На правах рукописи
ВЛИЯНИЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ
НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЖЕЛУДКА
ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ
03.03.01 – физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Курск – 2013
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора »
Научный руководитель: | Заслуженный ветеринарный врач РФ, доктор биологических наук, профессор |
Официальные оппоненты: | , доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора », профессор кафедры разведения с.-х. животных и зоогигиены |
, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет», декан факультета биотехнологии и ветеринарной медицины | |
Ведущая организация: | ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия имени » |
Защита состоится 28 февраля 2013 года в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора » 0. Тел. (47,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора ».
Автореферат разослан « » января 2013 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Достигнутые успехи экспериментальной физиологии стали возможными в значительной степени благодаря прогрессу в области методов исследования. Разработка, в частности радиоиммунологических и иммуноферментных методов, открыла широкие возможности для определения профиля большого числа биологически активных веществ, участвующих в регуляции физиологических функций. К таким веществам можно отнести регуляторные пептиды, представляющие собой полифункциональную группу биологически активных пептидов, действующих в организме в качестве нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов. Они широко представлены в центральной и периферической нервной системе, а также в некоторых биологических жидкостях организма и периферических органах.
Из всех известных в настоящее время регуляторных пептидов особое место отводится эндогенным опиоидам. Это большая группа физиологически активных пептидов с выраженным сродством к рецепторам опиоидного типа. Опиоидные пептиды являются универсальными химическими регуляторами, значимость которых простирается от влияния на функции отдельных групп клеток до управления работой целых систем и органов. Установлено, что эндогенные опиоиды принимают участие в регуляции таких процессов, как память, обучение, сон, поведение, кроветворение и др. ( и др., 1981; и др., 1987; и др., 1987, 1994; , 1991; и др., 1990; , 1993; T. A. Patterson et al., 1989; E. J. Simon, 1991 и др.). В свою очередь, большинство опиоидных пептидов обладают плейотропией – способностью каждого соединения оказывать влияние на несколько физиологических функций.
Учитывая биологические эффекты, которые вызывают эндогенные опиоидные пептиды, учёные стали работать над получением их синтетических аналогов, в результате появился отечественный препарат даларгин (аналог лей-энкефалина). Данный препарат обладает выраженным цитопротективным действием. Он уменьшает секрецию и моторику желудка и кишечника (, 1993), вызывает достаточно продолжительную анальгезию ( и др., 1994; и др., 1998), оказывает иммуностимулирующее действие и способен стимулировать регенерацию тканей (, 1991, 1993; и др., 1996), обладает антистрессорными эффектами ( и др., 1988; и др., 1997, 1998). В клинической практике даларгин чаще всего используют при язвенной болезни.
Однако не только синтетические аналоги опиоидных пептидов можно использовать для регуляции тех или иных физиологических функций. В начале 80-х годов прошлого столетия в Институте физиологии имени РАН группой учёных под руководством профессора был разработан метод транскраниальной электростимуляции (ТЭС) защитных механизмов мозга, получивших название ТЭС-терапия, и создана оригинальная аппаратура для реализации этого метода. Авторами было установлено, что при определённых режимах ТЭС в крови и ликворе животных и человека содержание бета-эндорфина повышается в несколько раз. На основании этих эффектов ТЭС-терапию стали применять в клинической практике для восстановления работоспособности, нормализации психофизического статуса, купирования болевых синдромов, нормализации артериального давления, стимуляции репаративных процессов ( и др., 1987; 1988; 2002; 2003; 2005; 2010).
В последние годы метод ТЭС-терапии нашёл применение и в практике ветеринарной медицины. Его используют для коррекции иммунобиологического статуса, профилактики транспортного стресса, восстановления функциональной активности желудка и печени у домашних животных (, 1996; 2007; 2008; 2009; , 1997; , , 2003; ёнов и др., 2009; и др., 2009).
Однако, несмотря на то, что в последние годы опубликовано много работ, посвящённых опиоидным пептидам, анализу их биологического действия и роли в организме, сведения, касающиеся влияния опиоидов на функциональное состояние желудочно-кишечного тракта у разных видов домашних животных, немногочисленны. При этом они зачастую носят противоречивый характер.
Цель и задачи исследований. Учитывая вышеизложенное, целью нашей работы являлось изучение влияния опиоидных пептидов на функциональное состояние желудка, а также определение экспериментальным путём возможности использования даларгина и ТЭС для коррекции функциональной активности желудка у домашних животных.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить общие клинические и гематологические показатели у кроликов, собак и овец после введения даларгина и ТЭС.
2. Изучить сократительную функцию желудка у собак и овец после введения даларгина и ТЭС.
3. Определить секреторную активность желудка у собак и овец после введения даларгина и ТЭС.
4. Выяснить влияние даларгина и ТЭС на сократительную и секреторную активность желудка домашних животных после введения налоксона.
5. Разработать способ коррекции функциональной активности желудка у домашних животных с использованием даларгина и ТЭС.
Научная новизна исследований. На основании клинических и физиологических исследований впервые проведён сравнительный анализ многостороннего влияния синтетического опиоидного пептида даларгина и транскраниальной электростимуляции на функциональную активность желудка у собак и овец. Изучена сократительная и секреторная функция желудка у домашних животных после применения даларгина, ТЭС, антагониста опиоидных пептидов налоксона.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявленные особенности функциональной активности желудка у разных видов домашних животных после применения синтетического аналога опиоидных пептидов даларгина и ТЭС вносят конкретный вклад в физиологию опиоидных структур мозга и расширяют представления о роли опиоидных пептидов в организме. Полученные результаты апробации разработанного способа коррекции функциональной активности желудка у домашних животных позволяют рекомендовать его использование в практике ветеринарной медицины.
Внедрение результатов исследований. Разработанный способ коррекции функциональной активности желудка у животных с применением даларгина и ТЭС используется в государственных и частных клиниках г. Курска, г. Орла и г. Москвы.
Основные положения, выносимые на защиту:
• Результаты комплексных клинических и физиологических исследований, отражающих функциональную активность желудка у собак и овец после применения даларгина и ТЭС.
