Внутриклеточные протеиназы в патогенезе и прогнозе злокачественных новообразований (стр. 1 )

На правах рукописи

СПИРИНА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ И ПРОГНОЗЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

– онкология

– патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Томск -2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры иммунологии и аллергологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава РФ

доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории патологической физиологии ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник торакоабдоминального отделения ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН

Ведущая организация: ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. » Российской академии медицинских наук, Москва.

Защита состоится «____»_______________2013 г. в_____часов на заседании диссертационного совета Д.001.032.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии» СО РАМН ( г. Томск, пер. Кооперативный, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН.

Автореферат разослан «____»_________________________2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Онкологические заболевания являются важной медико-социальной проблемой современной России. В настоящее время отмечен неуклонный рост заболеваемости данной патологией среди лиц трудоспособного возраста, приводящий к ранней инвалидизации и увеличению уровня смертности среди них. Достаточно высокий удельный вес в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями населения России занимают плоскоклеточные опухоли головы и шеи (4,4%), рак тела матки (3,8%), почки (3,6), мочевого пузыря (2,7%). Злокачественные новообразования тела матки (7,1%) занимают второе место в структуре онкологической патологии женских репродуктивных органов, уступая лишь опухолям молочной железы [, 2012].

Рост заболеваемости злокачественными новообразованиями, преобладание распространенных форм данной патологии ставит перед фундаментальной онкологией новые задачи по поиску оптимальных маркеров опухолевого роста, прогрессирования заболевания, а также значимых прогностических показателей. Одним из перспективных подходов является изучение систем внутриклеточного протеолиза [Yamasaki L. et al, 2004; Lah T. T. et al, 2006]. Существуют данные, которые показывают, что протеолиз обеспечивает такие важные процессы, определяющие опухолевый рост как пролиферативная активность, апоптоз, регуляция неоангиогенеза, функционирование иммунной системы и индукция лекарственной резистентности [Lah T. T. et al, 2006; Dahlmann B., 2007; Sharova N., 2011].

Основными компонентами внутриклеточного протеолиза являются протеасомная и кальпаиновая системы [ Н, 2010; , 2011; Frisan T., 1998; Almond J. B., 2002; Arlt A., 2009]. Нарушение в функционировании протеасомного комплекса имеет большое значение в развитии онкологических заболеваний различных локализаций, в частности, толстой кишки, легких, молочной железы и др. [Erlanson M., 2001; Hayashi H., 2001; Li J. Q., 2001; Barnes C. J., 2005; Ducoux-Petit M et al., 2008; Pan J., 2010]. Однако эти факты, в основном, носят экспериментальный характер и получены на культурах клеток. В экспериментальных условиях показана апоптотическая гибель раковых клеток эндометрия при применении ингибитора протеасом - бортезомиба [Dolcet X., 2006]. Изучение тканей опухолей показало, что прогрессирование злокачественных новообразований почки и мочевого пузыря тесно связано с изменением состояния протеасом и уровня убиквитинированных белков [Dahlmann B., 2007]. Активность протеасом в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи, ее связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания не изучена.

Системы внутриклеточного протеолиза находятся в тесной связи друг с другом. Предполагается, что кальпаины способствуют изменению структуры белков, что делает их восприимчивыми для дальнейшего протеасомного расщепления [Jang J. S., 1999]. Выявлена заместительная роль кальпаинов в процессах протеолиза белков в клетке в отсутствии необходимого количества протеасом, а также при угнетении их ферментативной активности [Smith I. J., 2007; Sorimashi, 2011]. Разрушение и модификация белков при помощи внутриклеточных протеиназ имеет огромное значение в жизнедеятельности клетки. Их субстратами выступают многие регуляторные белки, среди которых наиболее важны транскрипционные и ростовые факторы, их рецепторы и белки сигнальных систем.

В настоящее время, несмотря на изучение роли внутриклеточных систем протеолиза в развитии патологических состояний, отсутствуют данные об их особенностях при развитии злокачественных новообразований различного происхождения. Имеются единичные сведения о связи ростовых и транскрипционных факторов с внутриклеточным протеолизом [Su Y., 2006; An J., 2007]. В целом, аспект протеолитической регуляции экспрессии ростовых и транскрипционных факторов, которые определяют возникновение и прогрессирование злокачественных опухолей, не исследован. Учитывая важную роль внутриклеточных протеолитических систем и регулируемых ими ростовых и транскрипционных факторов в патогенезе рака, важным практическим приложением работы является разработка новых молекулярных маркеров прогноза течения онкологических заболеваний.

