Роль иммунной системы в патогенезе рака молочной железы при комбинированном лечении (стр. 2 )

Методика применения препарата рекомбинантного IL-1β беталейкина. Препарат беталейкин, созданный в НИИ ОЧБ (г. С-Петербург, Россия), вводили до начала предоперационной химиотерапии. Курс лечения состоял из 5 ежедневных капельных внутривенных инфузий в дозе 5 нг/кг массы тела пациента на 500 мл изотонического раствора натрия хлорида. Продолжительность инфузии варьировала от 60 до 180 мин.

Материалом для исследования состояния иммунной системы и генетических особенностей у больных РМЖ служила периферическая кровь, взятая утром натощак из локтевой вены. Состояние иммунной системы исследовали до начала противоопухолевого лечения, после завершения 2 курсов НАХТ, после 3-4 курсов НАХТ, через 10-12 дней после оперативного удаления первичного опухолевого узла, через 1 год после завершения противоопухолевого лечения. Генетические исследования осуществляли однократно.

Для оценки иммунологических показателей фракцию мононуклеарных клеток из периферической крови выделяли общепринятым методом наслаивания на градиент плотности фиколла и верографина (ρ=1,077) с последующим центрифугированием [Boyum A., 1968].

Определение фенотипа мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) осуществляли иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител к антигенам CD3, CD4, CD8, CD56, CD22, CD25, CD95, HLA-DR (Novocastra Lab Ltd, UK) [ и др., 2001].

Оценку апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови осуществляли методом суправитального окрашивания с использованием флюоресцентного красителя Hoechst 33342 – бисбензимида, обладающего свойством пермеабилизации клеточной мембраны и связывающегося с тимином или аденином ДНК [Zhang X. et al., 2001, Stridh H. et al., 2002]. Для индукции апоптоза клеток периферической крови in vitro использовали следующие агенты:

1)  моноклональные антитела к CD95, клон LOB3-17 (NovoCastra, Великобританиянг/мл, индуцирующие апоптоз по классическому Fas-FasL механизму [Stridh H. et al., 2002., и др., 2006.];

2)  моноклональные антитела к CD3, клон UCHT1 (NovoCastra, Великобритания) - 2,5 мкг/мл, обеспечивающие активацию Т-лимфоцитов при взаимодействии с TCR-рецептором и приводящие к активационному апоптозу [ и др., 2000];

3)  цитостатик вепезид (этопозид/VP-16-213, «Bristol-Myers Squibb», Италия) – 4,5 мкг/мл в физиологическом растворе, неспецифический апоптоген [ и др., 2005].

Спонтанную и стимулированную митогенами продукцию интерлейкинов (IL) 1, 2, 4, 10, фактора некроза опухоли-α (TNF-α), интерферона-γ (IFN-γ) МНПК исследовали с использованием наборов для иммуноферментного анализа (, Санкт-Петербург, Россия).

Пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови оценивали по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) [ и др., 1983, Levesque B. M. et al., 2000].

Функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов определяли в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) по их способности восстанавливать активные формы кислорода [ и др., 1999]. Содержание сывороточных факторов, находящихся в циркуляции, таких как иммуноглобулины классов M, A, G (IgM, IgA, IgG) и растворимые формы рецептора sFas (CD95) и его лиганда sFas-L исследовали с использованием наборов для иммуноферментного анализа (-Бест», Россия). Активность системы комплемента и уровень циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови определяли методом нефелометрии.

Выделение ДНК осуществляли стандартным методом фенол-хлороформным экстракции. Анализ полиморфных вариантов специфических участков генома проводили с использованием методов полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, используя специфическую структуру праймеров и соответствующие ферменты рестрикции (таблица 2).

Таблица 2 – Структура праймеров и ферменты рестрикции для анализа полиморфных вариантов генов цитокинов и белка-онкосупрессора ТР53

Ген	Полиморфизм	Структура праймеров	Фермент рестрикции
IL-4	590CT	5’-actaggcctcacctgatacg-3’ 5’-gttgtaatgcagtcctcctg-3’	Bsm FI
IL-10	592CA	5’- atccaagacaacactactaa -3’ 5’- taaatatcctcaaagttcc -3’	Rsa I
TNFA	308AG 863АС 238АG	5’-agg-caa-tag-gtt-ttg-agg-gcc-at-3’ 5’-aca-ctc-ccc-atc-ctc-ccg-gct-3’	Bsp19I BstBAI Msp I
IL-1β	-31CT	F: аgaagcttccaccaatactc R: agcacctagttgtaaggaag	AluI
+3954CT	F: ctcaggtgtcctcgaagaaatcaaa R: gcttttttgctgtgagtcccg	TaqI
TGFβ1	509CT	F: cagtaaatgtatggggtcgcag R: ggtgtcagtgggaggaggg	Bsu36I Eco81I
CCR5	CCR5del32	5’-aaggtcttcattacacctg-3’ 5’-agaattcctggaaggtgttc-3’
p53	G199C	ctggtaaggacaagggttgg actgaccgtgcaagtcacag	BstFN I
GAPDH		F: aggctggggctcatttgcagg R: tagccaaattcgttgtcataccag
Примечание: F – прямой праймер, R – обратный праймер, С, А и G – аллель-специфические праймеры