• Оптимальные режимы ТЭС для восстановления функциональной активности желудка у разных видов домашних животных.
• Способ коррекции функциональной активности желудка у животных с применением даларгина и ТЭС.
Апробация работы и публикации. Основные материалы диссертационной работы доложены на:
– Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение инновационного развития отечественного животноводства» (Новочеркасск, 2011г.);
– Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного производства» (Курск, 2012г.);
– Международной научно-практической конференции «Интегративные процессы в образовании и науке – 2012» (Москва, 2012г.);
– Международной научно-практической конференции «Инновационные пути развития АПК на современном этапе» (Белгород, 2012г.);
– научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава Курской государственной сельскохозяйственной академии им. проф. (гг.).
По материалам диссертации опубликовано шесть работ, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Объём и структура работы. Материал диссертации изложен на 178 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, материал и методы исследований, результаты собственных исследований, выводы, практические предложения, список литературы, содержащий 259 источников, в том числе 69 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 40 рисунками.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Диссертационная работа выполнялась в условиях межкафедральной научно-исследовательской лаборатории факультета ветеринарной медицины, ветеринарной клиники Курской ГСХА и частной ветеринарной клиники ИП Григорьева в период гг.
Лабораторные исследования проводились на кафедре терапии и акушерства и биохимической лаборатории частной ветеринарной клиники ИП Григорьева.
Объектом исследований являлись кролики породы советская шиншилла, беспородные собаки 2-3-летнего возраста, овцы романовской породы.
Экспериментальная часть работы выполнялась по общей схеме, представленной на рисунке 1, и состояла из пяти серий опытов.
В первой серии опытов изучали общеклинический статус и гематологические показатели у подопытных животных до и после введения препарата даларгина и проведения ТЭС, как в отдельности, так и в комплексе.
Препарат даларгин является синтетическим гексапептидом, аналогом лейцинэнкефалина (производитель », г. Москва). Даларгин вводили в дозах 1,0 и 2,0 мг в расчёте на одно животное.
Для ТЭС использовали аппараты «Трансаир-2» и «Трансаир-3» (производитель «Центр ТЭС» Санкт-Петербург).
Электровоздействие осуществляли через электроды со специальным фиксатором и электроды-зажимы. Располагали электроды на лобной (катод) и затылочной (анод) областях черепа. При проведении ТЭС у кроликов, собак и овец применяли режим, включающий подачу на электроды вначале постоянного тока, нарастающего от 0 до 3,5 мА, с последующим применением прямоугольных импульсов с частотой 70-80 Гц длительностью 3,0 мс, амплитуду которых увеличивали до 3,0 мА. Продолжительность сеанса электровоздействия составляла 30 мин.
Рис.1. Общая схема исследований
Во второй серии опытов изучали влияние даларгина и ТЭС на сократительную функцию желудка у собак и сычуга у овец. Была исследована моторика органов в норме и при их дисфункции. Для искусственного создания гипотонии желудка у собак и сычуга у овец использовали раствор атропина сульфата (0,5 мг/кг). Повышенную перистальтику желудка моделировали путём подкожного введения 0,05% раствора прозерина.
У собак моторику желудка регистрировали с использованием отечественного электрогастрографа ЭГС-4М. Во время оценки полученных электрогастрограмм, учитывали амплитуду сокращений, частоту импульсов в минуту и общую биоэлектрическую активность желудка.
У овец сократительную функцию сычуга исследовали с применением одноканальной баллонной гастрографии. С этой целью проводили хирургическую операцию по фиксации фистулы в сычуге, через которую вводили воспринимающий резиновый баллончик, соединённый через систему воздуховодных трубок с регистрирующим устройством (капсула Марея с писчиком, динамический манометр, спаренные механические кимографы). В этом случае сократительную функцию сычуга у овец оценивали по амплитуде сокращений, продолжительности, частоте, ритму сокращений и контракционному индексу.
В третьей серии опытов исследовали секреторную активность желудка у собак и сычуга у овец после введения даларгина и ТЭС.
У собак желудочное содержимое получали через фистулу, зафиксированную в желудке по классической методике, разработанной (1843) в модификации (1998).
У овец содержимое сычуга получали через фистулу, используемую для регистрации сократительной активности органа.
Желудочное содержимое собирали в специальные воронки, подвергали пресс-фильтрации и лабораторному анализу.
Четвёртая серия опытов была посвящена разработке способа коррекции функциональной активности желудка у домашних животных с использованием даларгина и ТЭС и его производственной апробации.
В процессе выполнения диссертационной работы использовали комплекс методов, который включал клинические, гематологические, биохимические и биометрические методы.
Клинические методы предусматривали определение у подопытных животных температуры тела, частоты пульса и дыхательных движений.
Общие гематологические методы. Кровь у кроликов брали из латеральной ушной вены, у собак из подкожной вены предплечья, у овец из ярёмной вены. Во всех случаях использовали вакуумные системы получения крови ( «Домен»).
СОЭ определяли на аппарате Панченкова, гематокрит - на микроцентрифуге Шкляра. Содержание эритроцитов и лейкоцитов - на автоматическом счётчике «Picoscel».
Биохимические методы. Определение содержания в крови гемоглобина проводили на гемометре Сали. Общий белок устанавливали рефрактометрически, белковые фракции определяли методом электрофореза на мембранах «Владипор», сканирование электрофореограмм проводили на денситометре при длине волны 540 нм. Содержание бета-эндорфина в крови кроликов устанавливали иммуноферментным методом. Концентрацию в крови глюкозы, общих липидов, общего кальция, неорганического фосфора, общего магния определяли с использованием наборов «Био-Ла-Тест» фирмы «Лахема» и на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «Vitalon-400».
Определение рН в содержимом желудка собак и овец производили электрометрическим методом на рН-метре «РН-150». Общую кислотность, свободную и связанную соляную кислоту устанавливали методом титрования по Тепферу, содержание кислоты при этом выражалось в титрационных единицах. Количественное определение ферментативной активности пепсина проводили по методу .
