и плацентарного ложа матки в норме (n=14) и у беременных с гестозом различной степени тяжести (n=26) таблица №14.

Таблица 14. Количество иммуноморфологических исследований.

	Контроль	Гестоз легкой степени	Гестоз средней степени	Тяжелый гестоз
Плацента	14	9	10	7
Плацентарное ложе	14	9	8	6

Во всех плацентарных фрагментах у женщин контрольной группы выявлена умеренная экспрессия VEGF в синцитиотрофобласте терминальных и промежуточных ворсин (таблица №15). Преобладала иммуноэкспрессия VEGF в цитоплазме синцитиотрофобласта наиболее многочисленных ветвей ворсинчатого дерева – промежуточных и самых мелких терминальных ворсин (рисунок №1); Примерно в 70% плацентарных фрагментов выявлялись в большом количестве активные синцитиальные почки с выраженной экспрессией VEGF. Среди них, меньшую часть, составляли так называемые инволютивные синцитиальные почки, находящиеся в стадии структурной инволюции, близкой к апоптозу. Это подтверждается и негативной реакцией с антителами VEGF. Наиболее интенсивная реакция регистрируется в свободных симпластах (особый вариант синцитиальных почек, постепенно отделяющийся от эпителиального покрова ворсин и попадающий в межворсинчатое пространство)

Таблица 15. Интенсивность экспрессии VEGF в разных компонентах плацент при физиологической беременности и у женщин с гестозом.

Компоненты исследования	Контрольная группа (n=14)	Основная группа (n=26)
Плацента
Синцитиотрофобласт Активные синцитиальные почки Инволютивные почки Свободные симпласты Цитотрофобласт клеточных островков Цитотрофобласт базальной пластинки Эндотелий крупных сосудов Эндотелий капилляров Плацентарные макрофаги	++ +++ - +++ ++ ++ + - ++	Гестоз легкой степени (n=9)	Гестоз средней и тяжелой степени (n=17)
+ + - + + + + - +	- - - - + + - - -

Примечание: + слабая реакция; ++ умеренная; +++ выраженная.

Кроме того, экспрессия VEGF выявлена в эндотелии артериол, идущих в составе опорных ворсин I и II порядка, то есть отходящих от хориальной пластинки и первых крупных ветвях. По интенсивности экспрессии VEGF выбухающие эндотелиальные клетки не отличались от синцитиотрофобласта окружающих ворсин, но подобная иммунореакция ослабевала в более многочисленных опорных ворсинах III порядка и практически отсутствовала в капиллярном русле ворсинчатого дерева.

Другой основной особенностью иммунораспределения VEGF в нормальных, доношенных плацентах является его положительная экспрессия в клетках периферического цитотрофобласта, которые выявляются в составе клеточных островков, септ и базальной пластинки. В основании септ, кроме периферического цитотрофобласта, имеются группы децидуальных (материнского происхождения) клеток, которые иммунонегативны в отношении VEGF.

Следовательно, в нормальных доношенных плацентах выявлена экспрессия VEGF, главным образом, в тех структурных компонентах, которые непосредственно контактируют с материнской кровью (синцитиотрофобласт ворсин, активные синцитиальные почки, свободные симпласты, периферический цитотрофобласт клеточных островков, септ и базальной пластинки). Кроме того, иммунопозитивная реакция на этот фактор роста сосудов обнаружена в плацентарных макрофагах стромы промежуточных незрелых ворсин и в умеренной степени – в эндотелиоцитах артериол опорных ворсин I и II порядка, а также в артериях хориальной пластинки.

Во всех биоптатах плацентарного ложа контрольной группы отмечены широкие просветы и полное фибриноидное замещение мышечно-эластических элементов стенок бывших спиральных артерий в пределах эндометриального слоя (эндометриальные сегменты маточно-плацентарных артерий (МПА)) и более крупных артерий матки в составе прилежащего к эндометрию слоя миометрия (миометриальные сегменты МПА).

