Внутриклеточные протеиназы в патогенезе и прогнозе злокачественных новообразований (стр. 2 )

* - значимость различий по сравнению с неизмененной тканью, р<0,05;

Другими сопряженными с протеасомами ферментами внутриклеточного протеолиза являются кальпаины. При раке почки обнаружено снижение активности ферментов в опухоли в 1,3 раза по сравнению с неизмененной тканью, что составляло в среднем 37,5 ×103 Ед/мг белка (табл.2). Низкая активность протеасом в опухоли коррелировала со сниженной активностью кальпаинов, что подтверждено также данными непараметрического корреляционного анализа.

Рис. 2. Экспрессия субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при раке почки: А - Вестерн блоттинг субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной тканях; Б - Содержание субъединиц протеасом в опухолевой ткани в процентном отношении к содержанию субъединиц протеасом в неизмененной ткани.

Примечание: 1, 3 – в опухолевой ткани; 2, 4 – в неизмененной ткани;

* - значимость различий по сравнению с неизмененной тканью р<0,05

Следует отметить, что прогрессирование заболевания и развитие гематогенных метастазов сопровождалось еще более значительными изменениями активности внутриклеточных протеиназ. В метастазирующих опухолях почки происходило снижение активности протеасом, сопровождаемое повышением активности кальпаинов. В группе больных со стадией Т2-4N0-1M1 наблюдалось снижение тотальной активности протеасом в 1,3 раза и повышение активности кальпаинов в 1,3 раза по сравнению с группой больных Т1-3N0-1M0. Известно, что кальпаины осуществляют лимитированный протеолиз специфических субстратов. В отсутствии протеасом они являются ответственными за частичный протеолиз белков и пептидов. Так, возможными их субстратами в ткани опухоли могут быть ингибитор транскрипционного фактора NF-kB – IkB, а также ядерный фактор HIF-1. Неполный протеолиз этих транскрипционных факторов может быть причиной их накопления в опухолевых клетках, что, в свою очередь, приводит к развитию гематогенных метастазов [Zhou A., 2006; Li C., 2010].

В представленном исследовании показано, что разнонаправленное изменение активности внутриклеточных протеиназ при метастазировании РП происходило на фоне увеличения уровня транскрипционных факторов HIF-1a, NF-kBp65 и ростового фактора VEGF (табл. 3). В проведенном исследовании отмечен значительный рост продукции ядерного фактора NF-kB p65 в 3,2 раза, коэффициента NF-kB p65/ p50 в 5 раз, транскрипционного фактора HIF-1a и ростового фактора VEGF в 1,9 и 2,8 раза, соответственно, у больных с отдаленными метастазами заболевания по сравнению с локализованной формой.

Таким образом, в ткани светлоклеточного рака почки установлена низкая химотрипсинподобная активность протеасом и кальпаинов по сравнению с неизмененной тканью. Развитие гематогенных метастазов сопровождается дальнейшим снижением активности протеасом и увеличением активности кальпаинов, что не может в полной мере обеспечить эффективный протеолиз и приводит к нарушению деградации транскрипционного фактора HIF-1a (r=-0,36; p=0,04) и увеличению продукции ростового фактора VEGF. Вероятно, увеличение экспрессии транскрипционного фактора NF-kB p65 в метастазирующей светлоклеточной карциноме способствует росту продукции ядерного фактора HIF-1a (r=0,9; p=0,001) и дальнейшему прогрессированию заболевания. Наши результаты совпадают с данными на культуре почечноклеточного рака, в которых обнаружено влияние фактора транскрипции NF-kB на фактор HIF-1 [van Uden P., 2010].

Изучение прогностической значимости показателей внутриклеточного протеолиза и экспрессии транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF при раке почки позволило выявить комплекс показателей связанных с безметастатической и общей выживаемостью больных. Снижение активности 26S и 20S протеасом ниже их пороговых значений, менее 12,2 и 29,8×1000 Ед/мг белка, соответственно, ассоциируется с лучшей безметастатической выживаемостью больных. Увеличение общей выживаемости больных РП наблюдается на фоне снижения тотальной активности протеасом и 20S пула протеасом ниже 36,9 и 29,8×1000 Ед/мг белка, соответственно.

