Исследование содержания фенолокислот в лекарственном и пищевом растительном сырье методом ВЭЖХ (стр. 1 )

На правах рукописи

МЕДВЕДЕВ ЮРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛОКИСЛОТ В ЛЕКАРСТВЕННОМ И ПИЩЕВОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

МОСКВА – 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия

имени

Научные руководители:

Академик РАМН, доктор фармацевтических наук,

профессор

Доктор химических наук, профессор

Доктор фармацевтических наук,

профессор

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор

доктор фармацевтических наук

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится «_____» __________________2010 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова г. Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49

Автореферат разослан «_____»_________________2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного 208.040.09,
доктор фармацевтических наук, профессор		Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гидроксикоричные кислоты (ГКК) являются наиболее распространенными полифенольными кислотами в высших растениях. Основными ГКК являются: кафтаровая, хлорогеновая и её изомеры, цикориевая, изомеры дикофеоилхинной (цинарина), феруловая, ферулоилхинная и её изомеры.

ГКК проявляют выраженные антиоксидантные и антирадикальные свойства в тестах in vitro, описаны иммуностимулирующая, противовирусная и противовоспалительная активность.

В настоящее время в отечественной нормативной документации на лекарственные растения и продукты на их основе ГКК упоминается редко (для эхинацеи и артишока). Для BP 2009, USP 30, JP 15 характерно большее количество лекарственных растений, в которых нормируется содержание ГКК (трава и корни эхинацеи, листья артишока, листья ясеня обыкновенного, цветки белокудренника черного, листья крапивы двудомной, листья розмарина лекарственного, листья мелисы лекарственной, корневища и корни шалфея лекарственного). Однако, учитывая важную физиологическую роль для растений можно предположить гораздо большее распространение ГКК.

Другой актуальной проблемой является разработка и внедрение унифицированного метода анализа ГКК, позволяющего определять больший спектр кислот, чем в действующей нормативной документации.

Учитывая вышесказанное, актуальной является разработка унифицированного метода анализа ГКК и исследование с его помощью различного лекарственного растительного сырья, растительных экстрактов, БАД к пище и пищевых продуктов.

Цель и задачи исследования: Цель настоящей работы заключалась в исследовании различных лекарственных и пищевых растительных источников на содержание гидроксикоричных кислот.

Задачи исследования:

1.  Изучить распространение, физико-химические свойства и методы анализа гидроксикоричных кислот.

2.  Разработать методику определения гидроксикоричных кислот (подбор оптимальных условий выделения, детектирования и хроматографического разделения фенолокислот в многокомпонентных смесях).

3.  Оценить хроматографические параметры метода количественного определения, его метрологические характеристики, провести валидацию метода.

4.  Проанализировать образцы лекарственного и пищевого растительного сырья.

5.  Создать базу данных о содержании гидроксикоричных кислот в исследованном лекарственном и пищевом растительном сырье.

Научная новизна. Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения гидроксикоричных кислот в лекарственном и пищевом растительном сырье, БАД к пище и пищевых продуктах.

Практическая значимость. Разработанная методика использована для исследования ГКК в 115 наименованиях лекарственного и пищевого растительного сырья. Методика определения гидроксикоричных кислот включена в «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (дополнение к Р4.1.1672-03, Минздрав РФ).

Методика была успешно применена в НИИ питания РАМН при гигиенической экспертизе более 90 образцов сырья для БАД к пище и БАД к пище в НИИ питания РАМН.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», (ноябрь 2008 г., г. Москва), на научных конференциях кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им.  (2006 – 2009 гг.); конгрессе «Фитофарм 2008» (июнь 2008 г., Санкт-Петербург), XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», (декабрь 2009 г., г. Москва), XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», (2010 г., г. Москва).

Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И. М. Сеченова (19 января 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одна статья в издании, рекомендуемом ВАК России.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ГОУ ММА им. «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01.200.110545. «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований. Рег. № 01.2.006.06352».

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы.

Диссертация изложена на 144 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 102 источника, 72 из которых зарубежные. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 31 таблицей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1.  Разработка методики ВЭЖХ количественного определения ГКК: ­ хлорогеновой, неохлорогеновой, криптохлорогеновой, кафтаровой, кофейной, р-кумаровой, феруловой, цикориевой, дикофеоилхинных, дикофейной, ферулоилхинных кислот в лекарственном и пищевом растительном сырье.

2.  Результаты изучения содержания и состава гидроксикоричных кислот в лекарственном и пищевом растительном сырье.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования

Лекарственное и пищевое растительное сырье, продукты их переработки, БАД к пище, сертифицируемые в НИИ питания РАМН.

