Роль иммунной системы в патогенезе рака молочной железы при комбинированном лечении (стр. 3 )

После проведения 2 курсов НАХТ состояние Т-клеточного иммунитета сохраняло ведущее значение для дискриминации про - и противоопухолевой стратегии иммунной системы. Об этом говорили высокие значения коэффициентов перед показателями иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 и процентным количеством CD4+клеток (таблица 3). Однако возрос вклад функциональной активности нейтрофилов, а также гуморального иммунитета (IgA, IgM). Поскольку известно, что форменные элементы системы кроветворения оказываются мишенями цитостатического лечения, то закономерно, что после 2 курсов НАХТ значение для дискриминации в стратегическом направлении функционирования иммунной системы у больных РМЖ приобрела пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови, связанная, вероятно, с механизмом компенсации клеточных потерь (таблица 3). Очевидно, что наличие пролиферативного ресурса у клеток периферической крови может создать преимущество при апоптоз-индуцирующих воздействиях со стороны опухоли и противоопухолевого лечения, обеспечивать более полноценный режим функционирования иммунной системы, который, в свою очередь, способствует увеличению длительности периода без прогрессирования РМЖ.

После завершения НАХТ (3-4 курса) важной чертой, отличающей состояние иммунной системы у больных с различным клиническим течением РМЖ, выступает появление такого показателя, как количество клеток периферической крови с морфологическими признаками апоптоза (таблица 3). Если на этапе 2 курсов НАХТ одним из критических механизмов, определяющих стратегию иммунной системы, был пролиферативный потенциал лимфоцитов, то при продолжении цитостатического лечения

(более 2 курсов) значение приобрела непосредственно клеточная гибель.

Данные дискриминатного анализа, касающиеся особенностей состояния иммунной системы у больных РМЖ при проведении НАХТ, нашли подтверждение в экспериментах in vitro по изучению чувствительности мононуклеарных клеток крови у больных РМЖ к апоптоз-индуцирующим воздействиям различной природы. В качестве индукторов апоптоза использовали моноклональные антитела к CD95 (Fas-зависимый апоптоз), CD3 (активационный апоптоз), цитостатик вепезид (апоптоз, связанный с клеточным стрессом). Уровень апоптоза в 24-часовой культуре клеток зависел от этапа противоопухолевого лечения. Для больных, состояние которых характеризовалось длительной клинической ремиссией, максимальные значения клеточной гибели отмечены на этапе НАХТ, для пациенток с развившимся впоследствии прогрессированием РМЖ – после завершения лечения. Однако наиболее выраженным отличием группы больных без прогрессирования заболевания являлось высокое количество клеток после инкубации in vitro в течение 24 часов. Данный показатель в большинстве случаев находился на уровне пассажа (1х106 клеток/мл) и выше, в то время как у пациенток с неблагоприятным исходом количество клеток в культуре после инкубации снижалось. Отмеченный факт, на наш взгляд, связан с достаточной пролиферативной активностью лимфоцитов и моноцитов, восполнявшей количественные потери в результате клеточной гибели.

После оперативного удаления первичного опухолевого узла в формирование генеральной стратегии, реализуемой иммунной системой, максимальный вклад вносили показатели спонтанной активности нейтрофилов и уровень иммуноглобулина А в сыворотке крови больных (таблица 3). У пациенток, чье состояние иммунной системы было классифицировано как неблагоприятное, выраженное значение для дискриминации имели показатели иммунорегуляторного индекса.

После завершения противоопухолевого лечения (через 1 год) генеральная стратегия иммунной системы вновь была связана с показателями основных звеньев: Т-клеточного ответа (CD4+, CD8+, CD4/CD8), гуморального ответа (IgM), спонтанной активности нейтрофилов (таблица 3). Одним из важных параметров, вносящих вклад в дискриминацию про - и противоопухолевой стратегии иммунной системы на этапе динамического наблюдения, является количество CD25+клеток периферической крови (таблица 3). С одной стороны, этот показатель отражает уровень активации иммунной системы и может указывать на продолжающийся, но клинически не манифестируемый опухолевый рост или метастазирование. С другой стороны, увеличение CD25+клеток может свидетельствовать о циркуляции Т-регуляторных клеток – эффекторов одного из наиболее значимых механизмов иммуносупрессии, способствующих опухолевой прогрессии [ и др., 2006, , 2006, и др., 2010, Gobert M. et al., 2009].

