Особенности фармакокинетики фексофенадина при совместном применении с верапамилом и негрустином (стр. 1 )

Особенности фармакокинетики фексофенадина при совместном применении с верапамилом и негрустином

15.00.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московская Медицинская Академия им. Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

профессор Галина Владиславовна Раменская

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук Виктор Владимирович Чистяков

Доктор фармацевтических наук,

доцент Владимир Леонидович Белобородов

Ведущая организация:

Государственное Учреждение Научно-исследовательский Институт Фармакологии имени РАМН

Защита состоится « » ___________ 2007 г. в ____ часов на заседании Диссертационного 208.040.09 в Московской Медицинской Академии им. Москва, Никитский б-р, 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. г. Москва, Нахимовский пр-т, д. 49.

Автореферат разослан «___» апреля 2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета:

доктор фармацевтических наук,

профессор Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Фексофенадин, производное гидроксиметилпиперидина и бензолуксусной кислоты, широко используется в последние годы для устранения симптомов сезонного аллергического ринита, симптомов хронической идиопатической крапивницы. Являясь в основном «сезонным» препаратом, фексофенадин часто применяется на фоне терапии основного заболевания.

Известно, что фармакологический эффект зависит от концентрации препарата в зоне рецептора, которая, в свою очередь, коррелирует с концентрацией в плазме крови. В то же время на концентрацию оказывает влияние ряд факторов, таких как состояние органов и систем, пища, возраст, генетические факторы и другие. Одним из основных факторов является взаимодействие лекарственных средств при их совместном приеме [ и др., 2004; Roberts S. A., 2001; White R. E., 2000].

Среди видов взаимодействия (фармацевтическое, фармакокинетическое и фармакодинамическое) именно вследствие фармакокинетического взаимодействия возникает наибольшее число побочных эффектов при совместном применении лекарственных средств.

Для изучения фармакокинетического взаимодействия, прежде всего, необходим аналитический метод, позволяющий уверенно следить за концентрацией лекарственного средства не менее 3-4 периодов полувыведения [, , 2003].

В настоящее время наиболее перспективным и широко использующимся для этих целей является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с различными типами детекции. В связи с тем, что в отечественной литературе отсутствуют методики определения фексофенадина в плазме крови, а методики зарубежных авторов трудоемки, экономически недоступны или обладают недостаточными точностью и селективностью, актуальной является разработка высокочувствительной и экономически доступной методики определения фексофенадина в плазме крови, в том числе в присутствии других ксенобиотиков. Все вышеизложенное определило цели и задачи исследования.

Цель исследования: изучить особенности фармакокинетики фексофенадина при совместном применении верапамила и негрустина.

Задачи исследования:

1.  Изучить хроматографические характеристики фексофенадина и разработать методику ВЭЖХ для его обнаружения в плазме крови.

2.  Подобрать условия экстракции и количественного определения фексофенадина в плазме крови методом ВЭЖХ.

3.  Изучить динамику концентрации фексофенадина в плазме крови человека и лабораторных животных до и после курсового приема верапамила.

4.  Рассчитать фармакокинетические параметры фексофенадина после его однократного перорального приема на фоне верапамила у людей и животных.

5.  Изучить динамику концентрации фексофенадина в плазме крови человека и лабораторных животных до и после курсового приема негрустина.

6.  Рассчитать фармакокинетические параметры фексофенадина после его однократного перорального приема на фоне негрустина у людей и животных.

7.  Оценить влияние верапамила и негрустина на фармакокинетику фексофенадина.

Научная новизна.

Впервые разработана методика определения фексофенадина в плазме крови методом ВЭЖХ с использованием спектрофотометрического детектора и изократического режима элюирования.

Впервые изучены фармакокинетические параметры фексофенадина после совместного приема с верапамилом и экстрактом зверобоя у человека и лабораторных животных.

Показана способность верапамила повышать, а экстракта зверобоя понижать содержание фексофенадина в плазме крови человека и лабораторных животных.

Практическая значимость работы.

