Реакции организма каспийских осетровых (acipenseridae) на загрязнение среды обитания (стр. 1 )

На правах рукописи

реакции организма каспийских осетровых (aCIPENSERIDAE)

на загрязнение среды обитания

Специальность: 03.03.01 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Москва - 2013

Работа выполнена на кафедре аквакультуры и водных биоресурсов ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет» Федерального агентства по рыболовству.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии, морфологии и биохимии животных ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени

- доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ГНУ ВНИИ ирригационного рыбоводства РАСХН

– доктор биологических наук, заведующий лабораторией ихтиологии Южного научного центра РАН

Ведущая организация: ВГБУН «Институт экологии волжского бассейна» РАН

Защита состоится «23» декабря 2013 г. в 14.30 на заседании диссертационного совета Д220.043.09 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени Москва, ул. Прянишникова, тел./факс: (4

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ имени РГАУ-МСХА имени

Автореферат разослан «____» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Длительный сброс промышленных сточных вод в реки, впадающие в Каспий, смывы с сельхозполей ядохимикатов и удобрений, попадание в воду нефти и нефтепродуктов при её добыче в море и прибрежных районах, во время транспортировки и эксплуатации водного транспорта значительно ухудшили экологическую обстановку в этом регионе. Особенно сильно загрязнялось море в период интенсификации сельского хозяйства и роста промышленности в 70-80-е гг. прошлого века. В конце этого периода уровень загрязнения морских вод достиг критических величин (Ласкорин, Лукьяненко, 1990). С этого времени оно по силе воздействия на рыб не стало уступать природным факторам и вылилось в постоянно действующую, новую силу, негативного характера, что значительно ухудшило условия обитания гидробионтов. В большей степени загрязнение моря сказалось на осетровых, следствием чего стал феномен «расслоения» мышц и ослабление оболочек икры, явление которое ранее не было описано нигде в литературе. К 1987 г. оно достигло массового характера у внешне здоровых рыб. В это же время были зафиксированы и существенные изменения в их физиологическом состоянии. Они выражались в значительных отклонениях функциональных показателей от уровня 60-70-х гг. и структурных нарушениях в печени, жабрах, мышцах и половых железах, выявляемых гистологическими методами, значение и взаимосвязь которых в большинстве случаев было непонятно. Исследования, проводимые в этом направлении, ограничивались констатацией факта влияния поллютантов на те или иные физиолого-биохимические показатели, а целью экспериментов с токсикантами, как правило, было более точное определение ПДК. Практически отсутствовали исследования, показывающие формирование реакции организма гидробионтов на увеличение загрязнения среды их обитания и его механизм. Тем более что развитие промышленности, сельского хозяйства и интенсификация добычи нефти в Волго-Каспийском регионе в будущем может привести к повторению экологической ситуации 80-х годов. Можно полагать, что лишь всесторонний анализ многолетних данных исследования осетровых, полученных при разных уровнях загрязнения водной среды, позволит раскрыть и понять механизмы реакций организма рыб, объяснить изменения в обменных процессах и морфофункциональном состоянии различных тканей и органов.

Цель и основные задачи исследования

Основная цель данной работы состояла в выявлении причинно - следственных связей между действующими негативными факторами внешней среды и изменениями в физиолого-биохимических показателях и гистоморфологических структурах тканей и их адаптационный смысл на основе комплексного физиолого-биохимического и гистологического анализов. В связи с этим, были поставлены следующие задачи:

1. Показать реакцию организма осетровых рыб и её развитие в условиях антропогенного влияния на экосистему Волго-Каспия.

2. Исследовать изменения физиолого-биохимических показателей отражающих функционирование различных физиологических систем осетровых рыб и степень повреждения структур тканей мышц, жабр и половых желез при колебаниях уровня загрязненности среды обитания.

3. Выявить смысл формирования различного уровня ответных реакций осетровых рыб на воздействие загрязнений.

4. Раскрыть механизм появления структурно-функциональных изменений у осетровых рыб при различных уровнях загрязнения воды.

Научная новизна работы

Впервые на большом фактическом материале в природных условиях показано развитие реакции организма осетровых рыб на загрязнение среды их обитания. Доказано, что в подавляющем большинстве своём они являются различного уровня неспецифичес кими адаптационными реакциями организма. Впервые обоснована степень вовлечённости в адаптационный процесс различных функциональных систем от уровня загрязнения и длительности его действия. Установлены причинно-следственные связи и механизм проявления у осетровых рыб структурных и функциональных нарушений. Приведены доказательства, что явление «расслоения» мышц у осетровых рыб, в условиях загрязнения моря, вызвано тканевой или точнее гепатотоксической гипоксией.

Теоретическое и практическое значение работы

На основе многолетних мониторинговых исследований физиологического состояния осетровых и анализа литературных данных впервые показан механизм отклика физиологических систем на различный уровень интоксикации рыб в природных условиях, и роли свободнорадикального окисления в появлении функциональных и структурных изменений в мышечной ткани и печени. Приведены доказательства, что в природных условиях реакция рыб на токсическое воздействие загрязнения среды обитания проявляется в подавляющем большинстве комплексом адаптивных реакций, уровень которых зависит от полученной дозы, соотношения прооксидантных и антиоксидантных веществ и степени необходимости обеспечения энергией организма в этих условиях.

Практическая значимость работы заключается в использовании результатов и выводов в практической ихтиологии при долгосрочном и краткосрочном прогнозировании возможных выловов рыб промыслом и аквакультуре при оценке физиологического состояния рыб и устранении оксидативного стресса, например, при использовании некачественных кормов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Уровень перекисного окисления липидов в печени и мышцах осетровых рыб, обитающих в море, (при прочих равных условиях) определяется степенью загрязнения воды.

2. Степень ингибирования активности цитохромоксидазы в печени и мышцах, в условиях загрязнения водной среды, обуславливает уровень перекисных процессов, индуцируемых токсикантами.

3. В основе структурно-функциональных изменений, зафиксированных у осетровых рыб, лежат процессы детоксикации, мобилизации энергоресурсов и удовлетворение возросших энергозатрат, динамика соотношения прооксидантных и антиоксидантных веществ, переход в метаболическую депрессию.

4. Реакция организма осетровых рыб на загрязнение водной среды представляет собой комплекс неспецифических адаптивных реакций.

Апробация работы

Основные результаты по теме диссертации были заслушаны и обсуждены на III (Киев, 1976), VI (Паланга, 1985), VII (Кара-Даг, 1989) Всесоюзных конференциях по экологической физиологии и биохимии рыб, Первом (Ростов Великий, 1987) и Втором (Ярославль, 1990) симпозиумах по экологической биохимии, 7-ом научном совещании по эволюционной физиологии, посвящённой памяти (Ленинград, 1977), Второй всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (С-Петербург, 1991), на II (Russia, Moscow-Kostroma, 1993), III (Italy, Piacennza, 1997), VI (China, Wuhan, Hubei provincce, 2009) Международных симпозиумах по осетровым рыбам, на первом конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997), на двух симпозиумах «Современная экологическая обстановка Волго-Каспийского бассейна и её влияние на осетровых рыб» (Волгоград, 1989; Дубна, 1990), Всероссийских конференциях Нейроэндокринология-95 (С-Петербург, 1995), Нейроэндокринология-2000 (С-Петербург, 2000), Нейроэндокринология-2010 (С-Петербург, 2010), Всесоюзных совещаниях по осетровым рыбам (Астрахань, 1984, 1989,) Международных конференциях: «Осетровые на рубеже XXI века» (Астрахань, 2000) и «Проблемы изучения, сохранения и восстановления водных биологических ресурсов в XXI веке» (Астрахань, 2007), симпозиуме «Экологические и функциональные основы адаптации гидробионтов», посвященного 100-летию со дня рождения профессора (Санкт-Петербург, 2000), Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 76 печатных работ, в том числе 15 статей в рецензируемых научных журналах, отнесенных к перечню ВАК.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, 2-х разделов обзора литературы, характеризующих загрязнение низовьев р. Волги и Каспийского моря как новый фактор современной среды обитания осетровых рыб и влияние отдельных групп токсических веществ на физиологические системы организма рыб; четырех глав, посвящённых: материалам, методологии и методам изучения влияния загрязнений на физиологическое состояние осетровых; описанию и анализу реакции организма осетровых на воздействие антропогенных факторов; влиянию степени загрязненности водной среды на физиологические системы; формированию реакций организма осетровых рыб на загрязнение их среды обитания; заключения и выводов. Работа изложена на 418 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками, содержит 44 таблицы. В работе использовано 595 источника, из них 450 отечественных и 145 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

1.1. Загрязнение низовьев р. Волги и Каспийского моря как новый фактор современной среды обитания осетровых

В данном разделе изложены материалы исследований отечественных учёных и их коллег из прикаспийских государств по уровню загрязнения Каспия и рек, впадающих в него. Из анализа этих материалов следует, что загрязнение представляло в это время устойчивый негативный фактор.

