Биохимия: лабораторный практикум (стр. 8 )

Цель работы:

1 ознакомить студентов с методиками проведения качественных реакций на липиды;

2 закрепить представления о структурах липидов;

3 выработать навыки обращения с химической посудой, реактивами; ознакомить со способами утилизации отработанных реактивов;

4 привить навыки работы со справочной литературой и оформления отчета по лабораторной работе.

Липиды (от греч. липос – жир) – низкомолекулярные органические соединения, практически нерастворимые в воде, которые могут быть извлечены из клеток неполярными органическими растворителями (хлороформ, бензол, петролейный эфир). Отличительным свойством липидов является их гидрофобность (липофильность). Липиды представляют собой разнородные химические соединения

I Простые липиды:

1 ацилглицеролы (жиры, триглицериды и т. п.);

2 воска.

II Сложные липиды:

1 фосфолипиды

• глицерофосфолипиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерол, кардиолипин, плазмалоген);

• сфингофосфолипиды (сфингомиелин);

2 стероиды (холестерол, эргостерол, ланостерол, стигмастерол, экдистероиды);

3 гликолипиды (цереброзиды, ганглиозиды, сульфатиды).

Для характеристики жира используют константы или жировые числа:

Кислотное число – масса КОН (мг), необходимая для нейтрализации свободных жирных кислот в 1 г жира.

Число омыления – это масса КОН (мг), необходимая для гидролиза нейтральных липидов (омыления) и нейтрализации всех жирных кислот (в том числе и свободных), содержащихся в 1 г жира. Чем выше число омыления, тем больше низкомолекулярных кислот входит в состав жира.

Йодное число – это масса йода (г), связываемая 100 г жира. Йодное число характеризует степень ненасыщенности, так как присоединение йода происходит по месту разрыва кратных связей в остатке жирной кислоты. Чем больше йодное число, тем выше ненасыщенность жира.

Липиды широко применяют в медицине и технике. Из них получают основу для мазей, мыло (соли жирных кислот), масляные краски, олифу и т. п.

Реактивы и оборудование:

Жиры (говяжий, свиной, бараний) 10 г, масло (подсолнечное, касторовое, растительное) 10 г, толуол, ацетон, петролейный эфир, диэтиловый эфир, гексан, этиловый спирт, серная кислота (конц.), соляная кислота (0,5н), соляная кислота (разб. 1:1), гидроксид калия (водный 0,1 н), гидроксид калия, (спиртовой раствор 0,5н), раствор гидроксида натрия (разб.), раствор карбоната натрия 10%, гидросульфат калия (безвод.), раствор нитрата серебра, аммиак (водный раствор), раствор фуксинсернистой кислоты, спиртовой раствор йода (0,2н), раствор тиосульфата натрия (0,1н), раствор крахмала 1 %, бромная вода, раствор гидроксида натрия 35 %; пробирки, колбочки для титрования, держатель, спиртовка, водяная баня, кристаллизатор со льдом, часовое стекло, бюретки.

Опыт 1 Растворимость жиров и масел

а) в 5 пробирок поместите по небольшому кусочку твердого жира (свиного, говяжьего и т. п.) и прилейте по 1 мл: 1 – воды, 2 – этанола, 3 – толуола, 4 – петролейного эфира, 5 – ацетона. Если жир не растворяется, пробирку поместите в водяную баню на 5 минут. Сделайте вывод о растворимости жира на холоде и при нагревании.

б) в 5 пробирок поместите по 0,5 мл растительного масла (подсолнечного, оливкового, кукурузного и т. п) и прилейте по 1 мл: 1 –воды, 2 – этанола, 3 – толуола, 4 – петролейного эфира, 5 – ацетона. Если масло не растворяется, пробирку поместите в водяную баню на 5 минут. Сделайте вывод о растворимости растительного масла на холоде и при нагревании.

Опыт 2 Гидролиз жиров и масел

а) В 2 пробирки поместите по небольшому кусочку жира и прилейте в 1 пробирку 1…2 мл раствора щелочи (NaOH разб.), а во вторую – 1…2 мл соляной кислоты (1:1). Пробирки встряхните. Если изменений не наблюдается, поместите пробирки в водяную баню на 5…10 мин.

Сделайте вывод о гидролизе жиров на холоду и при нагревании.