При доношенной нормальной беременности в биоптатах плацентарного ложа матки инвазирующий цитотрофобласт представлен в небольшом количестве, главным образом, в виде отдельных цитокератин-положительных клеток среди миоцитов и в стенках миометральных сегментов МПА с относительно широким просветом (рисунок 3). Некоторые цитокератин-положительные клетки видны на месте бывшего эндотелия, что является отражением внутрисосудистой инвазии цитотрофобласта как одного из главных механизмов гестационной перестройки бывших радиальных и спиральных артерий матки.

Иммуногистохимическое распределение VEGF в биоптатах плацентарного ложа в точности соответствует расположению инвазирующего цитотрофобласта, но по интенсивности, экспрессия VEGF в этих клетках слабее, чем в синцитиотрофобласте ворсин, свободных симпластах, в периферическом цитотрофобласте клеточных островков и септ (таблица №16).

Из таблицы №16 следует, что относительно слабая экспрессия VEGF в инвазивном цитотрофобласте отражает структурную инволюцию этих клеток в конце нормальной беременности, поскольку основная их функция – гестационная перестройка стенок и расширение просвета бывших узких радиальных артерий – осуществлена ранее, во время второй волны инвазии цитотрофобласта.

Таблица 16. Интенсивность экспрессии VEGF в разных компонентах плацентарного ложа при физиологической беременности и у женщин с гестозом.

Компоненты исследования	Контрольная группа (n=14)	Основная группа (n=23)
Плацентарное ложе
Многоядерные клетки Эндотелий маточно-плацентарных артерий Эндотелий венозных сосудов Инвазивный цитотрофобласт	- + - +	- ± ± +

Примечание: ± неопределенная; + слабая реакция; ++ умеренная; +++ выраженная.

У женщин с гестозом различной степени тяжести получены интересные результаты. Так, плацента резко отличалась по степени выраженности экспрессии VEGF (таблица №15). В преобладающих по количеству мелких ворсинах синцитиотрофобласт был истончен и не выявлял иммунной реакции с антителами против VEGF, также как и многочисленные инволютивные синцитиальные почки и редко выявляемые свободные симпласты в межворсинчатом пространстве (рисунок №2).

Рисунок 1. Плацента. Группа нормы. Рисунок 2. Плацента. Гестоз.

Иммунопозитивная реакция VEGF в Иммунонегативная реакция VEGF в син-

синцитиотрофобласте мелких ворсин, цитиотрофобласте. Преобладание инволю-

активных синцитиальных почках и тивных синцитиальных почек.

свободных симпластах.

Слабая экспрессия VEGF отмечена в периферическом цитотрофобласте септ и базальной пластинки (таблица №15).

Следовательно, в основных клетках-продуцентах VEGF при нормальной, доношенной беременности у женщин с клиническими проявлениями гестоза синтез этого фактора роста сосудов отсутствовал, либо был резко снижен. Наиболее выраженное снижение экспрессии VEGF наблюдалось в плацентах женщин с гестозом средней и тяжелой степени, по сравнению с гестозом легкого течения.

Патоморфология 23 биоптатов плацентарного ложа матки подтвердила наличие известных маркеров гестоза в виде слабой гестационной перестройки эндо - и миометральных сегментов МПА, а также вариабельной картины инвазии цитотрофобласта. Эндометриальные сегменты сохраняли узкий просвет, эндотелиальный покров и относительно толстую стенку, что свидетельствовало о ранних нарушениях первой волны инвазии цитотрофобласта. Аналогичные изменения обнаружены в миометральных сегментах МПА, где при относительно широком просвете сохранялся эндотелий, причем отдельные эндотелиоциты обнаружили слабую экспрессию VEGF, также как и в отдельных интерстициальных клетках цитотрофобласта. При использовании иммуногистохимического маркера С8 (циокератин-8) удалось подчеркнуть выраженную местную вариабельность инвазии цитотрфобласта в биоптатах плацентарного ложа матки при гестозе. В 9 из 23 биоптатов выявлены участки плотной и многоклеточной инвазии, когда интерстициальный цитотрофобласт мощно проникает на большую глубину в прилежащий миометрий. Однако расположенные по ходу этой инвазии радиальные артерии (рисунок 4) сохраняют обычную структуру (узкий просвет, эласто-мышечная стенка).