1.2. Влияние токсикантов на физиологические системы рыб

В разделе представлен анализ исследований отечественных и зарубежных авторов по влиянию отдельных видов токсических веществ (тяжёлые металлы, нефть, пестициды и т. д.) на физиолого-биохимические показатели рыб. Из чего следует, что реакции организма на них неспецифичны и отражают изменения в печени, почках и жабрах. Клинически острое отравление проявляется в форме судорог, потери равновесия, конвульсиях, и т. д., и заканчивается смертельным исходом большинства рыб. Конечным результатом хронического воздействия на рыб токсикантов является истощение, заканчивающееся нарушениями репродуктивной функции.

2. Материалы, методология и методы исследования

В работе обобщены многолетние данные ( гг.) изучения физиологического состояния русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Br.), севрюги (Acipenser stellatus Pall.) и белуги (Huso huso L.) в естественной среде обитания, с привлечением данных ранних исследований и литературных источников. Рыбы, выловленные в море, находились на II СЗГ, т. е. в физиологически спокойном состоянии, в реке - на III или IV СЗГ, на этапе их активного созревания. Отлов осетровых в море производили тралом в течение 30 минут. В реке - отбирались из неводных уловов на экспериментальных тонях «Чкаловская» и «Мужичья», расположенные соответственно в 120 км ниже и 80 км выше г. Астрахани и в нижнем бьефе Волгоградской ГЭС. В общей сложности на разные виды биохимических, гематологических и гистологических анализов использовано 5592 рыбы, из которых 2545 особей русского осетра (1083 экз. - море, 1462 экз. - река), 2156 севрюги (610 экз. - море, 1546 экз. - река) и 891 белуга (531 экз. - море, 360 экз. - река). Изучение реакции организма осетровых на загрязнение, проводили на основе методологического подхода, разработанного автором, в котором изначально были заложены иные задачи, чем ставились ранее (Шульман 1972; Шатуновский 1980; Лукьяненко, 1971), а также были положены в основу биохимического интегрального индекса (БИИ), упрощающего интерпретацию биохимических данных при определении ПДК для рыб (Немова, Высоцкая, 2004). Это изучение реакций различных функциональных систем рыб. При этом такая индикаторная система должна была удовлетворять таким условиям: мгновенно реагировать на антропогенный фактор, т. е. чувствительность и реактивность одних показателей, чтобы уловить первичную реакцию организма на него; отражать последствия этих воздействий на организм (полуконсерватизм других); выражать весь спектр временного (длительность и частоту) воздействия негативных факторов внешней среды и его силы, т. е. коммулятивный эффект третьих.

Исходя из выше перечисленных постулатов, подобран небольшой комплекс показателей, характеризующих работу наиболее важных для рыб физиологических систем, таких как дыхательная, энергетическая, регуляторно-гомеостатическая, защитная и репродуктивная.

О состоянии дыхательной функции судили, по морфофункциональному состоянию жабр, содержанию в крови эритроцитов и гемоглобина и дополнительно - по соответствию сформированности фракционного состава гемоглобина этапам онтогенеза. Заключительные компоненты дыхательной системы представляют клеточное дыхание, тесно связанное с получением энергии, т. е. энергетической функцией организма. В качестве индикаторов состояния этой системы у осетровых рыб, исследовались ключевые ферменты аэробного - цитохромоксидаза и анаэробного – лактатдегидрогеназа, обменов.

В условиях действия возмущающих факторов среды не обойтись без исследований регуляторно-гомеостатической функции. Из большого комплекса регулирующих механизмов, поддерживающих гомеостаз, мы ограничились исследованием показателей метаболизма, изучая в крови концентрации белка, β-липопротеидов, холестерина, общих липидов и в ряде случаев фосфолипидов, а также содержание в печени гликогена. Дополнительно исследовали содержание в мышцах водорастворимого белка и его фракционный состав. Также в рамках этой системы изучался уровень перекисного окисления липидов, который в нормальных условиях представляет собой обычный метаболический процесс, протекающий практически во всех тканях организма.

В системе механизмов поддерживающих гомеостаз особую роль играет защитная функция. Она многоступенчата и иерархически сложна. Поэтому мы ограничились исследованием лишь двух интегральных показателей, характеризующих состояние иммунитета и антиоксидантной защиты - общей антиоксидантной активности, и уровню вторичного иммунодефицита (индекса ингибирования антител). Дополнительно изучались факторы клеточного иммунитета: количественный состав лейкоцитов и соотношение их форм.

Кроме того, исследовалось морфофункциональное состояние половых желёз, печени и мышц.

Как базис относительно «нормального» состояния организма осетровых рыб взяты данные по физиолого-биохимическому интерьеру исследуемых видов, полученные в 60-70-х гг. при относительно благополучной среде.

Физиолого-биохимические методы исследования сыворотки крови

В сыворотке крови исследовали содержание общего белка, общих липидов, β-липопротеидов, холестерина, фосфолипидов. Величину общего белка определяли рефрактометрически (Филиппович и др., 1982); общие липиды - колориметрическим методом (Zollner N., Kirsch K., 1962); β-липопротеиды - по Бурштейну и Самай (Тодоров, 1963); общий холестерин - прямым методом по Ильку (Меньшиков, 1987), фосфолипиды - по Колбу и Камышникову (1976).

Гематологические методы исследования крови

В крови определяли содержание общего гемоглобина, количество эритроцитов и лейкоцитов, а также лейкоцитарную формулу. Подсчет форменных элементов крови проводился в счетной камере Горяева. Дифференцировка форменных элементов осуществлялась по (1983). Индекс сдвига лейкоцитов (ИСЛ) - по методу (1983) в модификации (1986). Содержание в крови гемоглобина (Hb) изучали унифицированным цианметгемоглобиновым фотометрическим методом (Кушаковский, 1968).

Физиолого-биохимические методы исследования тканей

В печени и мышцах определяли активность цитохромоксидазы и лактатдегидрогеназы, скорость аскорбатзависимого и спонтанного перекисного окисления липидов, содержание малонового диальдегида, а также общую антиоксидантную активность. Кроме того, в печени - содержание гликогена, в мышцах - водорастворимого белка. Гомогенаты тканей, готовили по стандартной методике в гомогенизаторе Поттера. Активность ЦО определяли по Гумидову и Сорокиной (1967), ЛДГ - по скорости окисления лактата в пируват (Методы биологии развития…, 1974), скорости ПОЛ по реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой (Строев, Макарова, 1986), уровень АОА - по величине торможения переокисления липидов в модельной системе по методу Клебанова и др. (1988). Для определения гликогена в тканях его осаждали и очищали по Бренду (Brandt, 1966), анализ заканчивали реакцией с антроновым реактивом (Seift et al., 1950). Содержание водорастворимого белка, в экстракте ткани, спектрофотометрически по методу Варбурга и Христиана (Методы биологии развития…, 1974). Мышечные белки и гемоглобин разделяли методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (Маурер, 1971).

Иммунологические методы

Для оценки состояния иммунной системы рыб использован метод определения уровня вторичного иммунодефицита у животных, предложенный и (1977) и усовершенствованный и (1989) и модифицированный нами применительно к рыбам (Переварюха, 2005).

Гистологические методы исследования жабр, печени, мышц и ооцитов

Для исследования морфофункционального состояния мышц, печени, жабр и ооцитов использовались классические гистологические методы световой микроскопии (Ромейс, 1953; Меркулов, 1969). Отклонения от нормы гонадо - и гаметогенеза оценивали по (1965), и (1989). Состояние жаберного эпителия - по пятибалльной шкале, в основе которой шкала и (1987).

Статистическая обработка

Статистическая обработка полученных данных проводилась на компьютере с применением стандартных статистических методов: t-критерия Стъюдента, кластерного анализа, вычислением регрессионных уравнений, с помощью пакетов программ Microsoft Excel, Stadia, Statistica 6.