б) в 2 пробирки поместите по 0,5 мл растительного масла и прилейте в 1 пробирку 1…2 мл раствора щелочи (NaOH разб.), а во вторую – 1…2 мл соляной кислоты (1:1). Пробирки встряхните. Если изменений не наблюдается, поместите пробирки в водяную баню на 5…10 мин.

Сделайте вывод о гидролизе растительного масла на холоде и при нагревании.

Опыт 3 Выделение жира из молока

К 6 мл цельного молока прибавляют 2 мл 10 %-ного раствора Na2CO3, хорошо перемешивают и взбалтывают с 5 мл эфира. Эфирный слой помещают в чашечку для выпаривания на водяную баню (под тягой). После испарения эфира остается сливочное масло – молочный жир.

Опыт 4 Обнаружение глицерина в жирах (акролеиновая проба)

В пробирку вносят 2…3 капли масла (жира), 0,1…0,2 г безводного KHSO4 и нагревают на спиртовке (под тягой) до появления белых густых паров. В пары вносят бумажку, смоченную аммиачным раствором нитрата серебра или раствором фуксинсернистой кислоты.

Аналитический эффект: Бумажка с раствором солей серебра темнеет, а с раствором фуксинсернистой кислоты становится ярко-розовой.

Акролеиновая проба проводится для обнаружения в липидах глицерина. При нагревании в присутствии водоотнимающих средств (KHSO4, MgSO4, борная кислота) из глицерина образуется непредельный альдегид – акролеин (пропеналь).

Опыт 5 Определение ненасыщенности кислот в составе жира

В пробирку поместите 2–3 капли масла (жира) и 8 – 10 капель бромной воды. Пробирку встряхните.

Аналитический эффект: Обесцвечивание бромной воды

Опыт 6 Определение йодного числа

В предварительно взвешенную сухую колбу для титрования помещают 3…4 капли масла (жира).

Колбу повторно взвешиваю на аналитических весах. По разности весов рассчитывают массу навески масла (жира). В колбу добавляют 25 мл спирта (при плохой растворимости слегка подогревают на водяной бане). Затем в колбу вносят 12,5 мл 0,2н спиртового раствора йода (из бюретки), 100 мл воды и перемешивают 5 мин. Содержимое колбы титруют 0,1н раствора тиосульфата натрия до появления слабо желтого окрашивания.

Для более точного определения в колбу приливают 1 мл раствора крахмала и титрование заканчивают до исчезновения синего окрашивания.

Опыт повторяют – контроль, но без масла (жира).

Расчет йодного числа проводят по формуле:

И. ч. = (V2 – V1) х 0,0127 х 100/ m,

где V2 – объем (мл) раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование контроля; V1 – объем (мл) раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование пробы масла; 0,0127 – титр тиосульфата по йоду; m – навеска масла (г)

Опыт 7 Определение кислотного числа

В предварительно взвешенную сухую колбу для титрования помещают примерно 2 мл масла (жира) – 2…3 г. Колбу повторно взвешиваю на аналитических весах. По разности рассчитывают массу навески масла (жира) ≈ 2…3 г. В колбочку добавляют 10…15 мл смеси спирта с эфиром (1:1), 1…2 капли фенолфталеина и титруют 0,1 н раствор КОН до появления слабо-розового окрашивания. Окраска после взбалтывания не должна исчезать в течение 0,5…1 мин.

Кислотное число рассчитывают по формуле:

К. ч. = V T/ m,

где К. ч. – кислотное число; V – объем (мл) спиртового раствора КОН, пошедшего на титрование (мл); Т – титр 0,1 н раствора КОН; m – масса навески масла (жира), г.

Опыт 8 Омыление жиров

В фарфоровую чашечку поместите 0,5 мл касторового масла (жира) и 4 капли 35 %-ного раствора гидроксида натрия. Тщательно размешайте смесь стеклянной палочкой до получения однородной эмульсии и поставьте на песчаную баню. Продолжайте тщательно размешивать смесь до получения однородной прозрачной слегка желтоватой жидкости. Затем добавьте 2 мл дистиллированной воды и вновь нагрейте, тщательно перемешивая до полного удаления воды. В результате получается кусочек твердого белого мыла.

Опыт 9 Определение числа омыления

В 2 колбочки помещают: 1…0,5 г жира (навеска на аналитических весах), 2…0,5 мл воды. Затем в обе колбочки добавляют по 15 мл 0,5н спиртового раствора КОН. Колбочки закрывают пробками, соединенными с обратными холодильниками, и кипятят на водяной бане 30…40 минут.