Цель исследования. Изучение роли внутриклеточных протеиназ в патогенезе злокачественных новообразований почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточных карцином головы и шеи с определением их прогностической значимости.

Задачи исследования:

1.  Изучить химотрипсинподобную активность протеасом, их субъединичный состав и активность кальпаинов в опухолевой ткани больных раком почки, мочевого пузыря, эндометрия, плоскоклеточными карциномами головы и шеи, сопоставить изучаемые показатели с соответствующими значениями неизмененных тканей.

2.  Изучить экспрессию транскрипционных факторов NF-kB (р50 и р65), HIF-1a и содержания ростового фактора VEGF в тканях опухолей почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточных карцином головы и шеи.

3.  Определить экспрессию инсулиноподобных факторов роста (ИФР-I, ИФР-II), их связывающих белков и металлопротеиназы PAPP-A в ткани рака эндометрия.

4.  Изучить взаимосвязи активности внутриклеточных протеиназ с экспрессией ростовых и транскрипционных факторов в тканях злокачественных новообразований для выяснения патогенетических механизмов опухолевой прогрессии.

5.  Оценить взаимосвязь изучаемых молекулярных показателей с клинико-морфологическими параметрами заболевания у больных злокачественными новообразованиями.

6.  Оценить прогностическую значимость компонентов внутриклеточных протеолитических систем у изучаемого контингента больных.

7.  Разработать математические модели прогноза риска развития гематогенных метастазов у больных раком почки и лимфогенных метастазов у больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи.

Научная новизна

Впервые исследована химотрипсинподобная активность протеасом, их субъединичный состав, а также активность кальпаинов в опухолевой ткани больных раком почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточным раком головы и шеи. Выявлено тканеспецифичное изменение активности, субъединичного состава протеасом и активности кальпаинов в опухолях различных локализаций, а именно, повышение активности протеасом и кальпаинов в опухолях мочевого пузыря, в плоскоклеточных карциномах головы и шеи по сравнению с окружающей условно нормальной тканью, повышение активности протеасом в тканях рака эндометрия и снижение этих показателей в ткани рака почки. Изменения активности протеасом связаны с изменением экспрессии субъединиц протеасом.

Получены принципиально новые сведения о зависимости изучаемых показателей от клинико-морфологических параметров заболевания. Показано, что развитие гематогенных метастазов у больных раком почки связано со снижением активности протеасом и возрастанием активности кальпаинов в первичной опухоли, что сопровождается увеличением содержания ядерных факторов NF-kB p65, HIF-1 и ростового фактора VEGF. У больных раком мочевого пузыря увеличение глубины инвазии опухоли приводит к повышению активности 26S протеасом, кальпаинов, а также к снижению экспрессии транскрипционного фактора NF-kBр50. При мере увеличения стадии рака эндометрия наблюдалось повышение активности 20S протеасом и кальпаинов. Рецепторный статус опухоли эндометрия ассоциирован с активностью протеасом, а также с экспрессией транскрипционного фактора NF-kBp50. У больных ПКГШ с увеличением стадии заболевания наблюдается повышение активности протеасом и кальпаинов, которое сопровождается изменением содержания транскрипционного фактора NF-kB р50.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты расширяют представления о роли протеасомной и кальпаиновой систем в патогенезе злокачественных новообразований почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточных карцином головы и шеи. Показано, что в исследованных опухолевых тканях активность протеасом и кальпаинов коррелирует с экспрессией транскрипционных факторов NF-kB и HIF-1, что подтверждает возможность регуляции этих биологически важных молекул системами внутриклеточного протеолиза. В опухолях эндометрия другим важным протеолитическим регулятором содержания факторов роста ИФР-I, VEGF и ядерного фактора HIF-1 является металлопротеиназа PAPP-A.

Выявлена прогностическая значимость определения активности протеасом для оценки безметастатической и общей выживаемости больных раком почки, а также общей выживаемости больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи. Безметастатическая выживаемость больных опухолями головы и шеи ассоциирована с экспрессией транскрипционных факторов NF-kB p65, NF-kB p50 и HIF-1a. На основании полученных данных методом многомерной статистики построена модель прогнозирования развития гематогенных метастазов рака почки и лимфогенных метастазов плоскоклеточных карцином головы и шеи.

