Химико-токсикологическое исследование пароксетина (стр. 2 )

Методика была подвергнута валидационной оценке по следующим характеристикам: специфичность, прецизионность, предел обнаружения методики идентификации.

Идентификацию пароксетина проводили по времени удерживания, которое соответствовало времени удерживания его стандартного образца (Rt)=20,51±0,04 мин, а также с помощью библиотеки масс-спектров NIST 2.0, применяя систему обработки хромато-масс-спектральной информации АMDIS, со значениями m/z. Характерны пики с числом m/z -192, 138, 109.

Поскольку пароксетин назначается совместно с феназепамом и амитриптилином, нами была проверена специфичность методики по отношению к этим лекарственным препаратам.

Предел обнаружения определяли по методу «трех сигма». Согласно расчетам, предел обнаружения пароксетина на водных растворах составил 3,34мкг/мл. Были определены пределы обнаружения пароксетина методом ГХ/МС в биологических объектах: кровь - 4,49 мкг/мл, моча - 3,83 мкг/мл, печень - 4,62 мкг/мл, почки - 4,69 мкг/мл.

Таким образом, предложена методика идентификации пароксетина с помощью ГХ/МС, которая может быть использована в химико-токсикологическом анализе.

Разработка способов количественного определения пароксетина на водных растворах и в биологических объектах

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Расчет проводили по площади пика с использованием внешнего стандарта. Разработанную методику на водных растворах оценивали по следующим валидационным характеристикам: специфичность, линейность, правильность, прецизионность (повторяемость), предел количественного определения.

Специфичность методики определяли набором хроматограмм растворов стандартных образцов пароксетина и извлечений из модельной и контрольной проб биологических объектов (кровь, моча, печень, почки). Полученные результаты свидетельствуют о специфичности разработанной методики.

При оценке методики проводили проверку линейной зависимости величины отклика от количества определяемого вещества. Линейная зависимость наблюдается в интервале концентраций 0,008-1,0 мг/мл. Контроль линейной зависимости по каждому исследуемому объекту проводили путем расчета коэффициента корреляции, который составил 0,999, что позволяет использовать данную методику для количественного определения пароксетина в указанном диапазоне концентраций.

Для установления правильности методики готовили 9 растворов стандартных образцов пароксетина на трёх уровнях концентраций в трёх повторностях. Результаты определения свидетельствуют о том, что методика не отягощена систематической ошибкой, поскольку соблюдается неравенство tвыч. > tтабл..

Предел количественного определения рассчитывали методом «десяти сигма», он составил 13,83 мкг/мл пароксетина.

Метод газовой хроматографии

Разработанную методику количественного определения пароксетина на водных растворах методом ГХ оценивали по следующим валидационным характеристикам: специфичность, линейность, прецизионность (повторяемость), предел количественного определения.

Специфичность методики определяли набором хроматограмм растворов стандартных образцов пароксетина и извлечений из модельной и контрольной проб биологических объектов (кровь, моча, печень, почки). Полученные результаты свидетельствуют о специфичности разработанной методики.

При оценке методики проводили проверку линейной зависимости величины отклика от количества исследуемого вещества. Сначала выполняли проверку линейности, затем проводили регрессионный анализ данной зависимости в соответствии с соответствующим линейным уравнением.

Для этого строили график зависимости площади пика от концентрации пароксетина. Определение площади пиков проводили при хроматографировании спиртовых растворов, с концентрацией исследуемого вещества от 0,001 мг/мл до 16 мг/мл, охватывающих область действия методики, позволяющей количественно определить пароксетин.

Линейная зависимость наблюдается в интервале 0,мг/мл концентраций спиртового раствора пароксетина. Зависимость площади пика от концентрации описывается линейным уравнением y = 1052,9х + 1,057. Коэффициент корреляции составил 0,999, таким образом, методика является линейной. Предел количественного определения рассчитывали методом «десяти сигма», он составил 11,02 мкг/мл пароксетина.

2 Разработка методик изолирования пароксетина из водных растворов и биологических объектов

Изучение оптимальных условий экстракции пароксетина из водных растворов

Для оптимизации условий экстракции пароксетина применяли один из методов математического планирования эксперимента – «латинский квадрат», позволяющий получить достоверную информацию при значительном сокращении числа опытов и учесть одновременное влияние нескольких факторов на степень экстракции органическими растворителями.

В эксперименте изучали одновременное влияние на процесс экстракции пароксетина четырех факторов: природы органического растворителя (А), наличие электролита (В), значения рН среды (С), времени экстракции (D). В качестве экстрагентов использовали не смешивающиеся с водой свежеперегнанные растворители: хлороформ, этилацетат, диэтиловый эфир, гексан, смесь - гептан-дихлорэтан-изопропанол-хлороформ (32:23:10:35). Определенное значение рН среды в интервале 2,0-11,0 создавали с помощью универсальной буферной смеси (УБС) Бриттона-Робинсона. В качестве электролитов применяли натрия сульфат и натрия хлорид. Экстрагирование проводили в течение 3, 5, 7, 9, 11 минут.