Стандартные образцы

При разработке методик и проведении аналитических исследований по содержанию ГКК в качестве стандартных образцов использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества (производства «Sigma-Aldrich Co», «Fluka», «ChromaDex»).

Хроматографическая система

Жидкостной хроматограф «Agilent 1100 Series» (США) с дегазатором, насосом, обеспечивающим одновременную подачу 2-х растворителей, устройством для автоматического ввода проб, термостатом, фотодиодноматричным детектором и масс-детектором «Agilent LC/MSD Trap SL family» (США). Управление системой и обработку полученных хроматограмм осуществляли при помощи программы «Chemstation А.09.03».

Условия хроматографирования и детектирования

Для выбора оптимальной аналитической волны детектирования были изучены УФ-спектры имеющихся стандартов ГКК. Было показано, что ГКК имеют несколько максимумов поглощения: при 220-230 нм и 320-330 нм. Для р-кумаровой кислоты также характерно наличие двух максимумов поглощения в УФ-спектре - при 225-230 нм и 308-313 нм (см. рис. 1 и 2).

В качестве аналитической волны детектирования предпочтительно использование полос поглощения с большей длиной, как более специфичной. Кроме этого коэффициент молярной экстинкции ГКК в диапазоне 320-330 нм (для производных р-кумаровой к-ты 308-313 нм) имеет большую величину по сравнению с диапазоном 220-230 нм.

На основании полученных данных детектирование ГКК при ВЭЖХ исследовании проводили при длине волны 330 нм, детектирование производных р-кумаровой кислоты – при длине волны 310 нм.

Рис. 1. УФ - спектр стандарта хлорогеновой (5-КХК) кислоты.

Рис. 2. УФ - спектр стандарта р-кумаровой кислоты.

Для выбора оптимальных условий (наибольшая чувствительность и специфичность) масс-детектирования и фрагментации ГКК при ВЭЖХ - исследовании были изучены масс-спектры имеющихся стандартов и проведена их фрагментация. Для этого имеющиеся рабочие стандартные растворы вводились непосредственно в масс-детектор.

В дальнейшем масс – детектирование проводили в следующих условиях: ионизация электроспреем с распылением азотом; небулайзер 70 psi; температура осушающего газа 350°С, скорость 12 л/минуту; полярность отрицательная; сканирование в диапазоне 100-800 m/z с разрушением ионов, соответствующим молекулярным массам исследуемых кислот.

В рамках подбора оптимальных условий хроматографического разделения использовались следующие варианты подвижной фазы: изократическое элюирование смесью ацетонитрил – фосфатный буферный раствор 0,025 мМоль с рН=2,5 (в различных соотношениях, от 10 % до 25 % ацетонитрила); градиентное элюирование смесью ацетонитрил – фосфатный буферный раствор 0,025 мМоль с рН=2,5; градиентное элюирование смесью ацетонитрил – водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) с рН=2,5; градиентное элюирование смесью ацетонитрил – водный раствор муравьиной кислоты с рН=2,5. Разделение проводили на колонках Thermo Hypersil ODS (2) column 250x4,6мм 5мкм; Phenomenex Luna C18 х4,6мм 5мкм; Supelco Discovery C18 250х4,6мм 5мкм.

В дальнейшем, как наиболее оптимальный, использовался следующий вариант хроматографического разделения:

Подвижная фаза. Компонент A: ацетонитрил; компонент B: к 1 л дистиллированной деионизированной воды добавляли концентрированную муравьиную кислоту до рН 2,5. Форма градиента – линейная: 0 мин 12% «А», 30 мин 25% «А», 40 мин 40% «А», 41 мин 80% «А», 42 мин 80% «А», 43 мин 12% «А», 45 мин 12% «А». Общее время анализа - 45 минут. Скорость потока: 0,9 мл/мин. Объем вводимой пробы: 5-100 мкл. Колонка Supelco Discovery C18 HPLC 250x4,6мм 5мкм; температура термостата 25°С. Примеры хроматограмм представлены на рис. 3 и 4.

Рис. 3. Типичная ВЭЖХ - хроматограмма ГКК (УФ-детектор при длине волны 330 нм) на примере экстракта артишока.

В процессе работы был проведен подбор условий проведения экстракции ГКК из растительного сырья и пищевых продуктов (состав экстрагента, время).

Рис. 4. Типичная ВЭЖХ - хроматограмма ГКК (масс-детектор, общий ионный ток) на примере экстракта артишока.

Были исследованы следующие варианты: водные растворы этанола с концентрацией 15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%, 100%; водные растворы метанола с концентрацией 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%; смесь метанол-этанол-вода (25:25:50); водное извлечение (настой или отвар в зависимости от вида сырья). Проводилось исследование влияния времени на полноту экстракции (15, 30, 45 и 60 минут).