Разработанная методика определения фексофенадина в плазме крови методом ВэЖХ внедрена и применяется в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН при проведении фармакокинетических исследований.

Полученные результаты изменения фармакокинетики фексофенадина при совместном применении верапамила и негрустина были пользованы при подготовке учебного пособия «Нежелательные эффекты лекарственных средств» (М.: Издательский дом «Русский врач», 2006).

Апробация работы.

Апробация работы проведена на кафедре фармацевтической химии с курсом токсикологической химии.

Основные результаты работы доложены на XII-м и XIII-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005 и 2006 гг.), Пятой международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2005 г.), Х-м международном съезде Фитофарм 2006 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2006 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом:

Диссертационная работа выполнена на кафедре фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им. в соответствии с плановой темой «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (номер государственной регистрации - 01.200.110545).

Публикации по работе.

По результатам выполненной работы опубликовано 5 печатных работ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1.  Разработанная методика ВЭЖХ для обнаружения и количественного определения фексофенадина в плазме крови.

2.  Данные концентрации фексофенадина на фоне совместного применения верапамила или негрустина у лабораторных животных и пациентов.

3.  Результаты оценки влияния верапамила и негрустина на фармакокинетику фексофенадина у животных и человека.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, главы «Обзор литературы», экспериментальной части, состоящей из главы «Материалы и методы», главы «Разработка методики ВЭЖХ для определения фексофенадина в плазме крови», двух глав, посвященных результатам исследования и их обсуждения, общих выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя из 128 наименований (в том числе 20 отечественных и 108 зарубежных источников литературы), и приложений, содержащих иллюстративный материал.

Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка, 20 таблиц и 9 приложений.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Оборудование, реактивы и материалы

В работе использовалась хроматографическая система «Shimadzu» (Япония) со спектрофотометрическим детектором, интегратором «Shimadzu C-R6A», петлевым краном-дозатором (инжектором для ввода пробы) типа «Reodyne 7125» (США) с петлей ввода на 50 мкл. В анализе использовалась колонка «μ-Bondapack Phenyl» 3,9 х 300 мм (зернение 10 мкм). Ввод проб в петлю хроматографа производился с помощью шприцов «Hamilton» (США).

На этапе разработки методики анализа фексофенадина применялись также обращеннофазные хроматографические колонки Separon C18 (3 x 150 мм, 7 мкм), Phenomenex Luna C18 (4,6 x 150 мм, 5 мкм), Symmetry Sheild RP8 (5 мкм), Диасфер 110-Нитрил (4 х 150 мм, 5 мкм).

В качестве вспомогательного оборудования применялась центрифуга «Heraeus-christ Labofuge GL», встряхиватель для пробирок «Shaker S3», вибросмеситель «Vortex», роторно-вакуумный испаритель «RV 05 basic 1-B».

Разработка методики проводилась с использованием субстанции фексофенадина гидрохлорида, предоставленной фирмой (Aventis Pharmaceuticals Inc., Франция). Субстанция имела сертификат качества, подтверждающий количественное содержание фексофенадина гидрохлорида 99,2 %. Количественное определение фексофенадина в плазме крови проводилось после приема испытуемыми таблеток Телфаст (фексофенадина гидрохлорид), производства Aventis Pharmaceuticals Inc., Франция.

На этапе подбора условий экстракции фексофенадина из плазмы крови и выбора состава подвижной фазы использовались следующие реактивы марок «для ВЭЖХ» и «ХЧ»: ацетонитрил, дихлорметан, этилацетат, натрия гидроксид, кислота хлористоводородная, триэтиламин, этиловый спирт, диэтиловый эфир, кислота уксусная, кислота ортофосфорная, гептан, хлороформ, трихлоруксусная кислота.