Биометрические исследования. Полученные в ходе проведения экспериментов данные подвергались биометрической обработке (, 1973) на ПЭВМ.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Общие клинические и гематологические показатели
у подопытных животных после введения даларгина и ТЭС
С целью выяснения влияния синтетического аналога опиоидных пептидов даларгина и ТЭС на интерьерное состояние животных, нами была проведена серия экспериментов на кроликах, собаках и овцах. У подопытных животных исследовали общие клинические и гематологические показатели после введения даларгина через 6 и 12 час, после ТЭС – через 60 и 180 мин, а также после комплексного применения даларгина и ТЭС - через 60 и 180 мин.
Результаты исследований показали, что введение даларгина и проведение ТЭС в выбранном режиме не оказывало отрицательного воздействия на организм подопытных животных, как при раздельном их применении, так и в сочетании.
Частота пульса, количество дыхательных движений, температура тела у животных изменялись в пределах физиологических границ. Скорость оседания эритроцитов и гематокритная величина также находились в пределах физиологических норм.
Содержание эритроцитов и лейкоцитов после введения даларгина по сравнению с фоновыми значениями не изменялось и находилось в период эксперимента в следующих границах: у кроликов – 6,2±046-6,8±0,22·1012/л и 7,0±0,16-7,8±0,11·109/л; у собак – 5,8±0,34-6,2±0,27·1012/л и 7,7±0,20-8,9±0,18·109/л; у овец – 7,0±0,4-8,0±0,5·1012/л и 6,8±0,2-7,2±0,3·109/л.
После применения ТЭС содержание эритроцитов и лейкоцитов у всех видов подопытных животных повысилось в среднем у кроликов на 1,2·1012/л и 0,3·109/л; у собак – на 1,1·1012/л и 0,5·109/л; у овец – на 0,8·1012/л и 0,7·109/л. При этом только изменения содержания эритроцитов имели статистически достоверный характер (P<0,05).
После комплексного применения даларгина и ТЭС также отмечалось увеличение в крови подопытных животных содержания эритроцитов и лейкоцитов. Через 180 мин их увеличение в крови соответственно составляло: у кроликов – на 1,3·1012/л и 0,3·109/л; у собак – на 1,1·1012/л и 1,2·109/л; у овец – на 0,5·1012/л и 0,3·109/л.
* - при p<0,05, по сравнению с контрольной группой;
° - при P<0,05, по сравнению с фоновыми показателями.
Рис.2. Содержание β-эндорфина в крови кроликов
после введения даларгина и ТЭС
Анализ динамики содержания биохимических показателей крови у подопытных животных показал, что из всех исследуемых компонентов (гемоглобин, общий белок, фракции белка, глюкоза, β-эндорфин, АСТ, АЛТ и ЩФ) достоверные изменения отмечались только со стороны глюкозы, гамма-глобулинов и β-эндорфина. После курса ТЭС и комплексного применения даларгина с ТЭС содержание глюкозы и гамма-глобулинов в крови всех подопытных животных повысилось и через 180 мин соответственно составляло: у кроликов – 3,4±0,11-3,5±0,05 ммоль/л и 19,5±0,16-20,3±0,47%; у собак – 4,0±0,18-4,2±0,10 ммоль/л и 15,3±0,17-15,6±0,15%; у овец – 3,3±0,16-3,4±0,11ммоль/л и 22,3±0,18-22,5±0,46%. Что касается β-эндорфина, то его содержание в крови кроликов после ТЭС и комплексного применения даларгина и ТЭС увеличилось в 3-3,5 раза по сравнению с фоновыми показателями (рис.2). Таким образом можно считать, что ТЭС является «источником» эндогенного опиоидного пептида β-эндорфина.
3.2. Сократительная функция желудка у собак
после введения даларгина
Целью настоящей серии опытов являлось изучение влияния синтетического аналога опиоидных пептидов даларгина на сократительную функцию желудка у собак. Были проведены исследования моторики желудка у собак при различных дозах препарата, до и после приёма корма, при дисфункциях перистальтики желудка, после введения налоксона и даларгина.
Результаты исследований показали, что после введения даларгина в дозе 1,0 мг/гол сократительная функция желудка у собак через 30 мин практически не изменялась. Через 180 мин показатели перистальтики желудка уменьшились. Однако эти изменения были статистически недостоверными (P>0,05). При дозе препарата 2,0мг/гол изменения сократительной активности желудка у собак были более выраженными. Если до введения препарата амплитуда сокращений составляла 6,4±0,15 мВ, частота импульсов – 1,30±0,10 в мин, общая биоэлектрическая активность – 38,0 усл. ед., то через 30 мин эти показатели уменьшились и, соответственно, составляли – 5,8±0,15 мВ; 1,20±0,13 в мин; 32,4±4,8 усл. ед.
Влияние даларгина в дозе 2,0 мг/гол на сократительную функцию собак, не получавших корм, было слабо выраженным, и выявленные изменения являлись недостоверными. У собак, которые принимали корм после введения даларгина, сокращения уменьшились, достигая минимальных значений через 180 мин: амплитуда сокращений составляла 6,1±0,18 мВ (P<0,05), частота импульсов – 1,20±0,14 в мин, общая биоэлектрическая активность – 30,0±2,0 усл. ед. (P<0,05).
У собак с пониженной сократительной функцией желудка после введения даларгина отмечалось незначительное её снижение и выявленные изменения являлись статистически недостоверными.
После введения даларгина собакам с повышенной перистальтикой желудка уменьшение её показателей по сравнению с фоновыми значениями было достоверным. Через 60 мин её показатели составляли: амплитуда сокращений – 11,8±0,51 мВ, частота импульсов – 3,36±0,10 в мин (P<0,05), общая биоэлектрическая активность – 68,4±5,9 усл. ед. В последующем сокращения желудка у собак продолжали уменьшаться и через 180 мин после введения даларгина они достигали соответственно: 10,0±0,20 мВ, 2,88±0,11 в мин, 65,0±4,0 усл. ед. При этом данные изменения были статистически достоверными (P<0,05-0,01).