Положения, выносимые на защиту

1.  Химотрипсинподобная активность протеасом и кальпаинов в опухолях мочевого пузыря и плоскоклеточных раков головы и шеи значительно превышает соответствующий показатель в условно нормальной нетрансформированной окружающей опухоль ткани, для пациенток с опухолями эндометрия характерно увеличение только активности протеасом. У больных раком почки активность внутриклеточных протеиназ снижена. Повышение активности протеасом тесно связано с их субъединичным составом, а именно, с увеличением содержания иммунных и 20S активированных форм.

2.  Об участии протеасом и кальпаинов в регуляции транскрипционных и ростовых факторов свидетельствуют взаимосвязи между активностью протеасом, их пулов, активностью кальпаинов и экспрессией транскрипционных факторов NF-kB, HIF-1a и ростового фактора VEGF у больных раком почки, мочевого пузыря и с ростовым фактором ИФР-I у пациенток с опухолями эндометрия. Кроме того, в опухолях эндометрия показана ассоциация между экспрессией металлопротеиназы РАРР-А и содержанием HIF-1a и ИФР-I.

3.  Активность протеасом ассоциируется с безрецидивной выживаемостью больных раком мочевого пузыря, безметастатической выживаемостью больных раком почки, а также общей выживаемостью пациентов с опухолями почки и плоскоклеточными карциномами головы и шеи. Возникновение локорегионарных рецидивов при раке эндометрия зависит от субъединичного состава протеасом. Экспрессия транскрипционных факторов NF-kB p65, NF-kB p50 и HIF-1a связана с прогнозом рецидивирования рака мочевого пузыря и безметастатической выживаемостью больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Российских научно-практических конференциях с международным участием, г. Барнаул, ; конференции молодых специалистов - онкологов Уральского федерального округа, г. Челябинск: 2008г.; III-VIII конференциях молодых ученых им. Академика РАМН г. Томск, ; III Конгрессе с международным участием «Опухоли головы и шеи», г. Сочи, 2009 г; Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития», г. Томск, 2009г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, г. Казань 2009 г.; VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ, г. Душанбе, 2010 г.; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», г. Петрозаводск, 2011 г.; 8-й конференции по фундаментальной онкологии, ФГБУ НИИ онкологии им. Минздравсоцразвития России, г. Санкт-Петербург, 2012г.; 11-й Всероссийской конференции молодых ученых, г. Москва, 2011г.; 17th International meeting of the European society of gynaecological oncology (ESGO) Milan, Italy, 2011г.; Седьмом съезде онкологов и радиологов стран СНГ, г. Астана, 2012г.;

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № , а также Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на годы» (Государственный контракт №П320). По итогам исследования оформлено 1 ноу-хау «Новая мишень таргетной терапии злокачественных новообразований различных локализаций» (ноу-хау №2 от 01.01.2001).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 45 печатных работах, в том числе 22 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования используются в обучении студентов и клинических ординаторов при изучении вопросов, посвященных патогенетическим аспектам, диагностике и лечения онкологических заболеваний различных локализаций на кафедре онкологии ГБОУ «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 308 страницах и иллюстрирована 24 рисунками и 93 таблицами. Библиография включает 351 литературных источников, из которых 21 отечественных и 334 иностранных.

Личный вклад автора. Анализ данных литературы по теме диссертации, планирование исследования, определение цели, задач, выбор методов исследования, его проведение, статистический анализ результатов и написание диссертации выполнены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с поставленной целью и задачами было проведено комплексное исследование 266 больных, обратившихся на консультативный прием и находившихся на стационарном лечении в клиниках ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН с 2006 по 2012 год. В исследование вошли 4 группы больных: 1 группа – 65 больные со светлоклеточным почечноклеточным раком, 2 группа – 54 пациента с раком мочевого пузыря, 3 группа – 81 больная с раком эндометрия, 4 группа – 66 больных с плоскоклеточными карциномами области головы и шеи. Дизайн исследования представлен на рис.1.

Стадии заболевания уточнялись по данным клинического и полного инструментального обследования в соответствии с международной классификацией TNM (2009) и FIGO (2009) для рака эндометрия. Подробная характеристика больных приведена в таблице 1.