Тактика фармакокинетического исследования

В исследовании фармакокинетики препарата Телфаст принимали участие 14 пациентов (7 мужчин и 7 женщин). Возраст испытуемых варьировал от 28 до 52 лет. Средний возраст составил 42,3 + 0,5 лет. Пациенты принимали все лекарственные препараты по медицинским показаниям. Всем испытуемым, получавшим до исследования Н1-блокаторы, БМКК и препараты на основе экстракта зверобоя, данные препараты были отменены не менее чем за 7 дней до начала исследования.

В первый день исследования отбор образцов крови производился непосредственно перед приемом испытуемыми одной таблетки Телфаст, 180 мг и через каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24 часа после приема. Затем пациентов разделили на 2 группы: первая группа принимала по 80 мг препарата Изоптин (верапамил) производства «Knoll AG» (Германия) три раза в день в течение 10 дней, 2-я группа - капсулы Негрустин, содержащие 425 мг сухого экстракта зверобоя 3,5 – 6:1, «Hexal AG» (Германия) 3 раза в день в течение 14 дней. На следующий день после завершения приема верапамила или негрустина пациенты обеих групп принимали таблетку Телфаст 180 мг и через вышеуказанные промежутки времени производился отбор образцов крови.

По аналогичной схеме было проведено исследование фармакокинетики фексофенадина у 12 кроликов (6 животных в группе с приемом верапамила и 6 животных в группе с негрустином).

Образцы крови для количественного определения фексофенадина отбирались в объеме 5 – 7 мл. Пробы центрифугировались для отделения плазмы при 3000 об/мин в течение 10 минут и хранились до анализа при температуре -37 °С.

Количественное определение фексофенадина гидрохлорида в плазме крови человека и животных проводили методом ВЭЖХ.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

В результате серии экспериментов с использованием различных колонок и составов подвижных фаз для анализа фексофенадина в плазме крови оптимальными была признана приведенная ниже методика хроматографирования. Оптимальной для анализа фексофенадина была признана колонка для обращеннофазной хроматографии Waters μ-Bondapack Phenyl 3,9 x 300 мм, сорбент которой представляет собой гранулы силикагеля с химически привитыми фенильными гидроксилами. Длина волны спектрофотометрического детектора для определения фексофенадина была определена экспериментально и составила 220 нм.

Наилучшее разделение пика фексофенадина от пиков соэкстрактивных веществ наблюдалось при скорости подвижной фазы 1 мл/мин. Состав подвижной фазы для анализа фексофенадина подбирался на этапе разработки методики анализа. Оптимальным оказался следующий состав подвижной фазы: кислота уксусная 1,8 %, с содержанием триэтиламина 0,5 %, доведенная кислотой ортофосфорной концентрированной до рН 4,0 и ацетонитрил в соотношении 68:32 по объему.

Экстрагирование фексофенадина из плазмы крови добровольцев и лабораторных животных проводили следующим образом: к 1 мл плазмы добавляли 250 мкл 2 М кислоты хлористоводородной, перемешивали на приборе «Vortex», а затем добавляли по 2 мл дихлорметана, этилацетата и диэтилового эфира и помещали на 10 минут на встряхиватель для пробирок. После центрифугирования в течение 10 минут при 4500 об/мин органический слой отбирали в колбы для упаривания и при помощи роторно-вакуумного испарителя удаляли растворитель. Сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы, из них 50 мкл наносили на колонку хроматографа.

Хроматографические характеристики разработанного метода представлены в таблице 1, образцы полученных хроматограмм - на рисунках 1, 2 и 3.

 

Рисунок 1. Образец хроматограммы, полученной из водного раствора фексофенадина 1000 нг/мл (tr = 13,933 мин.).

 

Рисунок 2. Образец хроматограммы, полученной из плазмы крови с содержанием фексофенадина 1000 нг/мл (tr = 13,173 мин.).

 

Рисунок 3. Образец хроматограммы, полученной из плазмы крови, не содержащей фексофенадина.