Таблица 3

Зависимость экспрессии транскрипционных факторов NF-kB p65, NF-kB p50, HIF-1 и ростового фактора VEGF в опухоли от клинико-морфологических параметров злокачественных новообразований, Ме (Q1-Q3)

Локали-зация		Содержание NF-kB p65, УЕ /мг белка в лунке тотальная	Содержание NF-kB p50, УЕ /мг белка в лунке	Коэффи-циент NF-kB p65/ p50	Экспрессия HIF-1a, УЕ/ мг белка в лунке	Содержание VEGF, пг/мг белка
РП	Т1-3N0-1M0	5,0 (2,0-7,9)	6,4 (3,3-10,0)	0,6 (0,3-2,0)	4,2 (2,2-7,8)	71,5 (38,3-139,7)
Т2-4N0-1M1	11,3 (6,8-15,7)*	6,2 (4,4-9,7)	3,0 (1,6-3,0)*	7,9 (6,2-8,5)*	205,4 (131,7 -261,5)*
РМП	T2N0M0	13,9 (8,3-21,4)	14,4 (8,5-29,0)	1,0 (0,64-1,3)	8,6 (4,1-14,8)	78,7 (50,5-131,6)
T3N0M0	7,2 (5,6-17,7)	8,9 (4,5-13,6)**	1,5 (0,7-3,0)	25,1 (3,6-41,4)**	146,2 (81,5-201,7)**
РЭ	Ia	14,1 (8,4-19,8)	16,6 (7,1-26,4)	0,7 (0,5-2,1)	7,8 (5,6-10,0)	102,0 (68,6-130,9)
Ib	11,0 (7,8-19,2)	6,8 (5,9-7,8)	1,3 (1,15-1,4)	11,9 (7,8-19,2)***	164,6 (162,8-329,9)***
II	11,7 (4,6 –13,2)	4,0 (2,7 – 12,5)***	1,6 (0,9- 2,4)***	4,0 (3,7- 8,4)	176,2 (51,2- 236,8)***
ПКГШ	Т2-3N0M0	9,2 (5,9 -14,4)	6,6 (2,2 - 17,0)	1,6 (0,7- 3,3)	7,8 (4,6- 21,1)	71,1 (48,2- 87,7)
T2-3N1M0	12,5 (10,7- 16,7)	19,7 (11,8 - 30,8)#	0,6 (0,5- 0,8)	10,9 (10,8- 16,7)	92,1 (84,5- 98,7)
T2-3N2M0	8,7 (7,0- 19,4)	5,2 (2,8 - 7,8)##	2,5 (1,7- 3,2) ##	9,0 (6,5- 14,6)	74,5 (65,2- 88,8)

Примечание:

*- значимость различий по сравнению с группой больных со стадией Т1-3N0-1M0; p<0,05; ** - значимость различий по сравнению с группой больных с размером опухоли Т2, p<0,05; *** - значимость различий по сравнению с сравнению с группой больных со стадией Ia, (р<0,05); # - значимость различий по сравнению с сравнению с группой Т2-3N0, р<0,05); ## - значимость различий по сравнению с сравнению с группой T2-3N1, (р<0,05);

Результатом проведенного дискриминантного анализа явилось создание модели прогнозирования развития гематогенных метастазов при РП, в которую включены важные транскрипционные и ростовые факторы. В результате дискриминантные функции имели следующий вид:

Y1 = -3,2+0,026×X1+0,03×X2-0,02×X3+0,34×X4+0,3×X5;

Y2= -33,3-0,01×X1+0,11×X2-1,2×X3+1,57×X4+1,8 ×X5;

где Х1 – тотальная активность протеасом ×10-3 Ед/мг белка; Х2 - содержание VEGF, пг/мг белка; Х3 - экспрессия HIF-1, УЕ/мг белка в лунке; Х4 - экспрессия NF-kB p50, УЕ/мг белка в лунке; Х5 - коэффициент NF-kB p65/50.

Y1 характеризует низкую вероятность развития гематогенных метастазов, Y2 – высокую вероятность. Если значение функции Y1 > Y2, то прогнозируют высокую вероятность развития гематогенных метастазов у больных раком почки.

Чувствительность и специфичность модели составляли 96% и 70%, соответственно. Предлагаемая модель с высокой диагностической эффективностью позволяет предсказать вероятность появления гематогенных метастазов у больных раком почки после проведенного хирургического вмешательства, что позволяет определить оптимальные сроки динамического наблюдения и в случае прогрессирования заболевания принять своевременные лечебные меры.

Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака мочевого пузыря. В ткани РМП химотрипсинподобная активность 26S протеасом была выше в 2,5 раза по сравнению с таковой в гистологически неизмененной ткани (табл.2). Рост активности данного пула протеасом сочетался со снижением содержания тотального пула протеасом на 29,5% и увеличением экспрессии Rpt6 субъединиц на 58,8% по сравнению с неизмененной тканью (рис.3). Вероятно, увеличение активности протеасом в тканях РМП по сравнению с неизмененными тканями связано с повышением содержания 26S пула протеасом [Xie Y. et al., 2010].

В опухоли мочевого пузыря активность кальпаинов была равна 34,0 (21,5-51,9) ×103 Ед/мг белка, что также превышало соответствующий показатель в неизмененной ткани мочевого пузыря. Возможно, увеличение активности 26S протеасом и кальпаинов в ткани опухоли является свидетельством их совместного участия в патогенезе переходноклеточного рака мочевого пузыря.

Экспрессия транскрипционных и ростовых факторов в ткани РМП также была связана с течением заболевания. Отмечено, что увеличение глубины инвазии опухоли сочеталось со снижением уровня ядерного фактора NF-kB р50. Данный показатель у больных с Т3N0M0 стадией заболевания уменьшался в 1,9 раза по сравнению с больными с Т2N0M0 стадией (табл.3).

Рис.3. Экспрессия субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при РМП: А - Вестерн блоттинг субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной тканях при раке мочевого пузыря; Б - Содержание субъединиц протеасом в опухолевой ткани рака мочевого пузыря в процентном отношении к содержанию субъединиц протеасом в неизмененной ткани.

Примечание: 1, 3 – в опухолевой ткани; 2, 4 – в неизмененной ткани; * - значимость различий по сравнению с неизмененной тканью р<0,05

Прогрессирование заболевания сопровождалось также активацией процесса ангиогенеза. В группе больных со стадией заболевания Т3N0M0 экспрессия транскрипционного фактора HIF-1a и ростового фактора VEGF в опухоли увеличивались в 2,9 и 1,8 раза, соответственно, по сравнению с больными со стадией Т2N0M0.

Гистологическая организация опухоли играет важную роль в патогенезе рака. Известно, что в низкоорганизованные опухоли обладают более агрессивным течением. Снижение степени дифференцировки опухоли мочевого пузыря приводило к росту активности 26S протеасом, кальпаинов. Активность 26S протеасом и кальпаинов в низко дифференцированных опухолях повышалась в 1,3 и 2 раза, соответственно по сравнению с умеренно дифференцированными.

Учитывая важную роль внутриклеточных протеиназ в регуляции экспрессии транскрипционных факторов, было проведено их исследование в связи с активностью протеасом и кальпаинов. При уменьшении степени гистологической организации опухоли происходило увеличение экспрессии транскрипционных факторов NF-kB р65, NF-kB р50, HIF-1a и содержания ростового фактора VEGF. В низко дифференцированных опухолях содержание фактора NF-kB p65 увеличивалось в 4 раза по сравнению с высоко дифференцированными опухолями. Подобные изменения были выявлены для ядерного фактора NF-kB p50, уровень которого повышался при увеличении степени гистологической организации опухоли в 2,0 раза по сравнению с высоко дифференцированными раками. Вероятно, агрессивное течение низко дифференцированных опухолей связано с большей интенсивностью патологических процессов, приводящих к росту пролиферативного потенциала опухолевых клеток, и к быстрой активации ангиогенеза.

Изучение связи содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF с активностью внутриклеточных протеиназ показало, что протеолиз при РМП, связанный с увеличением активности пула 26S протеасом, 20S протеасом и тотальной активности протеасом, осуществляет контроль ангиогенеза, что происходит за счет их участия в разрушении транскрипционного фактора HIF-1, ростового фактора VEGF. В исследованиях Zhou A. (2006) выявлено также участие кальпаинов в деградации HIF-1 [Zhou A., 2006]. Результаты представленного исследования подтверждают роль кальпаинов в развитии РМП, которые регулируют содержание ядерного фактора NF-kBp50, что в свою очередь оказывает влияние на уровень HIF-1a и VEGF. В ранее проведенных экспериментальных исследованиях [Kassis J., 2002] показана роль данных протеиназ в регуляции подвижности опухолевых клеток мочевого пузыря. Установлено, что кальпаины способствуют активации транскрипционного фактора NF-kBp50, а учитывая влияние последнего на продукцию транскрипционного фактора HIF-1 [van Uden P. 2010], можно утверждать, что они косвенно стимулируют ангиогенез в опухоли. Таким образом, инвазивный рост опухоли, увеличение пролиферативного потенциала раковых клеток и формирование новых кровеносных сосудов регулируются внутриклеточными протеиназами и являются молекулярной основой процесса рецидивирования РМП.

Рак мочевого пузыря представлен довольно разнородной группой больных, среди которых встречаются лица с повышенным риском повторного рецидивирования. Эта закономерность выдвигает на первый план углубленное изучение механизмов развития заболевания и поиска информативных маркеров рецидивирования. К числу потенциальных маркеров, связанных с появлением рецидивов РМП, по данным ряда авторов, относят наличие микросателлитных последовательностей ДНК, мутаций проонкогенов, онкосупрессоров, регуляторов клеточного цикла, рост содержания ангиогенных факторов [Goddard J. C., 2003; Garcia-Closas M., 2007; Inoue K., 2002] и молекул адгезии [Goldberg A. L., 2007]. Однако эти результаты носят противоречивый характер и их значимость в прогнозе течения РМП неоднозначна.

Участие внутриклеточных протеиназ в патогенезе РМП, их связь уровнем экспрессии транскрипционных и ростовых факторов определяет значение изучаемых показателей в оценке безрецидивной выживаемости больных (рис. 4, 5).

Рис.4. Безрецидивная выживаемость больных РМП в зависимости от порогового уровня 26S протеасом в ткани опухоли, равного 18,0×1000 Ед/мг белка

Активность 26S протеасом менее 18×1000 Ед/мг белка и уровень коэффициента NF-kBp65/p50 менее 1,0 в ткани опухоли ухудшали безрецидивную выживаемость. Выявленный факт подтверждает показанную связь увеличения глубины инвазии опухоли со снижением экспрессии транскрипционного фактора NF-kB p50 на фоне роста содержания ядерного фактора HIF-1 и ростового фактора VEGF. При этом стоит отметить отсутствие связи изучаемых протеиназ с инвазивным ростом опухоли мочевого пузыря. Однако, учитывая роль протеасом в процессах активации транскрипционного фактора NF-kB и в деградации транскрипционного фактора HIF-1, роль внутриклеточного протеолиза в процессе онкогенеза довольно значительна.

Рис.5. Безрецидивная выживаемость больных РМП в зависимости от порогового уровня коэффициента NF-kBp65/p50, равного 1,0

Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака эндометрия. Химотрипсинподобная активность тотального пула протеасом, активность 26S протеасом и 20S протеасом в опухоли эндометрия были увеличены в 2,4; 1,8 и 1,4 раза, соответственно, по сравнению с неизмененной тканью (табл. 2).

Изменение тотальной химотрипсинподобной активности протеасом, их пулов 26S и 20S при РЭ связано с увеличением экспрессии иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 на 42,4% и 29,3%, соответственно, на фоне снижения экспрессии a1a2a3a5a6a7 субъединиц протеасом в ткани опухоли на 29,3% по сравнению с такими же показателями в нормальной ткани (рис.6). Вероятно, изменение субъединичного состава протеасом приводит к увеличению их активности. Связь активности протеасом с формированием модифицированных форм ферментов и наличием в их составе иммунных субъединиц представлена в экспериментальных работах Almond J. B. (2002) и Arlt A. (2009). При РЭ была выявлена ассоциация экспрессии LMP2 субъединицы протеасом и тотальной активности протеасом.

Рис.6. Экспрессия субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при РЭ: А - Вестерн блоттинг субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной тканях; Б - Содержание субъединиц протеасом в опухолевой ткани в процентном отношении к содержанию субъединиц протеасом в неизмененной ткани.

Примечание: 1, 3 – в опухолевой ткани; 2, 4 – в неизмененной ткани; * - значимость различий по сравнению с неизмененной тканью р<0,05

Увеличение содержания PA28b субъединиц протеасом на 18,5,0% в опухоли эндометрия по сравнению с нетрансформированной тканью, вероятно, свидетельствует о повышении содержания всего активаторного комплекса РА28 и является причиной высокой активности 20S пула протеасом [Emmerich N. P.N., 2000]. Протеолиз, осуществляемый данным пулом протеасом, происходит без участия АТФ, является частичным и затрагивает короткоживущие и аномальные белки [Emmerich N. P.N., 2000; Sorokin, 2011]. Его значение возрастает в условиях патологии и при усилении процесса внутриклеточного протеолиза.

При изучении связи изучаемых показателей с клинико-морфологическими параметрами заболевания выявлено, что увеличение стадии заболевания способствовало росту активности пула 20S протеасом при повышении экспрессии LMP2 и PA28 субъединиц протеасом. Также активность внутриклеточных кальций зависимых ферментов увеличивалась в 1,8 раза в группе больных со II стадией по сравнению с больными с Ia стадией.

Одной из важных функций внутриклеточных протеиназ является регуляция экспрессии транскрипционных факторов, в частности NF-kB, HIF-1. В опухоли эндометрия отмечено преобладание неактивных форм ядерного фактора, о чем свидетельствует коэффициент NF-kB p65/р50 менее 1,0. Прогрессирование заболевания, увеличение стадии процесса приводило к снижению экспрессии транскрипционного фактора NF-kB р50. Продукция транскрипционного фактора уменьшалась в 4,5 раза у больных со II стадией заболевания по сравнению с Ia стадией.

Также увеличение стадии заболевания сопровождалось значимыми изменениями экспрессии транскрипционного фактора HIF-1 и ростом уровня ростового фактора VEGF. У больных с Ib стадией заболевания экспрессия HIF-1a увеличивалась в 1,5 раза по сравнению с группой больных с Ia стадией (табл.3). У больных со II стадией заболевания экспрессия HIF-1a снижалась в 1,9 раза, а уровень продукции VEGF в этом случае повышался в 1,7 раза по сравнению с больными с Ia стадией. Данная закономерность, вероятно, может быть объяснена влиянием транскрипционного фактора NF-kB на активацию процесса транскрипции VEGF без участия HIF-1a [Shibata A., 2002].

Важным аспектом онкогенеза на фоне гормонально-метаболических нарушений является активирующее влияние лептина, гормона жировой ткани, на продукцию транскрипционных факторов NF-kB, HIF-1 и, как следствие, на содержание VEGF [Gonzalez-Perez RR, 2010]. Однако в представленном исследовании показано, что развитие гормонально-метаболических нарушений происходило при снижении экспрессии VEGF в опухоли в 1,7 раза по сравнению с больными без метаболического синдрома. Вероятно, влияние лептина на ткани опухоли на уровне организма не ограничивается его прямым действием на содержание транскрипционных факторов, но и опосредуется другими причинами, в частности, вовлечением в процесс регуляции эстрогенов. В экспериментальных условиях показано, что при развитии метаболического синдрома эстрогены способствует снижению уровня экспрессии HIF-1 и содержания VEGF в тканях [Xu J. et al., 2012]. Данный факт находит свое подтверждение в связи с наличием влияния ER профиля опухоли на продукцию фактора роста VEGF, что представлено нами далее.

Важным для развития РЭ молекулярно-генетическим параметром является рецепторный статус опухоли, который оказывает значительное влияние на развитие заболевания, связан с ее чувствительностью к лекарственной терапии. Выявлено увеличение активности 26S протеасом в ткани ER позитивных опухолей эндометрия в 1,9 раза по сравнению с ЕR негативными (табл.4).

Таблица 4

Зависимость активности протеасом в ткани рака эндометрия от рецепторного статуса опухоли, Me (Q1-Q3)

	Химотрипсинподобная активность протеасом в опухолевой ткани, 10*3 Ед/мг белка
тотальная	26S протеасом	20S протеасом
ER статус	ER отрицательные	149,1 (86,1-350,0)	14,0 (10,6-70,1)	78,3 (41,6-252,1)
ER позитивные	79,8 (42,2-161,6)	27,7 (22,8-42,9)*	66,5 (52,5-150,6)
PR статус	PR негативные	86,1 (46,6-125,6)	14,0 (13,0-15,1)	63,3 (26,6-100,0)
PR позитивные	100,0 (48,4-172,6)	27,7 (22,7-44,0)	66,5 (55,0-176,1)

Примечание: