Изучение, разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации уреаплазм (стр. 3 )

Таблица 7

Изменение оптической плотности среды и накопление клеток в процессе роста культур Ureaplasma spp.

Фаза кривой изменения оптической плотности среды	Соответствующая фаза роста культуры
латентная	лаг-фаза и экспоненциальная до накопления 2·105 клеток/мл
экспоненциального роста	экспоненциальная
точка перегиба	замедление роста и вступление в стационарную фазу
замедления роста	стационарная и отмирания

Таблица 8

Накопление клеток Ureaplasma spp. в экспоненциальной фазе роста оптической плотности среды

оптическая плотность среды	накопление клеток в 1 мл среды
0,6	0,6·106 ± 0,2·106
0,7	0,9·106 ± 0,2·106
0,8	1,3·106 ± 0,3·106
0,9	1,6·106 ± 0,4 ·106
1,0	1,8·106 ± 0,6·106
1,11	1,9·106 ± 0,6·106
1,2	1,9·106 ± 0,6·106

Таким образом, измерение ОП среды в процессе роста бактерий рода Ureaplasma в разработанной питательной среде в стандартных условиях культивирования позволяет оценить накопление жизнеспособных клеток уреаплазм. Полученные нами результаты использованы для контроля качества питательной среды и стандартизации инокулята при определении чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам.

Оценка ростовых свойств питательной среды для выявления Ureaplasma spp.

Оценка ростовых свойств разных серий питательной среды для выявления Ureaplasma spp., а также основных ее компонентов, является важнейшим этапом приготовления среды, необходимым для успешного обнаружения уреаплазм в образцах клинического материала.

Нами предложен оригинальный метод оценки ростовых свойств питательной среды, основанный на анализе кривых изменения ОП среды. Оценка ростовых свойств включает в себя 2 этапа: 1). Культивирование тест-штамма Ureaplasma spp. в среде сравнения и испытуемой в стандартных условиях в течение одного и того же времени при одинаковой концентрации тест-штамма в контрольных и опытных лунках. 2). Анализ кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в среде сравнения и испытуемой.

Кривые изменения ОП среды будут одинаковыми в том случае, если условия культивирования тест-штамма в контрольных и опытных лунках также одинаковы. Это возможно при соблюдении следующих условий: 1) культивировании в стандартных условиях; 2) инкубации в течение одного и того же времени; 3) одинаковой концентрации тест-штамма Ureaplasma spp. в контрольных и опытных лунках (условия 1-3 задаются при постановке методики); 4) одинаковых ростовых свойствах питательных сред (сравнения и испытуемой). На рис. 7 представлены кривые изменения ОП в процессе роста тест-штамма в средах, обладающих одинаковыми ростовыми свойствами.

Изменение (ухудшение, обусловленное присутствием ингибиторов роста уреаплазм) ростовых свойств испытуемой среды сопровождалось изменением накопления клеток и, как следствие, изменением кривой зависимости ОП среды от времени. В процессе роста штамма U. parvum 455 в питательной среде, содержащей 250 мМ хлорида натрия (известно, что уреаплазмы высоко чувствительны к изменению осмотического давления среды), наблюдали увеличение латентной фазы, а также снижение скорости изменения ОП среды в экспоненциальной фазе (рис. 8).

Таким образом, изменение ОП среды в процессе роста культур тест-штамма в питательных средах сравнения и испытуемой, отражающее накопление жизнеспособных клеток, при соблюдении определенных условий (стандартных условий культивирования в планшетах, одинаковой концентрации клеток тест-штамма в начальный момент в контрольных и опытных лунках, одинаковом времени инкубации) позволяет сравнить ростовые свойства сред. Предложенный метод позволяет проводить сравнение сред в процессе роста культур как по интегральному показателю (площади под кривыми изменения ОП), так и по отдельным показателям (продолжительности латентной фазы, скорости изменения ОП, значения ОП в точке перегиба

кривых).