Количественное определение препарата проводилось методом абсолютной калибровки по высоте пика фексофенадина. Для этого использовались калибровочные растворы с концентрациями препарата 50; 100; 200; 400; 600; 800; 1000 нг/мл. Приготовление калибровочных растворов осуществляли путем добавления к плазме крови, не содержащей фексофенадин стандартного раствора с концентрацией препарата 10 мкг/мл в количестве 5; 10; 20; 40; 60; 80; 100 мкл. Для приготовления 10 мл стандартного раствора 10 мг субстанции фексофенадина растворяли в 10 мл метанола (раствор А), затем к 1 мл раствора А добавляли 9 мл воды дистиллированной и тщательно перемешивали (раствор Б). Стандартный раствор получали путем разбавления 1 мл раствора Б 9 мл воды дистиллированной. Далее поступали, как указано выше. В указанном диапазоне концентраций калибровочная зависимость имела линейный характер (рисунок 4).

Таблица 1

Хроматографические характеристики метода анализа

фексофенадина в водном растворе и в плазме крови

Хроматографические параметры	В водном растворе	В плазме крови
Время удерживания, мин	13,9	13,2
Число теоретических тарелок N = 16·(tr/W1/2)2	3835	3428
Высота, эквивалентная теоретической тарелке, ВЭТТ(h) = L/N, мкм	78,2	87,5
Приведенная ВЭТТ, ПВЭТТ = ВЭТТ/dc	1278,2	1142,6
Селективность, Α = (tr2 – t0)/(tr1 – t0)	1,22	1,17
Коэффициент удерживания, К = tr /t0	4,5	5,3
Коэффициент емкости, K´ = (tr – t0)/t0	3,5	4,0

W1/2 – ширина пика на полувысоте, мм;

t0— мертвое время колонки (время удерживания несорбируемого компонента), мин;

tr1 — время выхода фексофенадина, мин;

tr2 – время выхода пика, ближайшего к пику фексофенадина, мин.

Рисунок 4. Калибровочный график фексофенадина в плазме крови.

Уравнение калибровочной зависимости для определения фексофенадина в плазме крови:

y = ах + b = 0,0597x - 0,0068, где у – высота пика фексофенадина, мм, х – содержание фексофенадина в стандартном растворе, нг/мл. Коэффициент регрессии r для данной калибровочной зависимости равен 0,9923.

Предел обнаружения фексофенадина в плазме крови составил 8,4 нг/мл. Для оценки точности и воспроизводимости разработанной методики определения фексофенадина в плазме крови по результатам 5 параллельных измерений 6 концентраций препарата были рассчитаны метрологические характеристики метода (таблица 2).

Таблица 2

Метрологические характеристики разработанной методики количественного определения фексофенадина в плазме крови, t(95%; 5) = 2,78

Концентрация стандартного раствора (нг/мл)	Результаты статистической обработки полученных данных
	s2	∆x	+ ∆xср	εср, %
100,0	101,6	11,2	4,2	101,6 + 3,3	4,1
200,0	200,2	32,0	7,0	200,2 + 5,7	3,5
300,0	299,2	59,6	9,6	299,2 + 7,7	3,2
400,0	399,0	84,6	11,4	399,0 + 9,2	2,9
500,0	499,3	148,0	15,1	499,3 +12,2	3,0
600,0	598,6	131,2	14,2	598,6 + 11,5	2,4

Полученные результаты показывают необходимую точность разработанной методики количественного определения фексофенадина (относительная величина систематической ошибки не превышала 4,1 % при определении фексофенадина в водном растворе и 6,8 % при определении в плазме крови). Разработанная методика была использована нами в фармакокинетическом исследовании фексофенадина при совместном приеме с верапамилом и негрустином.

На рисунке 5 представлены фармакокинетические кривые фексофенадина в плазме крови кроликов до приема верапамила.

Рисунок 5. Динамика содержания фексофенадина в плазме крови кроликов до приема верапамила (n = 6).

Рисунок 6. Динамика содержания фексофенадина в плазме крови кроликов после приема верапамила (n = 6).