 

Рис. 1. Дизайн исследования

Диагностика и лечение больных соответствовали рекомендуемым алгоритмам объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований, утвержденным министерством здравоохранения и социального развития РФ. Проведение данной работы одобрено этическим комитетом ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН.

Таблица 1

Клинико-морфологическая характеристика больных, включенных в исследование

параметры	Локализации
Рак почки	РМП	Рак эндометрия	ПКГШ
количество	65	54	81	66
средний возраст	58,0±1,4 лет	61,5±1,4 лет.	56,2±1,1 лет	57,1±1,7 лет
пол	мужчины - 38 человек, женщины - 27	мужчины - 45 человек, женщины - 9	-	Мужчины - 55 человек, женщины –11 человек
стадия	Т1-3N0-1M0 - 48 пациентов, Т2-4N0-1M1 - 17	Тпациентов, Т3 – 28	Iа - 58 больных, Ib – 10, II стадию – 13.	Т2-3Nчеловек, Т2-3N1 - 20, Т2-3N2 – 10.
гистологическая форма	светлоклеточ-ный почечно- клеточный рак	переходно-клеточный рак	эндомет-риоидный рак	плоскоклеточ-ный рак
степень дифференци-ровки	-	высоко-дифференци-рованные – 21, умеренно - 25 низко - 8	высоко-дифференци-рованный рак –15 больных, умеренно – 51, низко - 15	высокодиф-ференциро-ванный - 15 больных, умеренно - 42, низко -9
наличие метаболичес-кого синдрома	-	-	метаболический синдром – 49 пациенток, нет - 32
рецепторный статус	-	-	ER позитивные - 23, ER негатив-ные - 4. PR по-зитивные - 25, PR негативные -2	-

Всем больным раком почки в зависимости от размера опухоли было проведено хирургическое лечение, включающее в себя радикальную нефрэктомию или частичную резекцию почки.

Лечение больных РМП включало в себя проведение 2 курсов системной полихимиотерапии в неоадъювантном режиме по стандартной схеме MVAC. В последующем этим пациентам выполнялась трансуретральная резекция опухоли мочевого пузыря и еще 2 курса адъювантной химиотерапии по вышеуказанной схеме.

У больных РЭ на первом этапе выполнялось оперативное вмешательство в различных объемах, а в последующем проводилась лучевая терапия.

Все пациенты ПКГШ получали комбинированное лечение, включающее неоадъювантную химиолучевую терапию и последующее хирургическое иссечение опухоли. При наличии регионарных метастазов выполняли фасциально-футлярное иссечение шейной клетчатки, операцию Крайла.

Материалом исследования явились образцы опухолевой и гистологически неизмененной ткани, находящиеся на расстоянии не менее 2 см от границы опухолей, которые были получены при выполнении радикального оперативного вмешательства. Весь материал подвергался морфологическому исследованию и был гистологически верифицирован. Образцы тканей замораживались и хранились при -80оС.

Согласно поставленным задачам исследования была исследована активность протеасом и их пулов в тканях флуорометрическим методом по гидролизу олигопептида N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin и при наличии специфического ингибитора протеасом MG132 [Ben-Shahar. S., 1999].

Фракционирование протеасом осуществлялось методом высаливания [, 2004]. Активность кальпаинов определяли в гомогенатах тканей по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC с помощью специфического ингибитора N-ацетил-Leu-Leu-норлейцинал (Sigma, США) [Sandmann S., 2002].

Экспрессию α1α2α3α5α6α7, LMP7, LMP2, PA28β и Rpt6 субъединиц протеасом исследовали с помощью метода Вестерн блоттинг с последующей обработкой хемилюминесцентной системой детекции белков. Плотность полос была определена с помощью стандартной компьютерной программы «Image J». Результаты были стандартизированы по содержанию актина в пробе и выражали в процентах от содержания субъединиц протеасом в неизмененной ткани, где за 100% брали содержание субъединиц протеасом в неизмененной ткани.