Рис. 7. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штамма U. parvum 468 в питательной среде сравнения (1) и испытуемой среде (2). Концентрация жизнеспособных клеток уреаплазм в начальный момент составляла 2·104 клеток/мл (1, 2).

Рис. 8. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штамма U. parvum 455 в питательной среде сравнения (1) и испытуемой среде (2). Испытуемая среда содержала 250 мМ хлорида натрия. Концентрация жизнеспособных клеток уреаплазм в начальный момент составляла 2·104 клеток/мл (1, 2).

Определение чувствительности штаммов Ureaplasma spp.

к антибактериальным препаратам

Бактерии рода Ureaplasma являются условно-патогенными микроорганизмами; вместе с тем при наличии клинических проявлений заболевания, при доказанной этиологической значимости уреаплазм назначают антибактериальные препараты (АБП).

Нами предложен микрометод определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП, являющийся модификацией метода серийных разведений в жидкой питательной среде и основанный на использовании пограничных концентраций препаратов. Пограничные концентрации АБП позволяют отнести штаммы уреаплазм к определенной группе по степени чувствительности (чувствительных, умеренно-чувствительных и устойчивых). По нашему мнению, пограничные концентрации должны отражать МИК50 и МИК90, которые являются основными показателями, характеризующими активность АБП. Минимальная пограничная концентрация, разделяющая чувствительные и умеренно-чувствительные штаммы, соответствует МИК50; максимальная, дифференцирующая умеренно-чувствительные и устойчивые штаммы - МИК90. Значения МИК, которые были определены классическим микрометодом серийных разведений АБП в жидкой питательной среде, представлены в табл. 9.

Таблица 9

Минимальные ингибирующие концентрации антибактериальных препаратов

Антибактериальный препарат	Минимальная ингибирующая концентрация, мкг/мл
пределы колебаний	МИК50	МИК90
минимальное значение	максимальное значение
доксициклин	≤ 0,125	16,0	0,25	2,0
эритромицин	0,25	16,0	2,0	8,0
азитромицин	≤ 0,125	4,0	0,5	2,0
кларитромицин	≤ 0,125	4,0	2,0	4,0
мидекамицин	≤ 0,125	4,0	2,0	4,0
джозамицин	≤ 0,125	4,0	2,0	4,0
спирамицин	32,0	> 60,0	-	-
линкомицин	> 32,0	-	-	-
клиндамицин	≥ 32,0	-	-	-
ципрофлоксацин	0,5	8,0	2,0	4,0
офлоксацин	0,5	4,0	2,0	4,0

Установленные значения МИК50 и МИК90 использовали для приготовления ряда питательных сред с АБП для оценки чувствительности клинических штаммов Ureaplasma spp. методом пограничных концентраций (рис. 9, табл. 10).

 

Рис. 9. Определение чувствительности одного из штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам методом серийных разведений с использованием пограничных концентраций. Клм5 – клиндамицин 5 мкг/мл; Лм30 – линкомицин 30 мкг/мл; Крм2, Крм4 – кларитромицин 2, 4 мкг/мл; Азм2 – азитромицин 2 мкг/мл; См50 – спирамицин 50 мкг/мл; Эм2, Эм8 – эритромицин 2, 8 мкг/мл; Мм2, Мм4 – мидекамицин 2, 4 мкг/мл; Дм2, Дм4 – джозамицин 2, 4 мкг/мл; Оф2, Оф4 – офлоксацин 2, 4 мкг/мл; Цф2, Цф4 – ципрофлоксацин 2, 4 мкг/мл; Дц2 – доксициклин 2 мкг/мл. К+ положительный контроль; К - отрицательный контроль.