Исследование моторики желудка у собак после введения специфического антагониста опиоидных рецепторов налоксона с последующим введением даларгина показало, что в начале эксперимента (до введения препаратов) амплитуда сокращений составляла 6,2±0,20 мВ, частота импульсов – 1,20±0,11 в мин, общая биоэлектрическая активность желудка – 34,3±3,8 усл. ед. В последующие периоды исследований перистальтика желудка изменялась незначительно, и её показатели находились соответственно в следующих пределах: 6,0±0,18-6,3±0,27 мВ, 1,17±0,17-1,20±0,15 в мин, 34,0±3,8-38,0±3,0 усл. ед.
3.3 Сократительная функция желудка у собак после ТЭС
В настоящее время в источниках литературы встречается большое количество работ, посвящённых исследованию моторики желудочно-кишечного тракта у животных в норме, при патологии, а также при воздействии на неё различных факторов и фармакологических средств. В то же время в доступной литературе мы обнаружили лишь единичные сведения о влиянии ТЭС на перистальтику желудка у домашних животных. Учитывая это, нами были проведены эксперименты по изучению моторики желудка у собак до и после ТЭС.
Результаты исследований показали, что у собак, не получавших корм, действие ТЭС было маловыраженным. Сократительная активность желудка в течение первых 60 мин незначительно повысилась, а через 180 мин понизилась. У этих же собак (после 3-суточного уравнительного периода), но получивших корм, перистальтика желудка после ТЭС усилилась. Так, если до электростимуляции амплитуда и частота сокращений составляли соответственно 7,30±0,11 мВ и 1,14±0,06 имп/мин, то через 60 мин после ТЭС эти показатели достигали 8,0±0,18 мВ и 1,31±0,09 имп/мин.
У собак с пониженной сократительной функцией желудка до начала эксперимента амплитуда сокращений составляла 1,0±0,09 мВ, частота импульсов – 0,83±0,15 имп/мин, общая биоэлектрическая активность – 20,0±2,7 усл. ед. (рис.3). Однако уже через 30 мин после окончания ТЭС эти параметры значительно (P<0,05) увеличились и соответственно составляли 2,8±0,11 мВ, 1,31±0,24 имп/мин и 41,4±3,4 усл. ед. Через 60 мин сократительная активность желудка ещё больше активизировалась, о чём свидетельствуют изучаемые показатели: амплитуда сокращений достигала 3,7±0,12 мВ, частота – 1,34±0,18 имп/мин, общая биоэлектрическая активность – 54,0±5,8 усл. ед. Через 180 мин сократительная активность желудка у подопытных собак уменьшилась, однако по сравнению с фоновыми значениями она оставалась достоверно (P<0,05) высокой: амплитуда сокращений достигала 2,9±0,10 мВ, частота импульсов – 1,25 имп/мин, общая биоэлектрическая активность – 40,5±4,7 усл. ед.
У собак с повышенной моторикой желудка (рис.4) уже через 30 мин после ТЭС сократительная активность желудка уменьшилась: амплитуда сокращений в среднем на 1,4 мВ, частота импульсов на 1,11 имп/мин, общая биоэлектрическая активность на 16,9 усл. ед. В последующем сократительная активность желудка продолжала уменьшаться и через 180 мин после окончания сеанса электровоздействия изучаемые параметры составляли: амплитуда – 9,0±0,29 мВ, частота импульсов – 1,54±0,26 имп/мин, общая биоэлектрическая активность – 31,6±7,0 усл. ед.
Для подтверждения влияния ТЭС на сократительную функцию желудка собак нами был проведён эксперимент. С этой целью собакам (опытная группа) с повышенной моторикой желудка, которую моделировали путём введения раствора прозерина, проводили ТЭС. При этом за 5 мин перед электростимуляцией подопытным животным подкожно вводили 1мл (0,4 мг) налоксона, через 2 часа инъекцию повторяли. Контролем служили собаки с повышенной моторикой желудка, которые подвергались ТЭС, но налоксон им не вводили.
Рис. 3. Влияние ТЭС на моторику желудка у собак с её пониженной
активностью
Рис.4. Влияние ТЭС на моторику желудка у собак с её повышенной активностью
Было установлено, что моторика желудка у подопытных собак в течение всего периода наблюдения оставалась на относительно высоком уровне, хотя имела незначительную тенденцию к снижению с приближением окончания эксперимента. Так, до проведения ТЭС амплитуда сокращений составляла 14,1±0,37 мВ, частота импульсов 3,74±0,23 имп/мин, общая биоэлектрическая активность 74,6±5,6 усл. ед. В течение 60 мин после окончания сеанса электростимуляции сократительная активность желудка изменилась незначительно и изучаемые показатели находились в пределах соответственно 13,7±0,34-14,0±0,48 мВ, 3,42±0,24-3,52±0,18 имп/мин, 70,5±6,5-72,2±5,6 усл. ед. Через 180 мин после окончания ТЭС сократительная активность желудка несколько уменьшилась: амплитуда составляла 13,8±0,51 мВ, частота импульсов – 3,40±0,28 имп/мин, общая биоэлектрическая активность – 68,8±4,8 усл. ед.
3.4. Влияние даларгина на сократительную функцию сычуга у овец
С использованием баллонной гастрографии было установлено, что даларгин оказывал определённое влияние на сократительную функцию сычуга у овец, хотя она была менее выраженной, чем сокращения желудка у собак.
Сравнительный анализ полученных данных показал, что до введения препарата у овец, не получавших корм, амплитуда сокращений составляла 12,3 ±0,5 мм рт. ст., продолжительность сокращений - 11,0±0,48 мин, частота сокращений - 1,2±0,10, контракционный индекс - 135,3±5,7. Через 30 минут после введения препарата данные показатели находились на уровне фоновых значений, однако в последующем они имели определённую тенденцию к уменьшению. Так, через 180 минут после введения даларгина амплитуда сокращений составляла 11,4±0,50 мм рт. ст., продолжительность сокращений – 10,8±0,55 мин, частота сокращений – 1,19±0,10, контракционный индекс – 123,1±6,0. Однако выявленные изменения являлись статистически недостоверными (P>0,05).
Сокращения сычуга у овец после кормления значительно активизировались: амплитуда составляла 14,0±0,60 мм рт. ст., продолжительность – 17,5±0,35 мин, частота – 1,46, контракционный индекс – 245,0±7,3. После введения даларгина моторика сычуга у овец несколько уменьшилась и через 180 мин её показатели составляли соответственно – 13,4±0,40 мм рт. ст., 17,3±0,37 мин, 1,55±0,17 и 231,8±9,5.
Введение раствора атропина сульфата позволило создать модель гипотонии сычуга у овец. При этом амплитуда сокращений составила 6,0±0,48 мм рт. ст., продолжительность сокращений – 6,4±0,50 мин., частота сокращений – 1,0±0,09, контракционный индекс – 38,4±3,7. После введения даларгина существенных сдвигов в моторике сычуга у овец выявлено не было и её показатели находились соответственно в пределах: 5,8±0,65 – 6,1±0,54 мм рт. ст.; 6,2 ±0,55 – 6,4±0,42 мин.; 1,05±0,10 – 1,12±0,12; 37,1±4,4 – 38,4±4,3.
При изучении влияния даларгина на моторику сычуга у овец с её повышенной активностью было установлено, что после введения раствора прозерина сократительная активность сычуга у овец резко увеличилась и составляла: амплитуда сокращений – 18,0±0,38 мм рт. ст.; продолжительность сокращений – 21,0±0,62 мин; частота сокращений – 4,5±0,15; контракционный индекс – 378,0 ±8,3. Через 30 минут после введения даларгина показатели сократительной активности сычуга у овец оставались примерно на том же уровне. Однако через 60 минут они уменьшились и соответственно составляли: 17,8±0,55 мм рт. ст.; 18,5±0,66 мин; 3,5±0,18 (Р<0,05); 310,8±8,0 (Р<0,05). Через 180 минут все исследуемые параметры моторики сычуга достигли минимального значения: 16,5±0,25 мм рт. ст.; 17,5±0,49 мин; 3,3±0,12; 288,8±7,8. Данные изменения являлись статистически достоверными (Р<0,05).
С целью изучения сократительной активности сычуга у овец после введения прозерина, налоксона и даларгина нами были проведены эксперименты, результаты которых показали, что через 30 мин после введения препаратов активность сокращений сычуга у овец практически не изменялась и находилась на относительно высоком уровне. Через 60 мин она незначительно уменьшилась (P>0,05), а через 180 мин показатели моторики сычуга приблизились к фоновым значениям и составляли: амплитуда сокращений – 16,8±0,20 мм рт. ст.; продолжительность – 18,8±0,41 мин; частота – 3,9±0,13; контракционный индекс – 315,8±9,0.
3.5. Влияние ТЭС на сократительную функцию сычуга у овец
Результаты баллонной гастрографии показали, что у овец, не получавших корм, сокращения сычуга были менее активными по сравнению с животными, которых перед экспериментом кормили. Что касается влияния ТЭС на моторику сычуга у овец с её пониженной активностью, то уже через 30 мин после электростимуляции показатели сократительной активности сычуга у овец значительно повысились и составляли соответственно: амплитуда сокращений - 6,7±0,19 мм рт. ст.; продолжительность сокращений - 8,3±0,11 в мин; частота сокращений - 1,0±0,09; контракционный индекс - 55, ±4,7. В последующем сокращения сычуга у овец, получавших корм, усилились и находились соответственно в пределах: 10,6±0,15 – 11,4±0,18 мм рт. ст.; 9,2±0,11 – 9,4±0,12 в мин; 1,10±0,08 – 1,12±0,07; 99,6±6,8 – 104,9±7,3.
а) до проведения ТЭС
б) через 30 мин после проведения ТЭС
в) через 60 мин после проведения ТЭС
г) через 180 мин после проведения ТЭС
Рис. 5. Фрагменты гастрограмм у овцы №4 с повышенной моторикой
сычуга после проведения ТЭС
Повышенную перистальтику сычуга мы моделировали путём подкожного введения 0,05% раствора прозерина. Исследования показали, что через 30 минут после введения препарата моторика сычуга у овец повысилась (рис.5) и перед началом эксперимента составляла: амплитуда сокращений – 17,68±0,74 мм рт. ст.; продолжительность сокращений 20,0±1,5 в мин; частота сокращений – 4,44±0,09; контракционный индекс – 364,0±8,4. Через 30 минут после ТЭС сократительная активность сычуга уменьшилась, однако, установленные изменения в моторике органа были недостоверными (Р>0,05). Через 60 минут снижение перистальтики сычуга было существенным (Р<0,05), а через 180 минут показатели достигли минимальных значений: амплитуда сокращений – 12,8±0,94 мм рт. ст.; продолжительность сокращений 12,5±1,75 в мин; частота сокращений – 1,35±0,12; контракционный индекс – 160,0±6,0.
При проведении ТЭС у овец с повышенной моторикой сычуга и после введения налоксона эффекты электростимуляции были слабо выраженными. Показатели её активности составляли: амплитуда сокращений – 17,4±0,10 мм рт. ст.; продолжительность сокращений 19,8±0,7 в мин.; частота сокращений – 4,10±0,10; контракционный индекс – 344,0±7,7.
3.6. Влияние даларгина на секреторную функцию желудка у собак
В содержимом желудка у собак определяли рН, общую кислотность, содержание свободной и связанной кислоты, а также активность пепсина до введения даларгина, через 2 и 6 часов после его введения.
Результаты проведённых исследований показали, что после введения даларгина секреторная функция желудка у собак как до, так и после кормления снижалась. Так, у собак, не получавших корм, через 2 часа после введения препарата уровень общей кислотности понизился с 68,0±3,2 до 52,5±3,0 ед. титра (Р<0,05), свободной кислоты – с 25,0±0,55 до 20,6±0,87 ед. титра (Р<0,05), связанной кислоты – с 24,0±0,77 до 18,5±0,86 (Р<0,05), ферментативная активность пепсина – с 13,0±0,54 до 11,4±0,66 ед. Через 6 часов данные показатели изменились до более низких величин и соответственно составляли – 4,0±0,14; 39,0±3,7 ед. титра, 12,6±0,50 ед. титра; 11,5±0,54 ед. титра; 9,7±0,44 усл. ед.