Было показано, что оптимальными условиями экстракции являются использование смеси метанол : вода (6:4) при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 минут.

Пробоподготовка

Подготовка проб для анализа растительного сырья: образец сырья тщательно измельчают, отбирают около 1,00 г (точная навеска), помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл, экстрагируют 50 мл 60 % раствора метанола в течение 15 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником при перемешивании. После этого пробу обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин, фильтруют, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки 60% метанолом.

Подготовка проб для анализа растительных экстрактов: около 0,5 г (точная навеска) экстракта помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют около 50 мл 60% раствора метанола, растворяют, доводят объем раствора до метки 60 % метанолом.

Подготовка проб для анализа соков: около 10 г (точная навеска) фруктового сока помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем до метки водой.

Полученные растворы тщательно перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм, при необходимости центрифугируют на центрифуге при об/мин.

Хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы

Были рассчитаны хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы разработанной методики (таблица 1), валидационные характеристики (таблица 2), произведена метрологическая оценка методики (таблица 3).

Таблица 1

Параметры разделения гидроксикоричных кислот в условиях градиентного режима, скорость фазы 0,9 мл/мин, мертвый объем t0=3,1

ГКК	tR, мин.	k`	N	Asym	α	Rs
Кофеоилхинная	5.5	0.77	11637	1.01	1,17 1,43 1,05 1,07 1,15 1,11 1,08 1,10 1,15 1,01 1,01 1,13 1,08 1,09 1,03 1,07 1,06 1,08 1,02 1,13 1,06 1,13 1,08 1,05 1,05 1,02 1,05 1,03 1,02 1,04 1,03 1,07 1,02 1,02 1,11 1,05	1,94 5,42 0,83 1,22 2,42 1,98 2,31 2,08 3,36 0,71 0,68 2,93 2,98 2,30 0,96 3,23 1,60 2,41 0,89 5,47 3,20 5,43 4,98 1,92 2,95 1,94 3,28 1,68 1,14 1,77 2,03 4,79 2,83 1,94 7,83 5,50
3-КХК*	5.9	0.90	12849	1.09
Кафтаровая	7.1	1.29	14707	0.97
Кофеоилхинная	7.3	1.35	14050	1.04
Кофеоилхинная	7.6	1.45	15367	1.06
5-КХК	8.2	1.67	17238	0.99
4-КХК	8.7	1.86	18937	1.01
изо-Кафтаровая	9.3	2.00	19617	1.12
Дикофейная	9.9	2.19	16356	1.05
Кофеоилхинная	10.9	2.52	23376	1.06
Кофейная	11.1	2.54	26176	1.03
Кофеоилхинная	11.3	2.56	21874	1.06
Кумароилхинная	12.2	2.90	24987	0.98
1,5-ДиКХК**	13.1	3.13	31619	0.99
ФХК***	13.8	3.42	31326	1.01
Кофеоиляблочная	14.1	3.51	33178	0.98
Кумароилхинная	15.1	3.76	38015	1.02
Кофеоилхинный лактон	15.6	3.97	39712	1.07
р-Кумаровая	16.4	4.28	34931	0.98
Кофеоилхинный лактон	16.7	4.38	43735	1.20
Феруловая	18.6	4.97	39389	1.00
Цикориевая	19.8	5.25	44874	0,97
Дикумароилхинный лактон	21.7	5.92	71156	1.01
Кофеоилкумароилхинная	23.5	6.41	55934	0.90
3,4-ДиКХК	24.2	6.74	85559	0.98
изо-3,4-ДиКХК	25.2	7.06	84937	1.02
3,5-ДиКХК	25.9	7,17	76782	1.05
Кофеоилферулоилвинная	27.1	7.55	92259	1.00
4,5-ДиКХК	27.7	7.74	96389	1.12
изо-3,5-ДиКХК	28.1	7.86	107738	1.06
изо-4,5-ДиКХК	28.7	8.15	119453	1.05
Розмариновая	29.4	8.37	107631	0.99
Кофеоилферулоилхинная	31.1	8.93	125964	1.08
Кофеоилферулоилхинная	32.1	9.13	130810	1.07
Кофеоилферулоилхинная	32.8	9.35	128736	1.09
Кофеоилферулоилхинная	35.5	10.34	192275	1.10
Ферулоилхинная	37.2	10.86	255730	1.06

Здесь и далее: *КХК – кофеоилхинная кислота; **диКХК – дикофеоилхинная кислота; ***ФХК – ферулоилхинная килота