Таким образом, несмотря на то, что в реализацию противоопухолевой или опухолестимулирующей стратегии иммунной системы вовлечены фактически все ее звенья, в зависимости от этапа лечения комплекс данных параметров и ведущие механизмы реализации функциональной направленности претерпевали изменения.

Одним из ведущих принципов организации системы, в том числе и иммунной, является взаимосвязь отдельных морфологических и функциональных элементов, создающая обладающее новыми свойствами целое [ 2002]. Методом исследования внутренних взаимосвязей, организующих систему, был выбран факторный анализ [, 1998]. Основная цель факторного анализа заключается в том, чтобы обнаружить скрытые общие факторы, объясняющие связи между наблюдаемыми признаками (параметрами) объекта. Выделяемые факторы являются гипотетическими, однако их смысл связан с определенным вектором функционирования иммунной системы.

До начала противоопухолевого лечения наиболее значимые векторы в структуре морфофункциональной организации иммунной системы у больных РМЖ отражали состояние Т-клеточного звена, его функциональную активность, уровень активации, механизмы обеспечения количественного гомеостаза (таблица 4). Функциональная активность нейтрофилов также была представлена в структуре иммунных процессов у пациенток с РМЖ на этапе установления диагноза.

Для пациенток из группы длительной клинической ремиссии после 2 курсов НАХТ функциональная активность нейтрофилов была тесно связана с показателями гуморального иммунитета (ЦИК, IgM, IgA) и механизмами индукции апоптоза (число клеток, несущих на своей мембране Fas-лиганд). Вероятно, наличие подобной функциональной взаимосвязи обусловлено вовлечением цитотоксических механизмов иммунной системы в деструкцию злокачественных клеток после цитостатического воздействия химиотерапевтических агентов [Zitvogel L. et al., 2008] и последующей необходимостью их утилизации (фагоцитозом, опсонизацией, агглютинацией, преципитацией). У больных с прогрессированием РМЖ такого вектора отмечено не было. Специфические особенности структуры иммунологических параметров у пациенток этой группы проявились в присутствии особой функциональной единицы, связывающей показатели содержания иммуноглобулинов классов G, M, A, что является подтверждением литературных сведений о содействии гуморального ответа опухолевой прогрессии [ и др., 2008, Tan T. T., Coussens L. M., 2007]. Подобная структура организации внутренних процессов функционирования иммунной системы у больных РМЖ с различным характером клинического течения сохранялась и при продолжении НАХТ – 3-4 курса (таблица 4).

На этапе хирургического лечения у больных РМЖ с благоприятным клиническим течением наиболее значимое место в структуре внутренних взаимосвязей занимали

Таблица 4 – Структура морфофункциональной организации иммунной системы у больных РМЖ на этапах противоопухолевого лечения

этап лечения	Вектор I	Вектор II	Вектор III
без прогрессирования	метастазы	без прогрессирования	метастазы	без прогрессирования	метастазы
до лечения	CD 95+ CD8+ CD4+	CD4+ CD22+ CD8+ CD25+ CD56+	Уровень пролиферации лимфоцитов CD56+ CD22+	Резерв нейтрофилов Уровень пролиферации лимфоцитов ЦИК	Резерв нейтрофилов ИС ФГА	CD95+ Ig G CD56+
НАХТ	Спонтанная активность нейтрофилов ЦИК Ig M	Спонтанная активность нейтрофилов	CD4+ CD4/CD8	CD4/CD8 CD4+	Ig A Fas-L+ Спонтанная активность нейтрофилов	Ig A Ig G Ig M
операция	Уровень пролиферации лимфоцитов HLA-DR+	HLA-DR+ Уровень пролиферации лимфоцитов	Резерв нейтрофилов Fas-L+	ЦИК Fas-L+	Уровень пролиферации лимфоцитов с ФГА	Уровень пролиферации лимфоцитов с ЛПС Резерв нейтрофилов
1 год после лечения	Спонтанная активность нейтрофилов Резерв нейтрофилов	Спонтанная активность нейтрофилов	Ig A Ig G Ig M	Апоптоз Резерв нейтрофилов CD4/CD8	Апоптоз	Резерв нейтрофилов Ig A Ig G

механизмы, ассоциированные с пролиферативной активностью лимфоцитов периферической крови (таблица 4). Отдельный фактор у больных РМЖ характеризовал клеточную цитотоксичность: количество клеток крови, несущих Fas-лиганд на поверхности и способных индуцировать апоптоз иммунокомпетентных клеток, и функциональный резерв нейтрофилов, также обладающих выраженным цитотоксическим потенциалом [Di Carlo E., 2001]. У пациенток с неблагоприятным течением РМЖ отмечена отрицательная взаимосвязь количества Fas-L+ мононуклеарных клеток периферической крови с их пролиферативной активностью, которая может отражать проявление иммуносупрессии, индуцированной операционным стрессом, что в последующем находит реализацию в прогрессировании заболевания [Baltrush H. J. et al., 1991, Pant S., Ramaswamy B., 2009].

Для пациенток с благоприятным течением заболевания через 1 год после завершения противоопухолевого лечения была характерна обособленность различных звеньев системы иммунитета в отдельные функциональные векторы (нейтрофилы в I вектор, гуморальный ответ во II, апоптоз в III). Для больных РМЖ с последующим прогрессированием было отмечено объединение в один фактор параметров, характеризующих различные морфофункциональные звенья (таблица 4).

Обобщая результаты факторного анализа, следует заключить, что при исследовании механизмов, организующих функционирование иммунной системы у больных РМЖ, как до начала лечения, так и при его проведении и спустя год после завершения, ведущее место занимает активность Т-клеточного звена. Проведение НАХТ ассоциировано с увеличением влияния процессов пролиферации, апоптоза и утилизации циркулирующих антигенов в структуре внутрисистемной организации. Основным отличием организации функционирования иммунной системы у больных РМЖ, характеризующихся благоприятным течением заболевания, является выраженный вектор цитотоксических эффекторных реакций. Неблагоприятное течение РМЖ связано с активностью гуморального звена при проведении противоопухолевого лечения.

Таким образом, мы показали, что состояние иммунной системы у больных РМЖ характеризуется вариативностью, которая связана с различным характером клинического течения заболевания, определяющим сроки наступления прогрессирования. Отмеченные различия наблюдаются на системном уровне функционирования иммунной системы, реализуются через определенные взаимосвязи морфофункциональных звеньев системы, могут быть связаны с конкретными молекулярно-клеточными механизмами, создающими преимущество или дефицит жизнеобеспечения организма больной в условиях злокачественного роста и противоопухолевого лечения. Очевиден вопрос: в результате чего формируется та или иная стратегия иммунной системы, ассоциированная с клиническим течением заболевания и его исходом?

Механизмы, формирующие стратегическую направленность функционирования иммунной системы у больных РМЖ при проведении противоопухолевого лечения. Для решения поставленного вопроса нами было предпринято исследование влияния значительного числа факторов, отражающих индивидуальные особенности организма, клинико-морфологические и молекулярные характеристики опухолевого процесса, объем и схему проведенного противоопухолевого лечения (таблица 5) на дисперсию иммунологических показателей, важных для дискриминации состояния иммунной системы. По сути, необходимо выявить, какие факторы значимо определяют изменения иммунологических показателей в группах с различным исходом.

Нами было отмечено, что вариабельность состояния иммунной системы у больных РМЖ обеспечивается влиянием как организма, так и опухоли. До начала лечения и через 1 год после его завершения доминирует влияние особенностей организма (доля иммунологических показателей, зависевших от параметров организма 71 % и 65 % соответственно), в процессе лечения – характеристики опухолевого процесса (55 % после завершения НАХТ). Влияние проведенного лечения на состояние иммунной системы у

Таблица 5 – Факторы, включенные в исследование дисперсии показателей иммунной системы у больных РМЖ

Факторы, отражающие опухолевый процесс	Факторы, отражающие особенности организма	Факторы, отражающие параметры лечения
- стадия - размер первичного узла - распространенность процесса - клиническая форма - гистологический тип - фоновая патология - степень злокачественности - чувствительность к цитостатикам - рецепторы прогестерона - рецепторы эстрогенов - HER2/neu - Ki67+клетки опухоли - ТР53+клетки опухоли	- возраст - менструальный статус - адаптационный статус до лечения - адаптационный статус на этапе лечения - сторона поражения - локализация - наличие ИПС - аутоиммунный ИПС - аллергический ИПС - инфекционный комбинированный ИПС - инфекционно - - гуморальный ИПС - инфекционно-клеточный ИПС - онкологическая наследственная отягощенность - наследственная отягощенность РМЖ - полиморфизм генов: р53 CCR5del32 IL-1β (-31)C/T IL-1β(+3954)C/T TNFα 308G/A TNFα 238G/A TNFα 863G/A ILC/A IL-4 590 C/T TGFβ 509 C/T TGFβ 29 C/T	- проведение НАХТ - эффективность НАХТ - схема НАХТ - количество курсов НАХТ - предоперационная ЛТ - вид операции - проведение ИОЛТ - проведение АЛТ - проведение АХТ - схема АХТ - количество курсов АХТ - проведение ГТ

пациенток сохраняется после его завершения (65 % показателей иммунной системы).

Исследование комплекса иммунологических параметров-откликов при воздействии факторов дисперсии показало их структурную схожесть с векторами внутренней организации функционирования иммунной системы, выявленную при помощи факторного анализа. Формирование той или иной взаимосвязи различных звеньев и эффекторов иммунной системы в единый функциональный механизм может быть

обусловлено конкретными особенностями организма, опухолевого процесса или проведенного лечения, составляющими фактическую природу гипотетических векторов внутренней организации иммунной системы (таблица 6).

Сторона поражения опухолью являлась наиболее часто встречаемым фактором при исследовании дисперсии иммунологических показателей до начала противоопухолевого

Таблица 6 – Соответствие факторов, влияющих на вариабельность состояния иммунной системы, с векторами ее морфофункциональной организации

Этап наблюдения	Факторы вариабельности состояния (дисперсионный анализ)	Векторы внутрисистемной организации (факторный анализ)
до лечения	сторона поражения: CD4+, CD8+ клетки, активность нейтрофилов, продукция IL-1β	I вектор: функциональная активность МНПК CD4+, CD8+, CD25+, CD56+, CD95+, CD22+, HLA-DR+ клетки
2 курса НАХТ	биологические свойства опухоли (рецепторный статус, Ki67, TP53, степень злокачественности): IgG, IgA, IgM	III вектор: гуморальный ответ IgG, IgA, IgM
3-4 курса НАХТ	НАХТ (эффективность, лекарственный патоморфоз опухоли): IgG, IgA, ЦИК	III вектор: гуморальный ответ IgG, IgA, ЦИК
клинические параметры опухолевого процесса (стадия, размер первичного узла, клиническая форма):CD4/CD8, ЦИК	III вектор: CD4/CD8 + ЦИК
операция	НАХТ (эффективность, лекарственный патоморфоз опухоли): функциональный резерв нейтрофилов, ЦИК	II вектор: функциональный резерв нейтрофилов + FAS-L+
1 год после лечения	наличие ИПС: активность нейтрофилов, ЦИК	I вектор: активность нейтрофилов + ЦИК
генетический полиморфизм (IL-1β(-31)CT, CCR5del32): функциональный резерв нейтрофилов, CD4/CD8	II вектор: функциональный резерв нейтрофилов, CD4/CD8, апоптоз
предоперационная ЛТ: функциональный резерв нейтрофилов, IgA	III вектор: функциональный резерв нейтрофилов + IgA
цитостатическое лечение (АХТ, ЛТ): активность нейтрофилов	I вектор: активность нейтрофилов
биологические свойства опухоли (рецепторный статус, Ki67, TP53, степень злокачественности): IgA, IgG	II вектор: гуморальный ответ IgA, IgG, IgM, ЦИК
Примечание - жирным шрифтом выделены иммунологические показатели у больных РМЖ, общие для структуры факторов дисперсионного анализа и векторов внутрисистемной организации

лечения. Совокупность иммунологических показателей, для которых отмечена дисперсия значений в сочетании с параметром «сторона поражения», в определенной мере (CD8+клетки, CD4+клетки) совпадает со структурой I вектора, связанного с функциональной активностью иммунной системы (таблицы 4, 6). Можно предположить, что уровень функциональности иммунной системы связан со стороной расположения опухоли и подчеркивает важность регуляторной асимметрии организма [, 1998].

Проведение 2 курсов НАХТ вызвало значительное увеличение как числа факторов, вызывающих дисперсию, так и количества самих иммунологических показателей, демонстрировавших вариативность своих значений. Наибольшим влиянием обладали параметры, отражавшие биологические свойства злокачественных клеток, такие как экспрессия рецепторов половых гормонов, факторов роста HER2/neu, пролиферативный потенциал (экспрессия Ki67), экспрессия мутантного белка р53, степень злокачественности опухоли. Комплекс иммунологических показателей, значения которых варьировали под влиянием биологических свойств опухоли, близок к вектору, ассоциированному с гуморальным ответом у больных с неблагоприятным течением РМЖ (таблицы 4, 6). Следовательно, вектор действия гуморального ответа определяется биологическими свойствами злокачественных клеток.

На этапе завершения НАХТ выделялись три группы факторов, значимо влияющие на вариативность состояния системы иммунитета. Наиболее выраженное воздействие оказывали факторы нормальной генетической изменчивости: полиморфизм генов цитокинов IL-1β (-31)CT, TGF-β 509СТ, TNF-α 863СA и факт наличия среди кровных родственников больных со злокачественными новообразованиями. Вторая группа связана с эффективностью НАХТ, оцененной как клинически, по уменьшению размера опухолевого узла, так и морфологически – по степени лекарственного патоморфоза опухолевых клеток. Третья группа параметров, влияющая на вариабельность иммунного статуса, отражала клинические характеристики опухолевого процесса – стадию, размер первичного узла, клиническую форму заболевания. Состав показателей, ассоциированный со второй и третьей группой параметров, имеет сходство с III вектором, организующим функционирование иммунной системы у больных с неблагоприятным и благоприятным течением РМЖ соответственно после 3-4 курсов НАХТ (таблица 6).

Параметры эффективности НАХТ оказывали преобладающее влияние на вариабельность состояния иммунной системы у больных РМЖ после оперативного удаления злокачественного узла. Показатели, подвергавшиеся дисперсии при воздействии НАХТ (активность нейтрофилов в НСТ-тесте), соотносимы со II вектором морфофункциональной организации иммунной системы у больных с благоприятным течением РМЖ, отмеченным на послеоперационном этапе. Данный вектор был связан нами с механизмами цитотоксичности, к проявлению которой наряду с молекулой Fas-L+ способны нейтрофилы (таблицы 4, 6).