Продукты амплификации подвергали рестрикции соответствующими эндонуклеазами (таблица 2). Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл бромида этидия и визуализировали в УФ-свете при помощи УФ-трансиллюминатора «Vilber Lourmat» (Франция).

Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике. Для исследования экспрессии рецепторов эстрогенов на опухолевых клетках использовали антитела фирмы «Dako» (клон 1D51, готовые к применению, мышиные), рецепторов прогестерона (клон PgR6311, готовые к применению, мышиные), онкопротеина c-erbB-2(кроличьи), Ki67 (клон MIB-1, мышиные) и для белка-онкосупрессора ТР53 применяли антитела фирмы “NovoCastra” (клон CM1). Экспрессию рецепторов к онкопротеину c-erbB, TP53, Ki67 оценивали в процентном содержании положительно окрашенных клеток в паренхиматозном компоненте первичной опухоли. Экспрессию рецепторов к половым

гормонам оценивали по 3-балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени).

Тип адаптационной реакции определи по процентному содержанию лимфоцитов в лейкоцитарной формуле и их отношению к содержанию сегментоядерных нейтрофилов [ и др., 1998].

Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Statistica» (версия 6.1, серия 1203d, StatSoft Inc.) и «NovoSpark® Visualizer 2.1» (Канада). Для проверки законов распределения исследуемых переменных на нормальность использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Для оценки значимости различий выборок использовали непараметрические критерии Манна-Уитни, Вилкоксона, Краскала-Уоллеса. Различия считали значимыми при р<0,05. При проведении попарного сравнения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов, а также частоты встречаемости прочих изучаемых признаков в анализируемых группах использовали критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность и/или точный критерий Фишера. С целью исследования основных факторов, организующих морфофункциональную структуру иммунной системы у больных РМЖ на этапах проведения противоопухолевого лечения, был применен факторный анализ [ 1980, , 1998]. Для классификации и описания состояния иммунной системы у больных РМЖ с различным клиническим течением был использован метод дискриминантного анализа.

Принцип метода визуализации многомерных данных. В проведенном исследовании состояние иммунной системы, характеризуемое большим количеством показателей, у каждой пациентки, было рассмотрено как многомерное измерение. Для такого представления был использован метод визуализации многомерных данных NovoSpark Corporation (Канада). Визуализация состояния биосистемы, как единого целого, предполагает отображение совокупности всех показателей, описывающих состояние системы, в одном «интегральном» образе [ и др., 2011].

Рассматриваемый метод визуализации многомерных объектов и процессов основан на изометричности двух пространств, где объекты одного пространства (пространства данных) считаются оригиналами, в то время как объекты другого играют роль изображений. Основой выявления сходства или различия в оригинальных данных

является визуальная близость соответствующих этим данным образов, выражаемая в расстоянии Махалонобиса [Eidenzon D. et al. http://www. *****].

Одной из важных функций программы NovoSpark является выбор информативных показателей, который сводится к получению визуально различимых образов (форма кривой) и/или визуально непересекающихся образов, упорядоченных по величине расстояния оригиналов от выбранной точки отсчета, например, многомерного центра координат или многомерного среднего контрольного набора данных. С точки зрения визуализации идентификация закономерностей многомерных измерений тесно связана с выбором информативных показателей и приводит к результатам, достигаемым при использовании количественных методов [Eidenzon D. V., Volovodenko V. A., 2009].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Дискуссия о роли иммунной системы в противоопухолевой защите организма длится уже более ста лет. В настоящее время существуют концепции, отрицающие какое-либо значение иммунологических механизмов в противоопухолевой защите организма [, , 2004, , 2000]. Ряд авторов отводит иммунной системе определенную роль в контроле ограниченного ряда злокачественных новообразований, таких как опухоли лимфатической системы [Klein G., 2009]. Наиболее адекватной и аргументированной представляется концепция иммунологического редактирования опухолевого роста, рассматривающая роль иммунной системы как амбивалентную и зависящую от фазы взаимодействия «опухоль – иммунная система» [ и др., 2008, Swann J. B., Smyth M. J., 2007, Nicolini A., Carpi A., 2009].

Обоснованием для концепции иммунологического редактирования опухолевого роста являются накопленные к настоящему времени многочисленные экспериментальные и клинические данные. Одни из источников указывают на существование иммунологических механизмов элиминации злокачественных клеток и сдерживание опухолевого роста при уже возникшем процессе [, , 2005, и др., 2008]. Другие авторы приводят факты содействия опухолевой прогрессии [Curiel T. J., 2007 T. J., 2007, Ben-Baruch A., 2003, Luboshits G. et al., 1999]. Несмотря на достигнутый концептуальный компромисс в теории иммунологического редактирования злокачественного роста, остается нерешенной главная проблема: признавая двойственное участие механизмов иммунной системы в возникновении и развитии опухолевого процесса, необходимо выяснить патогенетические особенности, отличающие стратегию иммунной системы, направленную на сдерживание злокачественного роста, от стратегии, содействующей опухолевой прогрессии. Важно понять, как эти отличия реализуются у конкретного больного на различных этапах противоопухолевого лечения и динамического наблюдения.

Исследование системного уровня функционирования иммунной системы у больных РМЖ с разным клиническим течением заболевания. Накопленный к настоящему времени феноменологический материал о взаимосвязи отдельных иммунологических показателей с клинико-морфологическими параметрами опухолевого процесса, эффективностью лечения и прогнозом не дает однозначного ответа на поставленные выше вопросы. Одной из причин такой неоднозначности, на наш взгляд, является тот факт, что в подавляющем большинстве исследований не учитывается системный принцип организации и функционирования иммунной системы. Согласно системному подходу, существенными для живой системы являются свойства целого, которыми не обладает ни одна из его частей. Новые свойства системы возникают из взаимосвязей между частями. При системном подходе свойства отдельных элементов могут быть выведены только из организации целого [ 2002]. Таким образом, для адекватной интерпретации выявленных отличий на уровне отдельных показателей необходима их интегрированность в контекст функционирования целой системы, а, в идеале, всего живого организма [ и др., 1996].

Возможность и необходимость системного подхода в изучении иммунной системы высказывается в работах [, , 1997, и др., 2002, 2003, Li Y. et al., 2008., Genser B., 2007]. В нашей работе для решения данной проблемы – исследования состояния иммунной системы как единого комплекса взаимосвязанных одновременно протекающих событий – был применен разработанный компанией NovoSpark (Канада) метод визуализации многомерных данных [Eidenzon D. V., Volovodenko V. A., 2009].

Состояние иммунной системы, охарактеризованное путем оценки 55 показателей, было принято за многомерное измерение и представлено в виде двумерной кривой. Основой выявления сходства или различия в оригинальных данных является близость соответствующих этим данным образов, измеряемая расстоянием Махаланобиса, а также схожесть кривых по форме. Если два наблюдения характеризуются близкими по значениям наборами иммунологических показателей, то отражающие эти состояния кривые по форме похожи друг на друга и располагаются в близких областях условного пространства многомерных признаков. Если наблюдения отличаются, то и кривые будут различны [ и др., 2011].

Для оценки взаимосвязи состояния иммунной системы, как интегрированного целого, с характером течения РМЖ, из 198 пациенток в зависимости от наступившего исхода были сформированы следующие подгруппы: больные РМЖ, пережившие 3 года и более от момента установления диагноза без признаков прогрессирования заболевания (n=31), пациентки с развившимися в эти сроки гематогенными метастазами (n=35), с местными рецидивами (n=5) и одновременным метастазированием и рецидивированием (n=4). Выделенные подгруппы были равноценны по частоте встречаемости основных клинико-морфологических факторов прогноза, объему и схемам проведенного противоопухолевого лечения, т. е. тех параметров, которые патогенетически значимы для опухолевой прогрессии и вносят существенный вклад в исход заболевания (критерии сравнения Фишера и χ2). Равноценное присутствие, обеспечивающее, следовательно, и одинаковое влияние данных факторов в группах пациенток с различным исходом, предоставило нам возможность оценить взаимосвязь течения РМЖ именно с особенностями состояния иммунной системы.

Оценка состояния иммунной системы как целостной системы выявила статистически значимые различия у больных РМЖ без прогрессирования заболевания в течение 3-х лет с момента установления диагноза по сравнению с пациентками, у которых в эти сроки отмечено развитие гематогенных метастазов (рисунок 1). Указанные различия представлены расположением визуальных образов состояния иммунной системы, характерных для данных групп, в непересекающихся областях условного пространства многомерных признаков. Оказалось, что различия в состоянии иммунной системы в группах с разным течением РМЖ наблюдались также на этапах его проведения и последующего динамического наблюдения (рисунок 1).

Следует отметить, что у больных с развившимися местными рецидивами и одновременным рецидивированием и метастазированием в отдаленные органы, несмотря на малую численность выборки, состояние иммунной системы также имело отличия, нашедшие выражение в различной форме кривых визуализации.