После охлаждения в колбочки прибавляют по 15…20 мл воды, 3–4 капли раствора фенолфталеина и титруют 0,5н раствором соляной кислоты до исчезновения розового окрашивания.

Расчет числа омыления проводят по формуле:

Ч. о. = (V2 – V1) х 28 / m,

где Ч. о. – число омыления; V2 – объем (мл) раствора соляной кислоты, израсходованного на титрование контроля; V1 – объем (мл) раствора соляной кислоты, израсходованного на титрование пробы масла; m – навеска масла (г); 28 – масса КОН в 1 мл спиртового раствора.

Контрольные вопросы

1 Укажите правила техники безопасности при выполнении опытов.

2 Дайте определение и проведите классификацию липидов.

3 Укажите функции липидов в организме.

4 Особенности высших жирных кислот, входящих в состав липидов человека.

5 Приведите примеры качественных реакций, доказывающих непредельный характер ВЖК.

6 Напишите структурные формулы представителей простых и сложных липидов: ТАГ, фосфолипидов, холестерина.

7 Какие реакции лежат в основе омыления жира?

8 Какие числа характеризуют состав и строение липидов?

9 Перечислите компоненты, участвующие в переваривании жиров.

10 Значение ВЖК, холестерина в метаболических процессах.

3 Обмен веществ и энергии

Цель:

1 выявить взаимосвязь обмена веществ и энергии в процессе жизнедеятельности организма;

2 рассмотреть все реакции цикла Кребса.

Задания теста:

1 Метаболизм – это совокупность химических реакций, в результате которых происходит:

А Распад органических веществ в клетках до СО2 и Н2О

Б Трансформация энергии органических веществ в энергию макроэргических связей.

В Синтез структурно-функциональных компонентов клетки.

Г Использование энергии катаболических процессов для обеспечения функциональной активности организма.

2 Конечные продукты метаболизма:

А Аминокислоты

Б Н2О

В СО2

Г Глюкоза

Д Мочевина

3 Подберите к цифрам на рисунке соответствующие буквы:

Пищевые вещества

1

4 распад

Метаболиты структурно

функциональ-

ных

компонентов

2 3

5 7

энергия

Выделение 6 Синтез структурно -

конечных Функциональная функциональных

продуктов обмена активность компонентов

(СО2, Н2О, (активный транспорт веществ, клетки

мочевина) мышечная работа,

теплопродукция и др.)

А Эндергонические реакции (идущие с поглощением энергии)

Б Экзергонические реакции (идущие с выделением энергии)

В Пищеварение

Г Реакции катаболизма

Д Реакции анаболизма

Е Выделение конечных продуктов обмена веществ

Реакции цикла Кребса. Полное окисление ацетилкоэнзима А до Н2О и СО2 осуществляется мультиферментным ансамблем, обеспечивающим протекание серии реакций, которая называется циклом Кребса. За свое открытие ученый Г. Кребс в 1953 году стал нобелевским лауреатом. Цикл Кребса еще называют циклом лимонной кислоты или циклом ди - и трикарбоновых кислот.

1 стадия – реакция нуклеофильного присоединения ацетил коэнзима А по двойной связи карбонильной группы оксалоацетата, сопровождаемой О-В дисмутацией, на что указывает изменение степеней окисления атомов углерода. Образующийся цитрилкофермент А легко гидролизуется до цитрата (аниона лимонной кислоты) и коэнзима А

СОО -

| - ООС СН2СОО - Н2О

Н – СН2 – С = О + О = С С

| | НО СН2СО SКоА

SКоА СН2СОО-

ацетилкоэнзим А

- ООС СН2СОО -

С

НО СН2СОО - + SКоА

Цитрат коэнзим А

2 стадия заключается в изомеризации цитрата в изоцитрат, которая осуществляется путем последовательных реакций: дегидратации исходного цитрата и гидратация образующегося промежуточного продукта:

- ООС СН2СОО - - Н2О - ООССН2 Н Н2О

С С = С

НО СН2СОО - - ООС СОО-

Цитрат

- ООССН2

СН – СН – СОО -

|

- ООС ОН изоцитрат

3а стадия – дегидрирование (окисление) изоцитрата дегидрогеназой с окисленной формой кофермента НАД+ с образованием оксалосукцината:

- ООССН2 - ООССН2

СН – СН – СОО - + НАД+ СН – С – СОО - + НАД(Н) + Н+

| || в ЭТЦ для

- ООС ОН - ООС О образования 3-х

изоцитрат оксалосукцинат молекул АТФ

3б стадия – декарбоксилирование оксалоацетата в 2 оксалоглутарат в результате внутримолекулярной дисмутации:

-ООССН2

СН – С – СОО - + Н+ - ООССН2 – СН2 – С – СОО - + СО2 ↑

|| ||

- ООС О О

оксалосукцинат 2-оксалоглутарат

4 стадия является реакцией окислительного декарбоксилирования, происходящей под действием двух коферментов: НАД+ (окислитель) и НSКоА – и сопровождаемой межмолекулярной дисмутацией. На этом заканчивается этап окисления ацетильного остатка ацетилкофермента до СО2 и Н2О:

О SКоА

|| |

ООССН2 – СН2 – С – СОО - + НАД+ + НSКоА ООССН2 – СН2 – С + СО2↑ +

||

2-оксалоглутарат О

сукцинил -кофермент А

+ НАД(Н)

в ЭТЦ для

образования 3-х

молекул АТФ

5 стадия заключается в гидролизе сукцинил-кофермента А. это – экзэргоническая реакция, с которой сопряжен синтез одной молекулы АТФ:

СН2 – СОО - СН2 – СОО -

| + Н2О | + НSКоА ∆G= - 33 кДж/моль

СН2 – СОSКоА СН2 – СОО - энергия на синтез

одной молекулы АТФ

6 стадия является реакцией дегидрирования сукцината а фумарат дегидрогеназой с окисленной формой кофермента ФАД, сопровождаемой межмолекулярной дисмутацией:

СН2 – СОО - - ООС Н

| + ФАД С = С + ФАД(2Н)

СН2 – СОО - Н СОО - в ЭТЦ для

образования

сукцинат фумарат 2-х молекул АТФ

7 стадия заключается в присоединении воды по кратной межуглеродной связи с образованием исключительно L-малата (аниона оксиянтарной кислоты). Это реакция сопровождается внутримолекулярной дисмутацией:

Н

-ООС Н |

С = С + Н2О - ООС – С – СН2СОО -

|

Н СОО - ОН

Фумарат L-малат

8 стадия, сопровождаемая межмолекулярной дисмутацией, приводит к регенерации оксалоацетата за счет дегидрирования L-малата дегидрогеназой и окисленной формой кофермента НАД+:

Н

|

-ООС – С – СН2СОО- + НАД+ - ООС – С – СН2СОО- + НАД(Н) + Н+

| || в ЭТЦ для бразования

ОН О 3-х молекул АТФ

L-малат оксалоацетат

Образующийся оксалоацетат опять вступает в реакцию 1 стадии.

Лабораторная работа № 13 Обмен простых белков

Цель работы:

1 проследить при помощи хроматографии распределение аминокислот в соответствии с их растворимостью в органических растворителях,

2 практически наблюдать действие фермента желудочного сока пепсина, трипсина, липазы на разрыв пептидных связей и денатурацию белка.

3 выработать навыки обращения с химической посудой, реактивами;

4 ознакомить со способами утилизации отработанных реактивов;

5 привить навыки работы со справочной литературой и оформления отчета по лабораторной работе

Реактивы и оборудование: хроматографическая бумага, аланин, лейцин, глутаминовая кислота, чашка Петри, водонасыщенный раствор фенола, 0,1% спиртовой раствор нингидрина.

В организме белки распадаются до аминокислот, которые поступают к органам и тканям, где используются для биосинтеза белков, а также подвергаются различным превращениям. Часть аминокислот и их конечные продукты распада переносятся в кровь и в почки, а затем выделяются с мочой. Содержание аминокислот в крови является относительно постоянным и служит одним из показателей состояния белкового обмена в организме.

Хроматографический метод определения аминокислот. Разделение смеси аминокислот с помощью радиальной хроматографии

Этот метод был впервые предложен в 1903 г. русским ученым . В настоящее время он широко применяется для разделения и количественного определения белков, аминокислот, и многих других веществ в крови и в моче.

Он основан на различной способности аминокислот растворяться в органических растворителях.