Через 1 год после завершения противоопухолевого лечения наследственные особенности организма оказались ведущим комплексом параметров, влияющих на разнообразие статуса иммунной системы. Определяемая ими функциональная взаимосвязь эффекторов иммунной системы имеет сходство с такими векторами, как «активность нейтрофилов» и «апоптоз» (таблицы 4, 6). Кроме этого, функциональная активность нейтрофилов связана с влиянием цитостатического лечения (НАХТ, лучевая терапия) и наличием ИПС. Биологические свойства опухолевых клеток определяли гуморальный ответ больных РМЖ (таблица 6).

Выявление причины формирования патогенетически неблагоприятного вектора реагирования иммунной системы, с одной стороны, позволит формировать группы повышенного риска раннего прогрессирования. С другой стороны, при возможной коррекции неблагоприятного варианта действующего фактора предоставляется возможность манипулировать иммунной системой и влиять на клиническое течение заболевания.

Влияние генетических факторов на состояние иммунной системы у больных РМЖ в динамике противоопухолевого лечения. В последнее время большое внимание в качестве перспективных критериев для формирования групп повышенного онкологического риска, прогнозирования клинического течения и эффективности лечения злокачественных новообразований привлекают генетические маркеры [, 2009]. Генетические нарушения играют важную роль в этиологии и патогенезе РМЖ. Известны наследственные формы РМЖ, связанные с мутациями высокопенетрантных генов BRCA [ и др., 2007, Ford D. et al., 1998]. Особое место в картине нарушений при РМЖ занимают повреждения гена белка-онкосупрессора p53, который играет ключевую роль в ответе клетки на различные повреждения [Vogelstein B. et al., 2000]. Одним из возможных механизмов реализации генетической предрасположенности к злокачественным новообразованиям могут служить морфологические и функциональные особенности иммунной системы. При этом регуляторы иммунных процессов – цитокины – занимают важное место в модуляции состояния иммунной системы. В свою очередь, биологический эффект конкретного цитокина определяется уровнем его продукции и взаимодействия с рецептором-мишенью. Концентрация регуляторного белка зависит от аллельных вариантов гена, которые определяют высокую или низкую экспрессию.

С целью исследования патогенетически значимых генов в прогрессии РМЖ нами был предпринят анализ 3-летней безрецидивной выживаемости у 382 больных РМЖ (T1-4N0-3M0) в зависимости от аллельных вариантов генов цитокинов, а также гена р53. Исследованы следующие полиморфизмы IL-1b(-31)C/T, IL-1(+3954)C/T, IL-4 590 C/T, ILCA, TGF-b 509 C/T, TGF-b 29 T/С, TNF 308 G/A, TNF 308 G/A, TNF863CA, CCR5del32, p53Arg72Pro. Полиморфизм 2 генов цитокинов IL-10 и TGF-β оказывал влияние на длительность безрецидивной выживаемости пациенток с РМЖ на уровне тенденции (p=0,09 и р=0,08 соответственно). Лучшие показатели безрецидивной выживаемости отмечены у носительниц гомозиготных вариантов TGF 509 CC (низкая экспрессия и менее выраженная иммуносупрессия) и IL-10 592 AA (высокая экспрессия). Генотип TGF 509 CC характеризуется низкой экспрессией цитокина, обладающего выраженным иммуносупрессивным эффектом [Nakamura K. et al., 2001]. Возможно, увеличение периода безрецидивной выживаемости связано с меньшим угнетением противоопухолевых механизмов иммунной системы. Кроме того, известна ключевая роль TGF-β в реализации эпителиально-мезенхимального перехода, который обеспечивает диссеминацию опухоли [Thiery J. P 1999, Petersen O. W. et al., 2001, Huber M. A. et al., 2004]. Есть сведения о связи up-регуляторных аллелей TGF-β с неблагоприятным исходом РМЖ [Gorelik L. et al.,2002]. Влияние IL-10 на опухолевую прогрессию неоднозначно. С одной стороны, он также обладает иммуносупрессивным действием, но, с другой стороны, способен сдерживать неоангиогенез, как один из факторов прогрессии [Brower V., 2005].