Получены данные, свидетельствующие о существовании штаммов Ureaplasma spp. с различной степенью чувствительности к АБП. Большинство исследованных штаммов были высоко чувствительны к доксициклину и макролидам (за исключением эритромицина и спирамицина, обладающих меньшей активностью). Доксициклин и макролиды ингибировали рост большинства штаммов уреаплазм (от 72,8% для мидекамицина и до 100% для азитромицина) в низкой концентрации (МИК ≤ 2 мкг/мл). Однако, наряду со штаммами Ureaplasma spp., обладающими высокой чувствительностью к доксициклину и макролидам, были выявлены устойчивые штаммы. Так, 2,9% штаммов были устойчивы к доксициклину, 3,8% - к эритромицину, 0,7% - к мидекамицину, 0,2% - к джозамицину. При этом не выявлено ни одного штамма, устойчивого к азитромицину и кларитромицину. Менее эффективными in vitro в отношении Ureaplasma spp. оказались фторхинолоны. Значительное количество исследованных штаммов было устойчиво к ципрофлоксацину и офлоксацину (42,7% и 17,9%, соответственно). Высоко чувствительными к ципрофлоксацину и офлоксацину оказались только 37,2% и 44,9% штаммов, соответственно.

Таблица 10

Распределение штаммов Ureaplasma spp. (общее количество 452) по степени чувствительности к антибактериальным препаратам

Антибактериальный препарат	Абсолютное число и процент штаммов
чувствительных	умеренно-чувствительных	устойчивых
доксициклин1	,1)	-	13 (2,9)
эритромицин	89 (19,7)	,5)	17 (3,8)
азитромицин2		-	0
кларитромицин		36 (8)	0
мидекамицин	,3)		3 (0,7)
джозамицин	,7)	59 (13,1)	1 (0,2)
спирамицин3	-	,4)	,6)
линкомицин	0	0
клиндамицин	0	0
ципрофлоксацин	,2)	91 (20,1)	,7)
офлоксацин	,9)	,2)	81 (17,9)

Примечание.

1, 2 Использовали одну пограничную концентрацию доксициклина и азитромицина 2 мкг/мл, дифференцирующую штаммы уреаплазм на чувствительные и устойчивые.

3 Использовали одну пограничную концентрацию спирамицина 50 мкг/мл, дифференцирующую штаммы уреаплазм на умеренно-чувствительные и устойчивые.

Как и следовало ожидать, все исследованные штаммы Ureaplasma spp. были устойчивы к линкозамидам линкомицину и клиндамицину. При этом, как отмечено ранее, все штаммы были чувствительны к макролидам азитромицину и кларитромицину. Предлагаем использовать такое различное отношение штаммов к указанным антибиотикам как дополнительный дифференциальный признак для идентификации бактерий рода Ureaplasma spp..

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствовали о целесообразности определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП. Определение чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП in vitro может служить, во-первых, основанием для рационального выбора антибактериальной терапии, направленной на элиминацию уреаплазм из организма, и, во-вторых, дополнительным критерием идентификации штаммов уреаплазм по их чувствительности к антибиотикам группы макролидов азитромицину и кларитромицину и устойчивости к антибиотикам группы линкозамидов линкомицину и клиндамицину.

Разработка микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма микротест» и оценка ее диагностической эффективности в государственных испытаниях

На основе предложенных сред нами разработана микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест». Микротест-система предназначена для культивирования штаммов Ureaplasma spp. в стандартных условиях; выявления и идентификации Ureaplasma spp. в образцах клинического материала; определения концентрации жизнеспособных клеток в культурах Ureaplasma spp. и образцах клинического материала; а также определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП.

В состав микротест-системы входят пять компонентов: транспортная среда, среда роста, среды с АБП, стерильное минеральное масло, стерильный 96-луночный планшет. Стандартный формат планшетов делает их пригодными для проведения как визуального, так и автоматизированного учета результатов исследования с помощью планшетных фотометров.

Основным преимуществом микротест-системы «Уреаплазма микротест» является стандартизация микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции, позволяющая получить достоверные, воспроизводимые результаты. Нами это было достигнуто стандартизацией основных компонентов микротест-системы (использование стандартизованных компонентов сред, соблюдение технологии приготовления, оценка ростовых свойств питательной среды и ее отдельных компонентов) и методики проведения исследования (микротест-система содержит все необходимые для проведения исследования компоненты, методика исследования изложена в виде инструкции по применению микротест-системы).