3. Реакции организма осетровых на воздействие антропогенных факторов в р. Волге и Каспийском море

Первые признаки влияния антропогенныой нагрузки на осетровых рыб появились сразу же после зарегулирования р. Волги плотинами ГЭС, в форме массовой резорбции ооцитов не завершивших трофоплазматический рост, из-за отсутствия условий для икрометания (Баранникова, 1967, 1975; Песериди, 1966). Провоцировало этот процесс и изменение условий зимовки и гидротермического режима (Трусов, 1963; Алтуфьев и др., 1980; Лукьяненко и др., 1990). Во всех случаях нарушения функции половых желез возникали в условиях действия неблагоприятных факторов.

Схожей оказалась и первоначальная реакция осетровых рыб в начале 80-х годов, на загрязнение Каспия и рек в него впадающих. У 20% самок севрюги и русского осетра уже в начале нерестового пути в реке были выявлены нарушения функции половых желез (Алтуфьев и др., 1984). Патологические изменения в половых клетках на II СЗГ отмечались и у рыб, нагуливающихся в море, а у самок русского осетра - задержка развития половых желёз (Романов и др., 1990,2001). У белуги - снижение темпов формирования фракционного состава гемоглобина, из-за тормозящего эффекта развития биохимических систем, возникающего в неблагоприятных условиях (Гераскин, 1972). У самок русского осетра и севрюги, мигрирующих на нерест, были обнаружены функциональные нарушения (Geraskin, 1995; Гераскин и др., 2001). У осетра - снижение содержания в печени гликогена в 1,8 раза (р<0,001), в крови холестерина в 1,5 раза (р<0,001). У севрюги они были более выраженными и проявлялись в начале нерестового пути наличием признаков физиологического истощения: низким содержанием в крови β-липопротеидов (1,58±0,29 г/л) и белка (19,0±2,0 г/л), а также нарушениями вителлогенеза (Гераскин и др., 1984). Икра у таких самок, хотя и овулировала, но не оплодотворялась, либо давала не жизнеспособных личинок. У севрюг, нагуливающихся в море, отмечалось увеличение, в сравнении с 60-70 гг., в крови содержания общих липидов у самцов в 1,2, у самок в 1,4 раза (р<0,001), а также холестерина на 18% (р<0,05).

Наиболее сильное влияние загрязнения моря сказалось на осетровых в конце 80-х годов, когда у части рыб появился феномен «расслоения» мышц и ослабления оболочек икры, которые явились результатом токсикоза (Лукьяненко, 1990) и, в частности, тканевой или точнее гепатотоксической гипоксии (Гераскин, 1989). Пик наибольших изменений функционального характера и разнообразия и глубины нарушений в морфофункциональном состоянии тканей мышц, печени и гонад пришёлся на гг. У русского осетра эти изменения показаны в таблице 1. Вначале (1987 г.) трансформировались показатели, которые свидетельствовали об экстренном увеличении потребления энергии, как за счет аэробной, так и анаэробной составляющих, с увеличением потребления кислорода. Дальнейшие изменения ( гг.) связаны с углублением трансформации обмена веществ и нарушением минерального обмена. Увеличение в крови русского осетра на 20-

Таблица 1

Характеристика физиолого-биохимических показателей крови

русского осетра (♀♂ I-II, II) в морской период жизни (лето)

Показатели крови	М±m
1987 г.	1988 г.	1989 г.	1990 г.	*Норма
Общий белок (г/л)	32,9±1,5	28,8±1,1	28,2±1,2	30,3±1,8	34,5±0,4
Общие липиды (г/л)	3,44±0,24	3,20±0,39	4,59±0,38	3,97±0,59	4,07±0,14
Холестерин (г/л)	-	0,52±0,05	0,48±0,06	1,06±0,08	0,7±0,03
Гликоген печени (г/кг)	12,3±0,17	13,1±4,1	33,4±4	41,9±2,3	47,1±3,5
β-липопротеиды (г/л)	-	2,3±0,18	1,66±0,12	1,96±0,16	3,00±0,20
Гемоглобин (г/л)	86,2±2,82	69±2	49±3	68±3	65±1,6
Эритроциты (тыс. шт./мм3)	-	383±13	372±25	404±17	370±21
Лейкоциты (тыс. шт./мм3)	-	18,2±1,0	16,4±1,1	19,9±1,1	54,2±5,35

* Норма: Шелухин, 1974; Субботкин, 1979; Лукьяненко, Гераскин, 1966; Сухопарова, Сухенко, 1986. Жирным шрифтом выделены статистически значимые отклонения от относительной нормы.