После введения даларгина у собак, получавших корм, интенсивность снижения секреторной активности желудка была более выраженной, чем до введения препарата и составляла рН 2,6±0,29 усл. ед.; общая кислотность – 107,0±5,6 ед. титра; свободная кислота – 40,5±2,0, связанная кислота – 42,4±3,6 ед. титра; ферментативная активность пепсина – 15,8±0,66 усл. ед. Через 6 часов данные показатели достоверно (Р<0,05) уменьшились и соответственно составляли – 4,2±0,25 усл. ед.; 35,8±3,8 ед. титра; 28,8±2,5 ед. тира;10,0±0,50 усл. ед.
Исследования секреторной активности желудка у собак после комплексного применения даларгина и налоксона показали, что до введения препаратов рН составляла 3,1±0,45 усл. ед.; общая кислотность - 20,1±1,8 ед. титра; связанная кислота – 20,5±1,0 ед. титра; ферментативная активность пепсина – 10,8±0,48 усл. ед. В последующие периоды исследования данные параметры существенно не изменялись и находились в пределах следующих границ: 3,2±0,35 – 3,3±0,54 усл. ед.; 62,3±4,0 – 63,0±3,5 ед. титра; 19,5±1,4 – 20,5±1,6 ед. титра; 21,7±1,5 – 22,0±1,8 ед. титра; 11,5±0,59 – 12,0±0,66 усл. ед.
3.7. Влияние ТЭС на секреторную функцию желудка собак
Проведённые исследования позволили установить, что до сеанса ТЭС и после него параметры оценки секреторной активности желудка у собак, как получавших, так и не получавших корм, достоверных различий не имели и находились в следующих пределах: рН - 2,3±0,16 – 3,4±0,40 усл. ед.; общая кислотность - 70,8±3,4 – 108,4±4,0 ед. титра; свободная кислота – 27,6±2,84 – 45,0±2,05 ед. титра, связанная кислота – 26,0±0,59 – 46,7±2,8 ед. титра; ферментативная активность пепсина – 12,7±0,23 – 18,8±0,80 усл. ед.
В то же время у собак с пониженной секреторной активностью после ТЭС она повысилась (табл.) и через 6 часов её показатели были следующими: рН - 3,0±0,18 усл. ед.; общая кислотность - 60,7±3,2 ед. титра; свободная кислота – 20,1±1,2 ед. титра, связанная кислота – 21,6±0,70 ед. титра; ферментативная активность пепсина – 8,7±0,40 усл. ед. (Р<0,05).
Таблица. Влияние ТЭС на секреторную активность желудка у собак
с её пониженной активностью
Время исследования | рН, усл. ед. | Общая кислотность, ед. титра | Свободная НСl, ед. титра | Связанная НCl, ед. титра | Пепсин, усл. ед. |
До ТЭС | 3,8±0,21 | 44,3±3,1 | 16,4±1,0 | 18,3±0,78 | 8,7±0,40 |
После ТЭС, через 2 часа | 3,2±0,25 | 57,4±3,0 | 19,0±1,3 | 20,5±1,08 | 9,3±0,64 |
После ТЭС, через 6 часов | 3,0±0,18 | 60,7±3,2 | 20,1±1,2 | 21,6±0,70 | 10,5±0,30 |
В ходе проведённых экспериментов было установлено, что налоксон снижал эффекты ТЭС. При комплексном применении ТЭС с налоксоном показатели секреции желудка до электростимуляции и после неё не имели существенных различий и в период эксперимента находились в пределах: рН - 3,7±0,36 – 3,9±0,47 усл. ед.; общая кислотность - 115,9±7,,7±8,8 ед. титра; свободная кислота – 45,5±3,84 – 47,6±3,2 ед. титра, связанная кислота – 40,0±3,5 – 45,9±2,7 ед. титра; ферментативная активность пепсина – 13,7±0,86 – 14,8±0,93 усл. ед.
3.8. Влияние даларгина на секреторную функцию сычуга у овец
Результаты исследований показали, что до введения препарата овцам, не получавшим корм, секреторная активность сычуга находилась на относительно высоком уровне: рН составляла 2,84±0,10 усл. ед.; общая кислотность - 70,0±4,6 ед. титра; свободная кислота – 20,3±1,7 ед. титра, связанная кислота – 33,0±1,9 ед. титра; перевариваемость – 3,5±0,15 мм. После введения даларгина секреторная активность сычуга у овец постепенно снижалась, достигая минимума через 6 часов: 3,2±0,12 усл. ед (Р<0,05); 63,0±4,7 ед. титра; 19,4±1,5 ед. титра; 30,7±1,7 ед. титра; 2,8±0,18 мм (Р<0,05).
После приёма корма секреторная активность сычуга у овец повысилась и перед введением даларгина её показатели были следующими: рН 2,10±0,14 усл. ед.; общая кислотность - 98,0±5,2 ед. титра; свободная кислота – 35,6±1,6 ед. титра, связанная кислота – 46,0±2,3 ед. титра; перевариваемость – 2,8±0,08 мм. Через 2 часа после введения даларгина секреторная активность сычуга у овец уменьшилась, однако, эти изменения были статистически недостоверными (Р>0,05). Через 6 часов снижение показателей секреторной активности сычуга были более выраженными (Р<0,05) и, соответственно, достигали следующих значений: 3,00±0,17 усл. ед (Р<0,05); 76,6±5,8 ед. титра; 21,1±1,4 ед. титра; 35,2±2,7 ед. титра; 3,0±0,06 мм.
У овец, как и у собак, налоксон снижал эффекты даларгина. В ходе исследований было установлено, что до введения препаратов рН сычужного содержимого составляла - 2,75±0,17 усл. ед.; общая кислотность - 68,7±3,8 ед. титра; свободная кислота – 20,0±1,9 ед. титра, связанная кислота – 31,7±1,5 ед. титра; перевариваемость – 3,0±0,09 мм. После введения препаратов секреторная активность сычуга несколько уменьшилась, и её показатели находились в следующих пределах соответственно: 2,65±0,18 – 2,7±0,20 усл. ед.; 65,0±3,5 – 66,8±4,0 ед. титра; 18,8±1,7 – 19,7±1,0 ед. титра; 30,0±0,9 – 30,5±1,8 ед. титра; 2,7±0,08 – 2,8±1,0 мм. При этом выявленные изменения были статистически недостоверными (Р>0,05).
3.9. Влияние ТЭС на секреторную функцию сычуга у овец
Лабораторный анализ сычужного содержимого показал, что у овец, не получавших корм, и которые не подвергались электростимуляции, секреторная активность сычуга была относительно не высокой. После сеанса ТЭС она повысилась и её показатели составляли: рН - 2,64±0,54 усл. ед.; общая кислотность - 74,0±4,5 ед. титра; свободная кислота – 22,0±2,5 ед. титра; связанная кислота – 39,3±3,8 ед. титра; перевариваемость – 3,1±0,15 мм. Через 6 часов после электровоздействия секреторная активность сычуга у овец вновь незначительно понизилась, соответственно, до: 2,78±0,70 усл. ед.; 67,6±3,6 ед. титра; 21,1±2,0 ед. титра; 33,1±3,0 ед. титра; 3,0±0,10 мм.
Секреция сычуга у овец после кормления, по сравнению с животными, не получавшими корм, была значительно выше и рН составляла 2,0±0,46 усл. ед.; общая кислотность - 93,5±7,6 ед. титра; свободная кислота – 37,5±2,0 ед. титра; связанная кислота – 48,6±3,0 ед. титра; перевариваемость – 3,0±0,12 мм. В последующие периоды исследований показатели секреции сычуга уменьшились и соответственно находились в пределах: 2,08±0,38 – 2,45±0,50 усл. ед.; 77,0±9,3 – 89,5±8,8 ед. титра; 26,5±2,7 – 30,5±3,4 ед. титра; 38,8±2,5 – 43,5±2,6 ед. титра; 2,8±0,11 мм. При этом уменьшение свободной и связанной кислоты через 6 часов после ТЭС носило достоверный характер (Р<0,05).
С использованием атропина сульфата нам удалось уменьшить секреторную активность сычуга у овец. После проведённого сеанса ТЭС секреция желёз сычуга существенно (Р<0,05) повысилась и уже через 2 часа исследуемые показатели составляли: рН - 2,83±0,60 усл. ед.; общая кислотность - 53,5±3,3 ед. титра; свободная кислота – 18,3±0,75 ед. титра; связанная кислота – 22,4±0,84 ед. титра; перевариваемость – 2,6±0,17 мм. Через 6 часов после ТЭС данные показатели достоверно (Р<0,05) увеличились соответственно до 2,74±0,55 усл. ед.; 64,1±3,8 ед. титра; 21,0±0,61 ед. титра; 30,7±0,69 ед. титр;, 2,8±0,11 мм.
При исследовании секреторной функции сычуга у овец с пониженной активностью после введения налоксона и ТЭС было установлено, что до начала эксперимента секреторная функция сычуга овец была относительно низкой, о чем свидетельствуют изучаемые показатели: рН - 3,25±0,70 усл. ед.; общая кислотность - 40,5±2,8 ед. титра; свободная кислота – 13,0±0,95 ед. титра; связанная кислота – 17,0±0,84 ед. титра; перевариваемость – 3,0±0,18 мм. Через 2 часа секреция сычуга повысилась, а затем вновь уменьшилась и через 6 часов после окончания сеанса электростимуляции её показатели соответственно составляли: 3,20±0,64 усл. ед.; 47,0±4,0 ед. титра; 12,7±0,80 ед. титра; 17,0±0,92 ед. титра, 3,0±0,16 мм.
3.10. Способ коррекции функционального состояния желудка
у животных с использованием даларгина и ТЭС
На основании результатов проведённых исследований был разработан способ коррекции функционального состояния желудка у животных.
Принцип данного способа основан на гомеостатическом действии опиоидных пептидов и заключается в том, что животным после хирургической операции на желудке во время реабилитационной терапии применяют даларгин в комплексе с ТЭС.
Способ был апробирован на собаках разных пород, перенёсших операцию на желудке. С этой целью собакам опытной группы (5 голов) на 3 день после операции вводили внутримышечно раствор даларгина в дозе 2 мг/гол в течение 3 дней подряд. Затем на 7 день после операции проводили ТЭС в следующем режиме: вначале на электроды, расположенные сагиттально на голове животного (анод - в затылочной области, катод – в лобной области) подавался постоянный ток, плавно нарастающий в течение двух минут от 0 до 3,5 мА. После этого на электроды в той же полярности подавался импульсивный ток с частотой 70-80 Гц и длительностью импульса 3,5 мс, что в соотношении с постоянным током составляло 2:1. Электровоздействие осуществляли с использованием аппарата «Трансаир-2». Продолжительность электросеанса – 30 мин в течение 3 дней подряд.
Собакам второй группы, после операции на желудке, даларгин и электростимуляцию не применяли, они являлись первым контролем. Собакам третьей группы операцию не проводили, они были вторым контролем.
У собак всех групп до начала и после эксперимента регистрировали сократительную функцию желудка с использованием электрогастрографа ЭГС-4м.
Клинические наблюдения показали, что собаки опытной группы вели себя спокойно, во время ТЭС у них наблюдалась вначале повышенная двигательная активность, а затем наступало сонливое состояние, некоторые животные принимали лежачее положение. Дальнейшие наблюдения показали, что после комплексного воздействия даларгина и ТЭС у собак опытной группы повышался аппетит, и их переводили со щадящей диеты на обычную диету.
У собак второй группы общее состояние было угнетённым, полноценный аппетит у них проявлялся только на 10-15 сутки.
Результаты электрогастрографии показали, что у собак первой и второй групп до начала эксперимента сократительная активность желудка была слабой и её показатели находились практически на одинаковом уровне. У собак третьей группы перистальтика желудка была хорошо выраженной и соответствовала здоровым животным.
После комплексного применения даларгина и ТЭС у собак первой группы сократительная функция желудка нормализовалась и её показатели по своим значениям приближались к таковым у здоровых собак. У собак второй группы моторика желудка восстанавливалась только к 10-15 суткам после операции.
Таким образом, комплексное применение даларгина и ТЭС позволяет ускорить нормализацию функционального состояния желудка у собак после хирургических операций.
ВЫВОДЫ
1. Введение синтетического аналога опиоидных пептидов даларгина не оказывало отрицательного влияния на организм кроликов, собак и овец. Общие клинические и гематологические показатели после введения препарата у всех подопытных животных находились в пределах физиологических границ и не имели достоверных различий по сравнению с фоновыми показателями.
2. После проведения ТЭС у кроликов, собак и овец достоверно (P<0,05) повышалось содержание в крови эритроцитов, глюкозы и гамма-глобулинов. Изменения лейкоцитов, гемоглобина, общего белка, альбуминов, альфа - и бета-глобулинов, АСТ, АЛТ и ЩФ после электростимуляции имели недостоверный (P>0,05) характер.
3. При комплексном применении даларгина и ТЭС у подопытных животных достоверно (P<0,05-0,01) повышалось содержание лейкоцитов, глюкозы и гамма-глобулинов. Содержание эритроцитов, гемоглобина, общего белка, альбуминов, альфа - и бета-глобулинов, АСТ, АЛТ и ЩФ по сравнению с фоновыми значениями достоверных (P>0,05) различий не имели и находились в пределах физиологических норм.
4. После введения даларгина в дозе 1 мг/гол сократительная активность желудка у собак уменьшалась незначительно. При введении препарата в дозе 2 мг/гол изменения сократительной активности желудка были более выраженными и через 180 мин её показатели достигали минимальных значений.
5. Даларгин оказывал слабо выраженное влияние на сократительную функцию желудка у собак и сычуга у овец с нормальной и пониженной моторикой желудка, после введения препарата показатели перистальтики желудка и сычуга достоверно уменьшались и через 180 мин достигали фоновых значений.
6. Оптимальный режим ТЭС для собак и овец включает применение постоянного тока, нарастающего от 0 до 3,5 мА с последующей подачей на электроды прямоугольных импульсов с частотой 70-80 Гц и длительностью 3-4 мс. Применение ТЭС с данными параметрами не оказывает отрицательного влияния на организм подопытных животных: после электростимуляции основные клинические и гематологические показатели изменялись в пределах физиологических границ.
7. ТЭС оказывает гомеостатическое действие на сократительную функцию желудка у собак и сычуга у овец. После курса электростимуляции у животных, как с пониженной, так и с повышенной перистальтикой органов показатели сократительной активности нормализовались и возвращались к фоновым значениям.
8. Эффекты даларгина и ТЭС блокировались антагонистом опиоидных пептидов налоксоном. У собак и овец после введения налоксона изменения показателей сократительной активности желудка и сычуга имели недостоверный характер.
9. Даларгин оказывает блокирующее действие на секреторную функцию желудка собак. Через 2-6 часов показатели общей кислотности, свободной и связанной соляной кислоты и ферментативной активности пепсина достоверно (P<0,05-0,01) снижались, достигая минимальных значений через 6 часов. У овец даларгин оказывал слабо выраженное влияние на секреторную функцию сычуга, за исключением ферментативной активности пепсина, снижение которой через 6 часов после введения препарата имело достоверный (P<0,05) характер.
10. ТЭС не оказывала существенного влияния на секреторную функцию желудка и сычуга у овец, как до приёма корма, так и после кормления. У животных с пониженной секреторной активностью после ТЭС её показатели повышались и приближались к физиологическим величинам.
11. Введение налоксона блокировало эффекты ТЭС. Показатели секреторной функции желудка у собак и сычуга у овец при комплексном применении налоксона и электростимуляции, по сравнению с фоновыми показателями, достоверных различий не имели.
12. Применение разработанного способа коррекции функционального состояния желудка с использованием даларгина и ТЭС позволяет сократить реабилитационный период у животных после хирургических операций на желудке.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для коррекции функционального состояния желудка и сокращения реабилитационного периода у собак после хирургических операций на желудке рекомендуется комплексное применение даларгина и ТЭС. С этой целью животным на третий день после операции вводят даларгин в дозе 2 мг/гол в течение 3 дней подряд. Затем проводят ТЭС в следующем режиме: вначале на электроды, расположенные сагиттально на голове животного (анод – в затылочной области, катод – в лобной области), подаётся постоянный ток, плавно нарастающий в течение двух минут от 0 до 3,5 мА. После этого на электроды в той же полярности подаётся импульсный ток с частотой 70-80 Гц и длительностью импульса 3,5 мс. Продолжительность электросеанса 30 мин в течение 3 дней подряд.
2. Полученные результаты экспериментальных исследований могут быть использованы в учебном процессе при преподавании курса физиологии животных на факультетах ветеринарной медицины.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Григорьев реакция антиноцицептивной системы мозга животных при различных режимах транскраниальной электростимуляции / , , // Вестник Курской ГСХА. – 2011. - №6. – С.68-71.
2. Григорьев статус у собак при транскраниальной электростимуляции / , ёва // Научное обеспечение инновационного развития отечественного животноводства. – Материалы Всероссийской научно-практической конференции. – Новочеркасск: ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии, 2011. – С.216-217.
3. Григорьев синтетического опиоидного пептида даларгина на гистологическую структуру желудочно-кишечного тракта животных / , , ёва // Молодёжь и аграрная наука XXI века: проблемы и перспективы: материалы Международной научно-практической конференции студентов и аспирантов. – Курск, 2011. – С.8-10.
4. Григорьев желудка у собак и сычуга у овец при введении экзогенного опиоидного пептида / , , ёва // Научное обеспечение агропромышленного производства: материалы Международной научно-практической конференции. – Курск, 2012. – Часть 3. – С.33-35.
5. Григорьев реакции у животных при транскраниальной стимуляции / , ёва, // Инновационные пути развития АПК на современном этапе: материалы 16-й Международной научно-производственной конференции. – Белгород, 2012. – С.64.
6. Григорьев β-эндорфина в крови животных при использовании разных режимов транскраниальной электростимуляции / ёнов, , // Интегративные процессы в образовании и науке: материалы Международной научно-практической конференции. – Москва, 2012. – С.6-8.
 | |
| |
|