Рисунок 3. Биоптат плацентарного ложа. Рисунок 4. Биоптат плацентарного ложа.

Группа сравнения. Инвазирующий цито - Гестоз. Трофобластическая инвазия

трофобласт в составе стенки миометра - плотная, но малоэффективная.

льного сегмента МПА с проникновением Радиальная маточная артерия без приз-

в зону эндотелия (маркер С8). наков гестационной перестройки.

Среди изолированных клеток цитотрофобласта выявляется большое число особых его модификаций – многоядерных клеток, представляющих собой несколько слившихся, ранее изолированных клеток с общей цитоплазмой и краевой мембраной. После слияния в конгломераты изолированный ЦТ теряет инвазивную и протеолитическую активность, то есть утрачивает свои основные свойства. Этим объясняется недостаточная гестационная перестройка МПА при наличии мощных плотных пластов интерстициального ЦТ в большинстве исследованных биоптатах плацентарного ложа. Как правило, в таких пластах лишь отдельные клетки ЦТ экспрессируют VEGF, но подобная реакция отсутствовала в многоядерных конгломератах (таблица №16).

В 14 из 23 биоптатов плацентарного ложа у женщин с гестозом преобладала явно слабая и поверхностная инвазия (ЦТ), так как даже в центральных участках плацентарного ложа внутрь миометрия проникали лишь отдельные клетки интерстициального цитотрофобласта; соответственно, в выявленных эндо - и миометральных сегментах МПА обнаружена лишь частичная гестационная перестройка, при сохранении узкого просвета, эндотелиальной выстилки и других элементов стенки (рисунки 5,6).

Рисунок 5. Биоптат плацентарного ложа. Рисунок 6. Биоптат плацентарного ложа.

Гестоз. Слабоположительная реакция VEGF Гестоз. Умеренная реакция VEGF в зоне

в отдельных эндотелиоцитах миометра - сохраненного эндотелия в миометриаль-

льного сегмента МПА, а также в редких ном сегменте МПА при слабой реакции

клетках инвазивного цитотрофобласта в окружающем цитотрофобласте.

среди миоцитов прилежащего миометрия.

.

В отношении экспрессии VEGF - при слабой инвазии цитотрофобласта она отсутствовала в редких клетках цитотрофобласта, проникающих в миометрий (рисунок 6).

Столь же неопределенной оказалась иммунореакция VEGF в эндотелиоцитах МПА артерий и венозных коллекторов, в некоторых из них она была негативной, в других, напротив, отмечена умеренная экспрессия VEGF в сохранившемся эндотелии МПА при слабом выявлении этого фактора роста сосудов в окружающем интерстициальном цитотрофобласте.

ВЫВОДЫ

1. Клиническая и лабораторная оценка тяжести гестоза не всегда отражает реальную тяжесть этого осложнения, поэтому необходимо определение ангиогенного статуса беременной, как дополнительного критерия оценки степени тяжести гестоза.

2. В течение III триместра неосложненной беременности в сыворотке крови выявлено повышение концентрации растворимого рецептора сосудисто-эндотелиального фактора роста с 1296 до 1730 пг/мл, снижение концентрации плацентарного фактора роста с 751 до 585 пг/мл. Содержание сосудисто-эндотелиального фактора роста не меняется, находясь на уровне 279±29 пг/мл.

3. Клиническая картина гестоза легкой степени тяжести характеризуется манифестацией во второй половине третьего триместра беременности. Показатели САД находятся в пределах до 106 мм. рт. ст., уровень протеинурии не выше 1г/л, отечный синдром выражен не резко. Начальные нарушения (I степени) МПК и ППК по данным допплерометрии регистрируются у трети пациенток, синдром ЗВРП - у 18% .

Концентрации VEGF и PlGF при гестозе легкой степени достоверно снижаются до 51±9 и 260±18 пг/мл по сравнению с группой контроля (279±29 и 663±43 пг/мл). Содержание sFlt-1 при легком гестозе повышается до 3926±214 пг/мл, по сравнению с контрольной группой (1509±96 пг/мл).