Обусловленная широким распространением бессимптом­ного носительства уреаплазм и отсутствием четких клинических проявлений уреаплазменной инфекции невозможность разделения на опытную («больных») и контрольную («здоровых») группы затрудняла оценку микротест-системы «Уреаплазма микротест» в клинико-эпидемиологических испытаниях.

В связи с этим нами была разработана и использована новая методика сравнительной оценки эффективности микротест-системы, предназначенной для диагностики инфекции, вызыва­е­мой условно-патогенными бактериями рода Ureaplasma. Методика позволяет вы­числять критерий диагностической эффективности U в условиях отсутствия четкого деления на опытную и контроль­ную группы. В такой ситуации показатель чувствительности Se нельзя найти из опытов с достаточной точностью, но показатель специфичности Sp можно определить по группе пациентов с отрицательными результатами ПЦР, т. е. с достоверным отсутствием возбудителя. Критерий диагностической эффективности: U(P) = P·Se + (1–P)·Sp характеризует точность диагностического препарата, т. е. насколько правильно микротест-система выявляет наличие или отсутствие возбудителя при распространенности заболева­ния P.

Нами предложено ранее не применявшееся понятие доли всех положительных результатов тестов W (отно­ше­ние общего числа положительных тестов к общему числу всех тестов). Se, Sp и W связаны между собой формулой: W = P×Se + (1–P)×(1–Sp). Исходя из этого: Se = (W – (1–P)×(1–Sp)) / P и, соответственно, U (P) = W – (1–P)·(1–2Sp). На основе данных, полученных при проведении государственных испытаний и представленных в табл. 11, строили графики зависимости U от P: U = U(P).

Таблица 11

Результаты выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала с использованием микротест-системы «Уреаплазма микротест» и контрольных сред (ГУ НИИЭМ им. и bioMerieux) и в ПЦР

Питательная среда	Результаты посева	Результаты ПЦР
положительный результат	отрицательный результат
«Уреаплазма микротест» (1)	Рост Ureaplasma spp.	141	2
Отсутствие роста Ureaplasma spp.	2	60
ГУ НИИЭМ (2)	Рост Ureaplasma spp.	141	2
Отсутствие роста Ureaplasma spp.	2	60
bioMerieux (3)	Рост Ureaplasma spp.	143	0
Отсутствие роста Ureaplasma spp.	0	62

Из графиков U=U(P), показанных на рис. 10, видно, что микротест-система «Уреаплазма Микротест», имеет диагностическую эффективность такую же как питательная среда ГУ НИИЭМ им. и соизмеримую с диагностической эффективностью среды bioMerieux.

Рис. 10. Диагностическая эффективность U микротест-системы «Уреаплазма микротест» (1), питательных сред для выявления Ureaplasma spp. ГУ НИИЭМ им. (2) и bioMerieux (3) в зависимости от распространенности заболевания P.

Таким образом, разработанная микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест», обеспечивающая стандартизацию микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции, обладает высокой диагностической эффективностью.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны питательная среда для культивирования бактерий рода Ureaplasma, обладающая высокими ростовыми и селективными свойствами, и транспортная среда, обеспечивающая оптимальные условия для сохранения жизнеспособности уреаплазм. Использование сред позволяет эффективно выявлять Ureaplasma spp. в образцах клинического материала.

2. Показано, что примененные для Ureaplasma spp. методы определения наиболее вероятного количества бактерий и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени могут быть использованы для определения концентрации уреаплазм в исследуемом материале.

3. Показано, что изменение оптической плотности среды в процессе роста бактерий рода Ureaplasma в стандартных условиях культивирования на разработанной питательной среде отражает накопление жизнеспособных клеток уреаплазм в поздней экспоненциальной фазе роста культур.

4. Разработан метод оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. на основе анализа кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в стандартных условиях культивирования в средах сравнения и испытуемой. Метод позволяет дифференцировать ростовые свойства разных серий указанной среды, а также отдельных ее компонентов.

5. Предложен микрометод определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам, являющийся модификацией метода серийных разведений в жидкой питательной среде, с использованием пограничных концентраций.

6. Разработана микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma urealyticum (Ureaplasma spp.) «Уреаплазма микротест», обеспечивающая стандартизацию выявления, оценки количества и определения чувствительности бактерий рода Ureaplasma к антибактериальным препаратам.

7. Разработана методика оценки качества микротест-системы «Уреаплазма микротест» в клинико-эпидемиологических испытаниях, позволяющая определить диагностическую эффективность препарата, предназначенного для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.  , , Говорун значение определения биоваров Ureaplasma urealyticum с использованием ПЦР-диагностики. «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» Сборник трудов под редакцией академика РАМН . Москва, 1998. С. 31-34.

2.  , , «Метод оценки питательных сред для диагностики уреаплазмоза». Материалы Международной конференции «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы». Санкт-Петербург, 2003, с. 50.

3.  , Безруков среда для выявления Ureaplasma urealyticum и способ диагностики урогенитальных уреаплазмозов. Патент РФ 2265656 С1, 2004.

4.  , Шобухова микротест-системы для выявления и идентификации Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век». Саратов, 2004, с. 32-33.

5.  , Шобухов Ureaplasma urealyticum в жидкой питательной среде методом наиболее вероятного количества. Материалы научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний». Нижний Новгород, 2004, с. 255-258.

6.  , , Об условиях применимости метода наиболее вероятного количества для определения концентрации бактерий Ureaplasma urealyticum в жидкой питательной среде. Тезисы 1-й Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций». Москва, 2004, с. 9-10.

7.  , , Шобухова методов определения Ureaplasma urealyticum. Тезисы международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». Новосибирск, 2004, с. 225.

8.  , «Уреаплазма микротест» и «Микоплазма микротест» - новые микротест-системы для диагностики урогенитальных микоплазмозов. Сборник трудов 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» под редакцией академика РАМН , М., 2004, т.1, с. 10-12.

9.  , , Парашина оценка диагностических препаратов с учетом прогностической ценности. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2004, № 6, с. 53-55.

10.  , , Жуховицкий диагностической ценности ПЦР-тест-систем по результатам государственных испытаний. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005, № 2, с. 69-73.

11.  , О применении жидкой селективной питательной среды для количественного определения U. urealyticum. Клиническая лабораторная диагностика. 2005, № 9, с. 31.

12.  , Безруков диагностической ценности различных сред для выделения из клинического материала U. urealyticum и M. hominis. Клиническая лабораторная диагностика. 2005, № 9, с. 32-33.

13.  , , Г, , К вопросу о программе проведения государственных испытаний диагностических медицинских иммунобиологических препаратов при регистрации их в Российской Федерации. Биопрепараты. 2006, № 1 (21), с. 23-27.

14.  , , Быков стандарта цветности для определения концентрации уреаплазменных культур в жидкой питательной среде. Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний». Нижний Новгород, 2006, с. 145-147.

15.  , , Шобухов количественной оценки концентрации уреаплазменных культур в жидкой питательной среде. Технологии живых систем. 2006, т. 3, № 2, с. 28-37.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБП – антибактериальный препарат

МИБП – медицинский иммунобиологический препарат

МИК – минимальная ингибирующая концентрация

МИК50 – минимальная ингибирующая концентрация, подавляющая рост не менее 50% исследованных штаммов

МИК90 – минимальная ингибирующая концентрация, подавляющая рост не менее 90% исследованных штаммов

НВК – наиболее вероятное количество

ОП – оптическая плотность

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

ФСП – фармакопейная статья предприятия

ЦОЕ – цветообразующая единица