Таким образом, выявленные различия в расположении визуальных образов, отражающих системный уровень функционирования иммунной системы у больных РМЖ с признаками прогрессирования заболевания и без таковых, свидетельствует о важном вкладе иммунной системы в определение исхода РМЖ и о вовлечении иммунологических механизмов в патогенез данного заболевания.

Механизмы, лежащие в основе про - и противоопухолевой стратегии иммунной системы у больных РМЖ. Применение метода визуализации, помимо констатации качественных различий в состоянии иммунной системы у больных РМЖ, ассоциированных с характером клинического течения заболевания, позволило выявить параметры и связанные с ними механизмы, определяющие отмеченную дискриминацию стратегии иммунной системы (таблица 3). Этот комплекс показателей послужил основой для построения классификационных дискриминантных уравнений, описывающих состояние иммунной системы у больных РМЖ на каждом из этапов противоопухолевого лечения в двух вариантах: как ассоциированного с длительной клинической ремиссией или как сопряженного с прогрессированием – гематогенным метастазированием – в течение 3-х лет с момента установления диагноза.

По величине коэффициента, стоящего перед переменной в дискриминантных уравнениях, возможно судить, насколько значим данный иммунологический показатель и связанный с ним механизм для различения состояния иммунной системы, как

АБВГ

Д

Рисунок 1 - Области расположения визуальных образов, соответствующих состоянию иммунной системы, как интегрированного целого, у больных РМЖ без прогрессирования заболевания более 3-х лет (темно-серый цвет) и у пациенток с развившимся гематогенным метастазированием (светло-серый цвет); А – до начала противоопухолевого лечения, Б – 2 курса НАХТ, В – 3-4 курса НАХТ, Г – после операции, Д – через 1 год после специфического лечения

Таблица 3 – Параметры, определяющие статистически значимые различия в состоянии иммунной системы у больных РМЖ без прогрессирования и с развившимися гематогенными метастазами в течение 3-х лет

До начала лечения	После 2 курсов НАХТ	После 3-4 курсов НАХТ	После операции	1 год после лечения
CD4/ CD8	CD4/ CD8	CD4/ CD8	активность нейтрофилов, %	CD4/ CD8
Ig M, г/л	активность нейтрофилов, %	Ig A, г/л	Ig A, г/л	активность нейтрофилов, %
CD8+клетки,%	Ig M, г/л	CD8+клетки,%	активность нейтрофилов, у. е.	активность нейтрофилов, у. е.
Ig A, г/л	активность нейтрофилов, у. е.	активность нейтрофилов, у. е.	CD4/ CD8	CD8+клетки,%
Ig G, г/л	Ig A, г/л	CD25+клетки,%	Ig M, г/л	Ig M, г/л
CD4+клетки,%	CD4+клетки,%	CD56+клетки,%	CD3+клетки,%	CD4+клетки,%
CD22+клетки,%	CD56+клетки,%	CD22+клетки,%	Ig G, г/л	CD25+клетки,%
резерв нейтрофилов, %	резерв нейтрофилов, %	CD4+клетки,%	резерв нейтрофилов, %	Ig A, г/л
CD56+клетки,%	CD3+клетки,%	апоптоз, %	CD4+клетки,%	CD3+клетки,%
CD95+клетки,%	Ig G, г/л	CD95+клетки,%	CD22+клетки,%	CD95+клетки,%
ЦИК	CD22+клетки,%	ЦИК	CD8+клетки,%	Ig G, г/л
резерв нейтрофилов, у. е.	CD95+клетки,%		резерв нейтрофилов, у. е.	резерв нейтрофилов, %
активность нейтрофилов, %	ИС ФГА			CD22+клетки,%
IL1-βlps, пг/мл	резерв нейтрофилов, у. е.			ЦИК
IL1-β, пг/мл	CD25+клетки,%			резерв нейтрофилов, у. е.
активность нейтрофилов, у. е.	апоптоз, %			CD56+клетки,%
TNF-α, пг/мл	CD8+клетки,%			РБТЛ с ФГА
	Комплемент, у.е
	ЦИК
	РБТЛ
	РБТЛ с ФГА
Примечание: Параметры иммунной системы представлены в убывающем порядке, соответствующем величине связанных с ними коэффициентов дискриминантных уравнений

интегрированного целого, на определенном этапе исследования [, 1998]. Так, до начала противоопухолевого лечения статистическую значимость различий определяло вовлечение практически всех звеньев адаптивного и врожденного иммунитета (таблица 3). Наиболее важное значение имело состояние Т-клеточного звена, с которым связывают реализацию противоопухолевой активности [Hornychova H. et al., 2008, Schirrmacher V. et al., 2002]. Об этом свидетельствовал максимальный коэффициент, стоящий перед показателем иммунорегуляторного индекса CD4/CD8.