Уровень продукции транскрипционных факторов HIF-1α, NF-kB (p50 и p65 форм) (Caymanchem, США), ростовых факторов ИФР-I, ИФР-II, их связывающих белков IGFBP3, IGFBP-4, ростового фактора VEGF и металлопротеиназы РАРР-А (R&D Systems, DSL, США) определяли с использованием наборов для твердофазного ИФА на ИФА-анализаторе «Anthos 2020». Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 6.0, SPSS 19.0. Результаты представлены как M – как медиана с интерквартильным размахом (25-й и 75-й процентили). Значимость различий исследовали с помощью критерия Манна-Уитни, при количестве сравниваемых групп более чем две – с помощью многомерного непараметрического дисперсионного анализа, рангового теста Краскела-Уоллиса и медианного теста. Корреляционный анализ был проведен с использованием непараметрического критерия Спирмена. Прогностическая значимость признаков в отношении общей, безрецидивной и безметастатической выживаемости оценивалась с использованием программы Survival Analysis Statistica 6.0. кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплан-Майера. Значимость различий в выживаемости между группами оценивалась по критерию Гехана-Вилкоксона и log-рангового критерия. При построении математических моделей для прогнозирования развития гематогенных и лимфогенных метастазов использовался дискриминантный анализ [, 2001; , 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака почки. Результаты проведенного исследования показали, что тотальная активность протеасом в опухоли почки уменьшалась в 3,4 раза, активность 26S и 20S протеасом – в 2,6 раза и 2,7 раза, соответственно по сравнению с неизмененной тканью (Табл. 2). Известно, что интенсивный протеолиз в ткани почки существует в физиологических условиях и связан с процессами деградации альбумина в проксимальных канальцах почки [Gidehithlu K. P., 2004]. При этом в исследованиях Macconi D. et al (2009) показано, что альбумин предварительно подвергается процессингу в протеасомах [Macconi D. et al, 2009]. При опухолевой трансформации происходит нарушение нормальной почечной функции, что ведет к значительному снижению протеасомной активности. Второй причиной этого эффекта при светлоклеточном раке почки, связанном с синдромом фон Хиппель-Линдау, является, вероятно, дефект Е3 лигазы, который способствует снижению активности протеасом в опухоли и связан с накоплением транскрипционного фактора HIF-1.

Сниженная активность протеасом и изменение их субстратной специфичности при раке почки было связано с наличием модифицированных форм протеасом (рис.2). Количество тотального пула протеасом в ткани опухоли было увеличено, о чем свидетельствует повышение экспрессии a1a2a3a5a6a7 субъединиц на 28% по сравнению с неизмененной тканью. Однако экспрессия иммунных субъединиц протеасом LMP2 и РА28b в их составе была низкой. Разница между уровнями продукции данных субъединиц в опухоли и прилежащей к ней нетрансформированной ткани составляли 30%, соответственно, в обоих случаях. Вероятно, активность пула 20S-протеасом была снижена вследствие уменьшения содержания PA28 активаторного комплекса, о чем свидетельствует низкая экспрессия частицы PA28β.

Таблица 2

Тотальная химотрипсинподобная активность протеасом, активность 26S, 20S пулов протеасом и активность кальпаинов в опухолях, Me (Q1-Q3)

локализация	Активность протеасом, ×103 Ед/мг белка	Активность кальпаинов, ×103 Ед/мг белка
Тотальная химотрипсин-подобная активность протеасом	Активность 26S пула	Активность 20Sпула
РП	неизмененная ткань	126,6 (63,8-187,0)	32,3 (17,6-87,0)	81,5 (46,0-154,8)	49,1 (31,3-78,7)
опухолевая ткань	36,9 (22,0-99,4)*	12,2 (7,3-25,8)*	29,8 (16,7-65,9)*	37,5 (18,6-74,0)*
РМП	неизмененная ткань	40,0 (21,0-60,0)	6,6 (3,7-10,8)	30,0 (17,2-50,1)	21,7 (8,5-24,0)
опухолевая ткань	50,0 (38,2-80,0)	16,7 (11,9-26,3)*	45,0 (24,2-60,5)	34,0 (21,5-51,9)*
РЭ	неизмененная ткань	43,8 (23,9-82,1)	18,3(7,4-37,0)	50,0 (22,5-79,2)	78,9 (4,6-121,0)
опухолевая ткань	105,0 (56,7-172,6)*	33,3 (22,4-56,8)*	68,8 (49,1-145,0)*	112,0 (41,7-232,0)
ПКГШ	неизмененная ткань	26,7 (16,0-55,9)	9,5 (5,0-20,0)	36,0 (16,0-65,0)	42,3 (31,8-100,0)
опухолевая ткань	59,9 (37,7-120,0)*	20,0 (13,9-38,3)*	45,0 (33,9-90,1)*	125,7 (67,0-256,0)*

Примечание: