Изучение, разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации уреаплазм (стр. 1 )

На правах рукописи

Изучение, разработка и стандартизация

микротест-системы для выявления и идентификации уреаплазм

03.00.07 – микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2006

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени Росздрава

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор

доктор биологических наук

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени

РАМН

Защита состоится «___» ___________ 2006 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.08 при Московской медицинской академии имени , стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени ( Москва, Нахимовский проспект)

Автореферат разослан «___»___________ 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Уреаплазменная инфекция продолжает оставаться одной из актуальных проблем клинической микробиологии. Возбудители - Ureaplasma urealyticum и Ureaplasma parvum часто колонизируют урогенитальную систему человека. Обычно наблюдается бессимптомное носительство уреаплазм среди клинически здоровых лиц. Вместе с тем, уреаплазменная инфекция может сопровождаться развитием патологических процессов, в числе которых негонококковый уретрит, хориоамнионит, преждевременные роды, поражение дыхательной системы и ЦНС у преждевременно родившихся детей, артриты у лиц со сниженным иммунитетом и др. (, 1993; D. Taylor-Robinson, 1996; , 1999; M. Abele-Horn et al., 2000; C. Skevaki, D. A. Kafetzis, 2003). В связи с этим, существует необходимость в объективном и достоверном выявлении Ureaplasma spp. в клиническом материале.

Лабораторные методы исследований играют решающую роль в диагностике уреаплазменной инфекции вследствие отсутствия четких клинических проявлений, широкого распространения бессимптомного носительства и частого сочетания уреаплазм с другими инфекционными агентами. Несмотря на широкое использование в настоящее время молекулярно-биологических методов диагностики уреаплазменной инфекции, микробиологический метод сохранил позиции наиболее достоверного и информативного метода, позволяющего с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять бактерии рода Ureaplasma, определять их количество в исследуемом клиническом материале, а также чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам (K. B. Waites et al., 2001; , 2003).

Культивирование уреаплазм, чрезвычайно требовательных к составу питательных сред, связано с рядом трудностей, в числе которых отсутствие сред определенного состава, сложность состава сред, необходимость максимального соответствия состава питательным потребностям бактерий рода Ureaplasma, а также необходимость оценки ростовых свойств сред и их отдельных компонентов (, 1999; K. B. Waites et al., 2001).

В настоящее время отмечается тенденция перехода от классических микробиологических исследований к современным технологиям анализа; при этом большее значение придается оптимизации, стандартизации, а также упрощению и автоматизации метода. Весьма перспективным является использование микротест-систем, избавляющих практических микробиологов от трудоемких работ и позволяющих получить стандартные, воспроизводимые результаты ( и соавт., 2004).

Стремление к усовершенствованию и стандартизации микробиологического метода реализовано разработкой и внедрением в практику за рубежом ряда наборов для выявления и идентификации урогенитальных микоплазм, определения их количества и чувствительности к антибактериальным препаратам, в числе которых «Mycoplasma Lyo», «Mycoplasma IST» (bioMerieux, Франция); «Mycoplasma Duо», «Mycoplasma SIR» (Bio-Rad, Франция); «Mycofast All-In», «Mycofast Evolution 2», «Mycofast US» (International Microbio, Франция). Показано, перечисленные выше наборы обладают высокой диагностической эффективностью (M. Sillis, 1993; M. Abele-Horn et al., 1996; S. A. Poulin, R. B. Kundsin, 1997; и соавт., 1999; R. Aaltone et al., 2002; F.-C. Cheah et al., 2005). Однако в России эти диагностические наборы имеют ограниченное использование, прежде всего, в связи с их достаточно высокой ценой; некоторые из них недоступны вообще.

В нашей стране еще недостаточно решена проблема микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, хотя имеются питательные среды лабораторного изготовления для выявления Ureaplasma spp.; однако, производственный выпуск данных препаратов, разрешенных для использования в Российской Федерации, отсутствует.

В свете сказанного, несомненно важнейшей задачей является совершенствование микробиологического метода как основного, наиболее объективного и информативного метода диагностики уреаплазменной инфекции. Перечисленные выше предпосылки позволили сформулировать цель и определить задачи работы.

Цель исследования – разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp..

Задачи исследования

1. Разработать селективную питательную среду для культивирования Ureaplasma spp.. Изучить рост штаммов уреаплазм на предложенной среде. Оценить селективные свойства среды и пригодность для выявления уреаплазм в образцах клинического материала.

2. Разработать транспортную среду для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала.

3. Разработать метод оценки роста уреаплазм на основе измерения оптической плотности культур в процессе роста на предложенной питательной среде.

4. Разработать методику оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в лабораторных условиях.

5. Создать микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. и внедрить ее в практику здравоохранения.

6. Разработать методику оценки качества микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. в клинико-эпидемиологических испытаниях.

7. Разработать программу проведения государственных испытаний микротест-системы совместно с ГИСК им. и Комитетом МИБП.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложенная микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест» обеспечивает стандартизацию микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции.

2. Методы определения наиболее вероятного количества бактерий и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяют определить концентрацию уреаплазм в исследуемом материале.

3. Изменение оптической плотности среды в экспоненциальной фазе роста культуры Ureaplasma spp. в стандартных условиях культивирования отражает накопление жизнеспособных клеток уреаплазм.

4. Анализ кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста культур тест-штамма в средах сравнения и испытуемой в стандартных условиях позволяет оценить ростовые свойства испытуемой среды.

5. Критерий диагностической эффективности U=U(P) позволяет в клинико-эпидемиологических испытаниях определить ценность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.

Научная новизна

В связи с необходимостью усовершенствования микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, нами разработаны селективная питательная среда для культивирования и выявления Ureaplasma spp. и транспортная среда для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала. На основе разработанных сред впервые предложена микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. - «Уреаплазма Микротест».

Использование микротест-системы позволяет: 1) выявлять и идентифицировать бактерии рода Ureaplasma; 2) определять обсемененность исследуемого материала уреаплазмами, что важно для оценки их этиологической роли в развитии патологических процессов в урогенитальной системе; 3) оценивать чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам, являющуюся основанием для рационального выбора антибактериальной терапии и одновременно дифференциально-диагностическим критерием идентификации (по отношению штаммов Ureaplasma spp. к антибиотикам групп макролидов и линкозамидов).

Впервые предложен оригинальный метод определения концентрации уреаплазменных культур в экспоненциальной фазе роста по измерению оптической плотности среды, что позволило разработать метод строгой оценки ростовых свойств питательной среды в условиях лаборатории и стандартизовать инокулят при определении чувствительности штаммов Ureaplasma к антибактериальным препаратам.

Впервые разработан метод оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp., основанный на анализе кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в средах сравнения и испытуемой.

Разработана программа клинико-эпидемиологических испытаний диагностической микротест-системы с использованием принципов доказательной медицины. Показана высокая диагностическая эффективность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.

Научно-практическая значимость

В теоретическом плане проведенные исследования расширяют представления о биологических свойствах бактерий рода Ureaplasma; позволяют оптимизировать методические подходы к определению количества уреаплазм в культурах и образцах клинического материала и стандартизовать процесс выявления и идентификации Ureaplasma spp..

Практическая значимость работы заключается в том, что разработана технология производства микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест». Разработаны и утверждены фармакопейная статья предприятия ФСП № 42- на микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест»; инструкция по применению препарата № 01-041/135-05 и производственный регламент № 000.

Получен патент 2265656 на разработанную питательную среду для выявления Ureaplasma spp. и способ диагностики.

Полученный фактический материал представляет интерес при конструировании препаратов для диагностики урогенитальных микоплазмозов другой этиологии, например, вызванных Mycoplasma hominis.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на 1-й Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004); 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004); научной конференции кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией ММА им. (14 июня 2006 года, протокол ).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 в центральной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 39 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы и приложения. В работе использовано 39 отечественных и 223 зарубежных источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали штаммы микроорганизмов: 1) Ureaplasma spp. и Mycoplasma hominis коллекционные, из коллекции живых культур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. РАМН (U. parvum серотип 1, U. urealyticum серотип 8, M. hominis Н-34) и авторской коллекции штаммов урогенитальных микоплазм, выделенных от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. (U. parvum 455, 465, 468, 481; U. urealyticum 1Т, 2Т; M. hominis 199, 205, 233), а также свежевыделенные от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. ; 2) коллекционные штаммы бактерий (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Proteus morganii, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis), а также штамм Candida albicans из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. .

Для культивирования штаммов Ureaplasma spp. использовали питательную среду для выявления Ureaplasma spp. (, , 2004); стандартный бульон 10С (M. C. Shepard, C. D. Lunceford, 1978) и дифференциальный агар А7 (M. C. Shepard, C. D. Lunceford, 1976). Для культивирования штаммов M. hominis использовали стандартный бульон 10В (K. B. Waites et al., 2001). Коллекционные штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также штамм Candida albicans культивировали на питательном агаре, приготовленном на основе сердечно-мозговой вытяжки.

Штаммы Ureaplasma spp. засевали в 10 мл питательной среды, инкубировали при температуре 37 оС в течение 16-20 часов. Затем 100 мкл культуры в экспоненциальной фазе роста (о чем свидетельствовало начало изменения цвета питательной среды с желтого на красный) засевали вновь в 10 мл среды роста, инкубировали при температуре 37 оС в течение 16-20 часов до момента начала изменения цвета среды. Подготовленные таким образом культуры уреаплазм находились в экспоненциальной фазе роста и содержали минимальное количество нежизнеспособных клеток.

Культивирование уреаплазм в жидкой питательной среде в стандартных условиях проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах (Sarstedt, Германия) в объеме среды 250 мкл. Для предотвращения испарения среды, а также улетучивания и распространения аммиака, в лунки вносили по 70 мкл стерильного минерального масла. Оптическую плотность среды в процессе роста культур измеряли с помощью планшетного фотометра MRX (Dynex technologies, Inc., США) при длине волны 570 нм.

Штаммы Ureaplasma spp. также культивировали на дифференциальном агаре А7 при температуре 37 оС в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 72 часов.

Штаммы M. hominis засевали в 10 мл бульона 10B и инкубировали при температуре 37 оС в течение 36-48 часов до момента изменения цвета среды с красного на малиновый.

Культуры коллекционных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий и Candida albicans пересевали в пробирку и чашку Петри с питательным агаром и инкубировали при температуре 37 оС в течение 18-20 часов. Выросшие на питательном агаре культуры каждого штамма проверяли визуально на чистоту роста и отсутствие диссоциации и пересевали в пробирку со скошенным питательным агаром. После инкубации посевов при температуре 37 оС в течение 18-20 часов культуры штаммов смывали с поверхности агара стерильным 0,9% раствором натрия хлорида, доводили концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по стандарту мутности, что соответствует примерно 109 клеток/мл. Полученные взвеси разводили стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации 108 клеток/мл.

Для определения количества жизнеспособных клеток Ureaplasma spp. готовили серию 10-кратных (от 10-1 до 10-8) и 2-кратных (от 10-4 до 0,0625·10-4; от 10-5 до 0,0625·10-5; от 10-6 до 0,0625·10-6) разведений культуры уреаплазм в питательной среде. Каждое разведение вносили по 250 мкл в 10 лунок культурального планшета, в лунки добавляли по 70 мкл стерильного минерального масла. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37 оС в течение 72 часов. Затем подсчитывали в каждом ряду количество лунок, в которых произошло изменение цвета среды вследствие роста уреаплазм. Число цветообразующих единиц (ЦОЕ50) рассчитывали по методам L. J. Reed, H. Muench (1938) и B. Behrens, C. Karber (1935). Наиболее вероятное количество (НВК) бактерий рассчитывали по методу D. J. Finney (1952) и с использованием таблиц НВК (Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967).

Определение чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам проводили микрометодом серийных разведений в жидкой питательной среде. Для этого штаммы Ureaplasma spp., находящиеся в экспоненциальной фазе роста, культивировали при температуре 37 оС в течение 16-24 часов в 96-луночных планшетах под слоем минерального масла в 250 мкл питательной среды, содержащей доксициклин, эритромицин, кларитромицин, мидекамицин, джозамицин, азитромицин, линкомицин, клиндамицин, ципрофлоксацин и офлоксацин в концентрации 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 16 и 32 мкг/мл и спирамицин в концентрации 40, 50 и 60 мкг/мл. Концентрация уреаплазм в среде составляла 104±0,2·104 клеток/мл. Минимальную ингибирующую концентрацию антибактериального препарата определяли как наименьшую концентрацию препарата, ингибирующую рост (т. е. предотвращающую изменение цвета питательной среды) в течение 16-24 часов инкубации посевов в термостате.

Для идентификации Ureaplasma spp. методом ПЦР использовали систему олигонуклеотидных праймеров, специфичных для генов 16S рРНК Ureaplasma spp. и позволяющих идентифицировать вид уреаплазм ( и соавт., 1998).

Определение количества копий генома Ureaplasma spp. проводили методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием TaqMan-зондов. В качестве мишени для праймеров и TaqMan-зонда в геноме Ureaplasma spp. использовали участок гена 16S рРНК. Зонд с красителем Fam использовали для детекции ДНК Ureaplasma spp., зонд с красителем Joe – для детекции неконкурентного внутреннего контрольного образца. ДНК Ureaplasma spp. выделяли с помощью набора «ДНК-Сорб-АМ» (ЦНИИ эпидемиологии) из 100 мкл культуры с добавлением 1,0∙104 копий/мл неконкурентного внутреннего контрольного образца для оценки эффективности выделения и амплификации. ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием набора «Ureaplasma species – FRT» (ЦНИИ эпидемиологии) в термоциклере с системой детекции флюоресцентного сигнала в режиме реального времени «Rotor Gene 3000» (Corbett Research, Австралия). Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам – анализировали с помощью программного обеспечения Rotor-Gene Analysis Software v.6.0. Для количественной оценки содержания копий генома Ureaplasma spp. была приготовлена линейка калибраторов с концентрациями 2,5∙103; 2,5∙104; 2,5∙105 и 2,5∙106 копий/мл. Для оценки эффективности выделения и амплификации ДНК была приготовлена линейка калибраторов для внутреннего контрольного образца с концентрациями 1,0∙103; 1,0∙104 и 1,0∙105 копий/мл. Эффективность выделения ДНК и амплификации составляла 80-90%.

Для построения графиков зависимости оптической плотности среды от времени штаммы Ureaplasma spp., находящиеся в экспоненциальной фазе роста, разводили питательной средой и вносили по 250 мкл в лунки 96-луночного планшета, затем в каждую лунку добавляли по 70 мкл стерильного минерального масла. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37 оС. Измерение оптической плотности среды в процессе роста культур осуществляли с помощью планшетного фотометра при длине волны 570 нм в моменты времени 4, 17, 21, 24, 28, 30, 41 и 45 часов инкубации в термостате. Для каждого штамма через полученные экспериментальные значения оптической плотности среды строили кубический сплайн – кривую вида s(t)=a3t3+a2t2+a1t+a0, позволяющую точно соединять измеренные точки. Коэффициенты a0, a1, a2, a3 вычисляли для каждого промежутка между соседними замерами, исходя из условий совпадения сплайна с опытными данными и непрерывности самого сплайна и его первой и второй производных s'(t)=3a3t2+2a2t+a1 и s"(t)=6a3t+2a2 в точках замеров. Точка перегиба t* сплай­на s(t) отвечала двум условиям: s"(t*)=0, s'(t*)≠0.

Результаты определения численности бактерий в исходной пробе, основанные на определении количества жизнеспособных клеток методами ЦОЕ50 и НВК и копий генома методом ПЦР-РВ, сравнивали с помощью критерия Блэнда–Альтмана (С. Гланц, 1999). Данные организовывали парами: (ПЦР-РВ – ЦОЕ50) и (ПЦР-РВ – НВК). Для каждого набора пар измерений вычисляли их разность и полусумму, затем для разностей находили среднее значение и стандартное отклонение. Среднее значение разностей характеризовало систематическое расхождение между методами, а стандартное отклонение разностей - степень разброса результатов. Оценкой значения измеряемой величины (численности бактерий) служила полусумма пары. Если во всех парах разности лежали в пределах двух стандартных отклонений от среднего значения, то с достоверностью 0,95 оба подхода давали одинаковые результаты, т. е. наблюдаемые между ними расхождения не являлись значимыми. Далее строили графики, в которых для каждого замера по оси абсцисс откладывалась полусумма результатов (ПЦР-РВ – ЦОЕ50) и (ПЦР-РВ – НВК), а по оси ординат – их разность. По виду графиков проверяли, зависит ли расхождение от значения измеряемой величины.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка питательной среды для выявления Ureaplasma spp.

Для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала необходим комплекс сред, состоящий из двух компонентов: основного - питательной среды, предназначенной для обеспечения оптимальных условий для роста бактерий рода Ureaplasma; и вспомогательного - транспортной среды, назначение которой заключается в обеспечении оптимальных условий для сохранения жизнеспособности Ureaplasma spp. в образцах клинического материала, разведении исследуемого клинического материала для устранения (или снижения) эффекта ингибиторов роста уреаплазм и предотвращения размножения в образцах сопутствующей микрофлоры.

При разработке питательной среды для культивирования и выявления уреаплазм учитывали следующие их биологические свойства: 1) сложные питательные потребности вследствие простоты организации и ограниченных биосинтетических возможностей; 2) высокую требовательность к составу питательной среды; 3) потребность для роста в холестероле; 4) уреазную активность и потребность для роста в мочевине; 5) рост в жидких питательных средах без помутнения; 6) устойчивость к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки бактерий, а также к полимиксинам, линкомицину и амфотерицину В.

Питательная среда для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала должна максимально соответствовать следующим требованиям: 1) обеспечивать рост «всего своего», т. е. всех штаммов уреаплазм; 2) полностью подавлять рост «всего чужого», т. е. сопутствующих микроорганизмов. В соответствии с этим основными направлениями разработки являлись улучшение ростовых и повышение селективных свойств среды.

Решение поставленной задачи возможно при выборе оптимальных условий: 1) состава основы среды; 2) источников факторов роста уреаплазм; 3) концентрации лошадиной сыворотки; 4) набора и концентрации антибиотиков, обеспечивающих селективные свойства среды; 5) рН-индикатора, необходимого для визуализации роста уреаплазм.

При выборе основы среды и источников факторов роста предпочтение отдавалось стандартизованным компонентам, позволяющим уменьшить вариации ростовых свойств различных серий среды. В качестве основы питательной среды использовали регламентированные в производстве компоненты питательных сред, применяемые для культивирования наиболее требовательных микроорганизмов – сердечно-мозговую вытяжку (20 г/л) и триптозу (10 г/л) (Difco Manual, 1998). В качестве источников низкомолекулярных веществ, необходимых для роста уреаплазм, использовали дрожжевой экстракт (3 г/л) (Difco Manual, 1998) и среду 199 (4,95 г/л) (J. F. Morgan et al., 1950). Содержание лошадиной сыворотки в питательной среде увеличили до 25% с целью восполнения дефицита некоторых факторов, необходимых для роста уреаплазм, и повышения буферной емкости среды.

В качестве селективных добавок использовали антибиотики, не влияющие на рост Ureaplasma spp., но активные в отношении различных бактерий и грибов - ампициллина натриевую соль (1 г/л), ванкомицина гидрохлорид (0,05 г/л), полимиксина В сульфат (0,01 г/л), линкомицина гидрохлорид (0,03 г/л) и амфотерицин В (0,01 г/л).

В качестве рН-индикатора использовали феноловый красный (0,05 г/л), поскольку изменение цвета культуральной среды в процессе роста уреаплазм происходило четко на фоне желтого собственного цвета среды и в одной области спектра, что позволяло регистрировать изменение оптической плотности среды с помощью спектрофотометра.

Содержание мочевины в питательной среде составляло 0,5 г/л, L-цистеина гидрохлорида – 0,125 г/л; значение рН среды в пределах 6,1-6,3.

Известно, что уреаплазмы чрезвычайно чувствительны к неблагоприятным условиям окружающей среды. Для обеспечения сохранения жизнеспособности уреаплазм в исследуемом материале нами была создана транспортная среда, являющаяся производной питательной среды. Транспортная среда отличается от питательной отсутствием мочевины и линкомицина гидрохлорида. Транспортная среда обеспечивает сохранение жизнеспособности уреаплазм при температуре 18-23 оС до 5 часов и при температуре 2-8 оС до 96 часов.

Предложен способ применения разработанных сред, предполагающий внесение исследуемого клинического материала в транспортную среду, приготовление серии разведений образца в питательной среде, культивирование в 96-луночных планшетах под слоем минерального масла. Выделение культуры уреаплазм основано на создании условий, при которых выделяемый микроорганизм количественно преобладал в накопительной культуре. Это было достигнуто селективной обработкой исследуемого материала антибиотиками в транспортной среде и в процессе инкубации посевов в термостате, а также последовательным разведением материала в питательной среде до содержания единичных (или одной) клеток микроорганизмов в объеме среды.

Рост Ureaplasma spp. в питательной среде сопровождается изменением цвета среды с желтого на красный, без помутнения (рис. 1).

Одноэтапные выделение и идентификация бактерий рода Ureaplasma основаны на следующих культурально-биохимических свойствах: 1) росте в богатой питательной среде, содержащей лошадиную сыворотку; 2) уреазной активности; 3) росте без помутнения культуральной среды; 4) устойчивости к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной бактерий (ампициллину, ванкомицину), а также к полимиксину В, линкомицину и амфотерицину В.

Изучение ростовых и селективных свойств разработанной питательной среды, проведенное на чистых культурах микроорганизмов показало, что среда обеспечивала рост всех исследованных коллекционных и свежевыделенных штаммов Ureaplasma spp. и ингибировала рост штаммов M. hominis, а также других представителей микрофлоры (табл. 1).

 

10-1

10-2

10-3

Рис. 1. Посев образцов клинического материала в питательную среду для выявления Ureaplasma spp.. 1, 3, 4, 6-8, 10, 11 – есть рост уреаплазм; 2, 5, 9, 12 – отсутствует рост уреаплазм.

Таблица 1

Результаты исследования ростовых и селективных свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала при посеве чистых культур микроорганизмов

Наименование микроорганизмов	Количество штаммов	Исходная концентрация в среде, кл/мл	Количество штаммов, выросших в питательной среде
Ureaplasma spp.	28	104	28
Mycoplasma hominis	8	105	0
Neisseria gonorrhoeae	1	106	0
Enterococcus faecalis	1	106	0
Escherichia coli	1	106	0
Proteus morganii	1	106	0
Proteus vulgaris	1	106	0
Proteus mirabilis	1	106	0
Staphylococcus aureus	1	106	0
Streptococcus agalactiae	1	106	0
Lactobacillus acidophilus	1	106	0
Candida albicans	1	106	0

В то же время, при посеве чистых культур микроорганизмов на питательную среду сравнения (10С) наблюдался рост Escherichia coli, Proteus spp. и Candida albicans, сопровождавшийся выраженным помутнением среды и формированием придонного осадка. Рост Proteus spp. сопровождался также изменением цвета среды с желтого на красный.