4. Гестоз тяжелой степени характеризуется ранней манифестацией и длительным течением. Цифры САД достигают 123 мм. рт. ст., уровень протеинурии выше 1 г/л. Отечный синдром чаще носит генерализованный характер. Частота регистрации нарушения МПК и ППК достигает 70% с преобладанием тяжелых форм. Синдром ЗВРП развивается у 80% пациенток. Пропорционально тяжести гестоза в III триместре в крови беременных происходит снижение концентрации сосудисто-эндотелиального фактора роста с 51±9 пг/мл до 26±3 пг/мл, и плацентарного фактора роста с 360±18 пг/мл до 201±16 пг/мл, и увеличение концентрации растворимого рецептора сосудисто-эндотелиального фактора роста с 3926±214 пг/мл до 6904±310 пг/мл. Полученные данные свидетельствуют об усилении нарушений ангиогенного баланса при нарастании тяжести гестоза с преобладанием антиангиогенных факторов.

5. Наиболее выраженные изменения концентраций ангиогенных факторов отмечены при тяжелой гипертензии (САД более 120 мм. рт. ст.), протеинурии более 1г/сут, достигая максимальных значений у беременных с гестозом, в клинической картине которого имеют место явления ФПН (синдром ЗВРП и нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока).

6. В структурах плаценты, являющихся источником сосудисто-эндотелиального фактора роста при неосложненной беременности, при гестозе средней и тяжелой степени выявлено резкое снижение экспрессии этого фактора в диапазоне от слабоположительной до негативной реакции. Снижение экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора роста при гестозе легкой степени отмечено в диапазоне от положительной до негативной реакции. В плацентарном ложе при гестозе выявлены признаки нарушения гестационной перестройки маточно-плацентарных артерий и снижение экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора роста в клетках инвазирующего цитотрофобласта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявленные при морфологическом и иммуногистохимическом исследовании признаки фетоплацентарной недостаточности служат основанием для профилактического назначения в группах риска по развитию гестоза препаратов улучшающих реологические свойства крови и маточно-плацентарный кровоток.

2. Повышение в крови беременных концентрации sFlt-1 6904±310 пг/мл и выше и снижение концентрации плацентарного фактора роста менее 201±16 пг/мл, и сосудисто-эндотелиального фактора роста менее 26±3 пг/мл следует расценивать как признак тяжелого гестоза.

3. Определение уровней плацентарного фактора роста и рецептора фактора роста сосудистого эндотелия в сыворотке крови беременных женщин может служить дополнительным критерием оценки степени тяжести гестоза и фетоплацентарной недостаточности, что в свою очередь позволит оптимизировать исходы беременности и родов при данной патологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. , , Солоницын воспаление плаценты // Вопросы гинекологии, акушерства и перинаталогии. – 2006. –т.5. -№4. – С.64-69

2. , , Солоницын нарушений микроциркуляции в патогенезе гестоза // Вопросы гинекологии акушерства и перинаталогии. – 2006. –т.5. -№4. – С.97-101

3. , , Солоницын факторов риска развития осложнений беременности (гестоз, ФПН, ЗВРП) у пациенток репродуктивного возраста. // Материалы международного конгресса «Практическая гинекология от новых возможностей к новой стратегии». 27-31 марта 2006 г. – С.247

4. , , Солоницын маточно-плацентарного кровотока как фактор риска развития осложнений беременности. // Материалы первого международного конгресса по репродуктивной медицине, Москва 8-12 июня. – 2006. – С.244

5. , , Ведущие факторы риска развития ЗВРП. // Материалы 8-го Всероссийского научного форума «Мать и дитя»– С46-47.

6., , Никитина нейроспецифической енолазы в повреждении клеток эндотелия сосудов плаценты при гестозе // Материалы I Международного Конгресса по репродуктивной медицине, 8-12 июня, 2006. – С. 223

7., , Шеманаева факторов ангиогенеза в развитии гестоза. // XIV Российский национальный конгресс Человек и лекарство. Москва, 16-20 апреля 2007 г. С.31

8., , Шеманаева критерии тяжести течения гестоза. // Проблемы беременности. Научно-практический журнал. –М. – 2007. -№17. – С.49-54.