в) Постройте график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры. Данные о скорости ферментативной реакции при различных значениях температуры представлены в таблице.
Таблица 10 – Зависимость скорости ферментативной реакции, катализируемой фосфатазой, от рН среды
Температура, оС | Скорость реакции, ммоль/(дм3*мин) |
10 | 5 |
20 | 11 |
37 | 25 |
50 | 95 |
60 | 91 |
70 | 7,0 |
80 | 2,6 |
Определите температурный оптимум фосфатазы
г) Конкурентным ингибитором фосфатаз является фосфат. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фосфата. Данные представлены в таблице.
Таблица 11 – Зависимость скорости ферментативной реакции, от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фосфата
Концентрация субстрата, ммоль/дм3 | Скорость реакции в отсутствие ингибитора, ммоль/(дм3*мин) | Скорость реакции в присутствии ингибитора, ммоль/(дм3*мин) |
0,5 | 8 | 4 |
1,0 | 15 | 7,5 |
2,0 | 28 | 14 |
3,0 | 35 | 17,5 |
4,0 | 38 | 19 |
5,0 | 40 | 20 |
Определите КМ и Vmax ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие конкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фосфат влияет на эти показатели.
д) Фторид является неконкурентным ингибитором фосфатаз. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фторида. Данные представлены в таблице.
Таблица 12 – Зависимость скорости ферментативной реакции, от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фосфата
Концентрация субстрата ммоль/дм3 | Скорость реакции в отсутствие ингибитора, ммоль/(дм3*мин) | Скорость реакции в присутствии ингибитора, ммоль/(дм3*мин) |
0,5 | 8 | 5 |
1,0 | 15 | 10 |
2,0 | 28 | 18 |
3,0 | 35 | 24 |
4,0 | 38 | 30 |
5,0 | 40 | 35 |
6,0 | - | 38 |
8,0 | - | 40 |
Определите КМ и Vmax ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие конкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фторид влияет на эти показатели.
Контрольные вопросы
1 Правила техники безопасности при выполнении работы.
2 Понятие о ферментах.
3 Классификация ферментов.
4 Строение фермента.
5 Как можно обнаружить присутствие фермента в исследуемом материале?
6 Перечислите основные факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.
7 Чем обусловлена специфичность ферментов?
8 Понятие об ингибиторах и активаторах.
9 Обратимое и необратимое ингибирование.
10 Методика исследования свойств сахаразы.
11 Методика исследования свойств амилазы.
12 Методика проведения биохимической реакции.
13 Особенность действия фосфорорганических соединений на фермент холинэcтеразу.
14 Уравнение реакции гидролиза: сахарозы, крахмала, бутирилхолинйодида.
15 Определение ингибирующего действия хлорофоса.
2.3 Нуклеиновые кислоты
Лабораторная работа № 8 Характеристика препаратов нуклеиновых кислот
Цель работы:
1 провести кислотный гидролиз пекарских дрожжей;
2 изучить некоторые продукты гидролиза дрожжей;
3 привить навыки работы химической посудой, реагентами;
4 закрепить полученные знания по строению нуклеиновых кислот;
5 ознакомить с качественными реакциями, подтверждающими состав продуктов гидролиза;
6 привить навыки работы с литературой и умения формулировать выводы.
Оборудование: спектрофотометр, термостат.
Реактивы: раствор ДНК – 0,003%.
Чистоту препаратов нуклеиновых кислот определяют по спектральной кривой поглощения в ультрафиолетовом свете и по величине отношений Е260 : Е230 и Е240 : Е280.
В спектрофотометрическую кювету наливают 3мл раствора ДНК (0,003%) и на спектрофотометре меряют оптическую плотность (Д) при длине волн: 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 нм.
На основе полученных данных строят график зависимости Д (ДНК) от длины волны. Находят максимум поглощения в ультрафиолетовом свете препарата ДНК. Затем высчитывают отношения Е260 : Е230 и Е240 : Е280. Для препаратов нуклеиновых кислот достаточно хорошо очищенных от примесей белков и полисахаридов, эти показатели должны быть в пределах 2,1 – 2,4. Делают вывод о чистоте исследованного препарата ДНК.
Лабораторная работа № 9 Количественное определение ДНК
Метод основан на свойстве дезоксирибозы, входящей в состав ДНК, образовывать синее окрашивание прямо пропорционально концентрации ДНК.
Материал исследования: водный раствор ДНК.
Реактивы: дифениламиновый реактив (1г. дифениламина в 100мл. ледяной уксусной кислоты, + 2,75мл. H2SO4 конц.), дистиллированная вода.
Ход работы: Сначала необходимо построить калибровочный график. Для этого в 3 пробирки наливают по 1мл. раствора ДНК с различной концентрацией (50, 100, 200 мкг/мл) и по 2мл. дифениламинового реактива. Помещают пробирки на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню для развития окраски, затем определяют оптическую плотность каждого из растворов. Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрацию использованных растворов ДНК, по оси ординат – соответствующие им значения оптической плотности.
Затем берут две пробирки: в контрольную пробирку наливают 1мл. воды, в опытную пробирку – 1мл. водного раствора ДНК (неизвестной концентрации). В каждую пробирку добавляют по 2мл. дифениламинового реактива. Обе пробирки помещают на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню. Затем пробы остужают и измеряют насыщенность окраски против контроля при λ = 595 нм. Зная оптическую плотность пробы, по калибровочному графику находят количество ДНК в ней.
Таблица 12 - Состав проб
Пробирки | ДНК (мл) | Дифениламиновый реактив (мл) | H2O (мл) | |||
50 (мкг/мл) | 100 (мкг/мл) | 200 (мкг/мл) | Х (мкг/мл) | |||
1 | 1 | – | – | – | 2 | – |
2 | – | 1 | – | – | 2 | – |
3 | – | – | 1 | – | 2 | – |
Х | – | – | – | 1 | 2 | – |
К | – | – | – | – | 2 | 1 |
10 – 15 мин. кипящ. водян. баня | ||||||
остудить, оптич. плотность при λ=595 нм. |
Практическое задание
1) Запишите формулы нуклеотидов ГТФ, УДФ, дАМФ, дТДФ, дЦТФ.
a) в составе нуклеотидов обведите карандашом пуриновые азотистые основания;
b) подчеркните нуклеотиды, содержащие рибозу, одной чертой, а нуклеотиды, содержащие дезоксирибозу - двумя чертами.
2) Напишите формулу тринуклеотида А-Ц-Г.
a) укажите фосфодиэфирные связи;
b) отметьте 5’- и 3’-концы.
3) Дан фрагмент одной из цепей ДНК:
Г-Ц-Т-А-А-Т-Ц-Г-Ц-Т-А-Г.
a) запишите нуклеотидную последовательность второй цепи;
b) укажите 5’- и 3’-концы в цепях ДНК.
4) Фрагмент иРНК имеет следующую нуклеотидную последовательность:
5’А-Ц-У-А-Ц-Ц-А-Ц-А-А-Ц-Г-У-Г-А3’
a) определите, сколько аминокислот закодировано в данном фрагменте;
b) пользуясь таблицей генетического кода, определите закодированную аминокислотную последовательность;
c) по фрагменту иРНК установите первичную структуру обеих цепей ДНК, отметьте транскрибируемую цепь, укажите 5’- и 3’-концы в цепях ДНК.
5) Пептид имеет следующую структуру:
фен-ала-арг-гли-тре-сер
a) может ли несколько иРНК, отличающихся друг от друга первичной структурой, кодировать данный пептид или нет?
b)
 |
запишите две различные последовательности иРНК, кодирующие данный пептид, укажите 5’- и 3’-концы в иРНК.
Выделение нуклеопротеинов из дрожжей
Реактивы: дрожжи пекарские, прессованные; 1 %-ный раствор гидроксида натрия; ацетат натрия; речной песок, тщательно промытый и прокаленный.
Оборудование: ступка с пестиком; воронка для фильтрования, химические стаканы; стеклянная палочка.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 |