Средняя максимальная концентрация в плазме крови (Сmax) составила 240,4 + 18,2 нг/мл (CV = 8 %), время, необходимое для ее достижения (Тmax) 4 ч (CV = 0), а период полувыведения (T1/2) - 9,4 + 7,0 ч (CV = 75 %).

На рисунке 6 показаны фармакокинетические кривые фексофенадина после приема верапамила. Необходимо отметить значительное увеличение межиндивидуального разброса значений концентраций у кроликов после приема верапамила по сравнению с разбросом концентраций до его приема (СV для Сmax с 8 % увеличился до 43 %, а для Тmax увеличился с 0 до 84 %). Статистическая достоверность различий между содержанием фексофенадина в плазме до и после приема верапамила была подтверждена результатами проведенного t-теста для средних (р ≤ 0,05).

Результаты исследования указывают на значительное увеличение уровня препарата в плазме крови после приема верапамила и выраженное сокращение времени, необходимого для достижения максимальной концентрации в плазме крови (в среднем на 2 часа). Влияние верапамила на фармакокинетику фексофенадина представлено на рисунке 7.

Рисунок 7. Фармакокинетические кривые фексофенадина у кроликов до и после приема верапамила (n = 6).

В таблице 3 приведены фармакокинетические параметры фексофенадина у кроликов до и после приема верапамила. Необходимо отметить значительное увеличение биодоступности препарата после приема верапамила. AUC0-24, исходно составлявший 1375 + 254 (CV = 23 %), после приема верапамила увеличился до 3222 + 1014 (CV = 39 %), средняя Сmax находившаяся до приема верапамила в пределах 240,4 + 14,5 нг/мл (CV = 8 %) после его приема достоверно увеличилась до 483,7 + 167,8 нг/мл (CV = 43 %). Tmax в плазме крови кроликов статистически достоверно сократилось с 4,0 ч (CV = 0) до 2,0 + 1,34 ч (CV = 84 %).

Изменение параметров T1/2 и MRT после 10-дневного приема верапамила статистически не достоверно.

В исследовании фексофенадина у добровольцев было также установлено статистически достоверное увеличение биодоступности фексофенадина после приема верапамила. На рисунках 8 и 9 представлены фармакокинетические кривые фексофенадина у испытуемых до и после приема верапамила соответственно.

Таблица 3

Фармакокинетические параметры фексофенадина

у кроликов до и после приема верапамила (n = 6)

Фармакокинетические параметры	Статистическая обработка результатов
	s2	∆х	CV, %	хmin	xmax
до приема верапамила	AUC0-24, нг/л·ч	1375	318	254	23	1012	1856
AUC0-∞, нг/л·ч	2449	1610	1288	66	1452	5511
Tmax, ч	4,0	0	0	0	4,0	4,0
Cmax, нг/мл	240,4	18,2	14,5	8	210,7	260,9
Cl, л/ч	10,1	18,1	14,5	179	4,4	51,2
Kel, ч-1	0,07	0,11	0,09	148	0,04	0,31
MRT, ч	14,4	9,6	7,6	67	5,0	24,7
T1/2, ч	9,4	7,0	5,6	75	2,3	18,7
Vd, л	136,8	31,0	24,8	23	97,0	178,0
после приема верапамила	AUC0-24, нг/л·ч	3222*	1267	1014	39	1972	5308
AUC0-∞, нг/л·ч	3800	1267	1014	33	2578	5885
Tmax, ч	2,0*	1,7	1,3	84	1,0	5,0
Cmax, нг/мл	483,7*	209,7	167,8	43	118,0	715,4
Cl, л/ч	4,0	2,3	1,9	59	2,4	8,6
Kel, ч-1	0,06	0,02	0,02	36	0,04	0,10
MRT, ч	10,0	4,4	3,5	44	4,3	16,3
T1/2, ч	10,9	4,5	3,6	41	6,9	19,2
Vd, л	62,9**	22,4	17,9	36	33,9	91,3

* - достоверность различий фармакокинетических параметров фексофенадина в плазме крови кроликов до и после курса приема верапамила (* - р<0,05; ** - р<0,01).