Степень экстракции пароксетина в условиях эксперимента определяли с помощью метода УФ спектрофотометрии. Для измерения спектров готовили стандартные растворы пароксетина с концентрацией 0,01%. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре марки СФ-56 в кювете с толщиной слоя 1 см. Раствором сравнения служил соответствующий растворитель.

В результате эксперимента определены оптимальные условия экстракции пароксетина: экстрагент – экстрагент этилацетат, рН среды 9, электролит 5% раствор натрия хлорида, позволяющие извлечь его до 96,32%, продолжительность экстракции не оказывало значительного влияния.

Влияние указанных факторов необходимо учитывать при разработке методик изолирования пароксетина из биологических объектов при судебно-химическом и химико-токсикологическом анализах.

Изолирование пароксетина из биологических объектов

На основании проведенных исследований нами разработаны методики изолирования пароксетина из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки). Исследование проводилось на модельных смесях.

Затравленные модельные смеси биологических объектов (кровь - 10мл, моча – 10мл, печень -10г, почки – 10г) с содержанием пароксетина в пробе 3мг, 6мг и 9мг (исходя из графика линейности) оставляли на 24 часа при температуре окружающей среды 18˚С. Через сутки с полученными образцами проводили исследование.

Методика изолирования из биологических жидкостей (моча, кровь): к модельной пробе объёмом 10мл добавляли 15% хлористоводородную кислоту до рН 2-3. Смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут. После гидролиза полученную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 8 мл 50% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Через 5-10 минут надосадочную жидкость отфильтровывали в делительную воронку, добавляли 30% раствор натрия гидроксида до значения рН среды 9 по универсальному индикатору, электролит – 0,5г натрия хлорида и экстрагировали трехкратно этилацетатом (по 20 мл) в течение 5 минут. Полученные органические извлечения фильтровали через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривали в потоке теплого воздуха до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в 10 мл спирта этилового 96% и исследовали.

Методика изолирования из биологических органов (печень, почки): модельную пробу биологического объекта (печень, почки) массой 10 г измельчали и прибавляли спирт этиловый 96% до зеркала и доводили 10% щавелевой кислотой до рН 2-3 по универсальному индикатору. Затем настаивали 3 раза по 2 часа, каждый раз сливая надосадочную жидкость. Полученные извлечения упаривали при температуре 400С до густоты сиропа. Далее добавляли по каплям спирт этиловый 96% до прекращения выпадения осадка. Надосадочную жидкость упаривали досуха. Остаток растворяли в 25 мл горячей воды (600С) и охлаждали до комнатной температуры. К фильтрату добавляли 30% раствор натрия гидроксида до рН 9 по универсальному индикатору, затем добавляли электролит - натрия хлорид. Экстрагирование проводили трехкратно этилацетатом по 20 мл. Затем полученные извлечения центрифугировали в течение 5 минут при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, фильтровали через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривали до сухого остатка в потоке теплого воздуха. Сухой остаток растворяли в 10 мл спирта этилового 96% и исследовали.

Далее проводили идентификацию пароксетина в извлечениях из биологических объектов по разработанным ранее методикам с использованием методов ТСХ, хромогенных и микрокристаллоскопических реакций, ВЭЖХ, ГХ/МС. Проведенные исследования показали, что комбинированное использование разработанных методик позволяет надежно идентифицировать изучаемое лекарственное вещество.

Следующим этапом исследования явилось количественное определение пароксетина с помощью ранее разработанных методик (ВЭЖХ, ГХ) анализа и их валидация.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Были рассчитаны пределы количественного определения пароксетина методом ВЭЖХ в биологических объектах: кровь – 11,33 мкг/мл, моча – 9,54 мкг/мл, печень – 11,65 мкг/мл, почки – 11,45 мкг/ мл.

Для установления прецизионности методики анализировали модельные пробы биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) методом ВЭЖХ.

Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Результаты количественного определения пароксетина в модельных пробах крови, мочи, печени, почках методом ВЭЖХ

Объект	Внесено, мг в пробе	Найдено,	Метрологические характеристики
мг в пробе	%
Кровь (10мл)	3,0	2,60; 2,33; 2,13	86,56; 77,81; 71,11	=79,63% SD=8,13 RSD=8,44%
6,0	5,19; 4,37; 4,46	86,52; 72,88; 74,32
9,0	7,83; 7,72; 6,72	86,96; 85,81; 74,71
Моча (10мл)	3,0	2,75; 2,56; 2,34	91,76; 85,42; 78,03	=86,96% SD=6,14 RSD=6,38%
6,0	5,55; 4,76; 5,29	92,56; 79,31; 88,24
9,0	8,41; 7,65; 8,00	93,44; 84,98; 88,87
Печень (10г)	3,0	2,34; 1,86; 2,43	77,97; 62,00; 81,11	=72,61% SD=10,17 RSD=10,47%
6,0	3,81; 4,09; 4,91	63,47; 68,13; 81,87
9,0	7,11; 6,15; 6,45	78,95; 68,32; 71,69
Почки (10г)	3,0	2,18; 1,86; 2,21	72,57; 62,01; 73,68	=71,50% SD=10,45 RSD=10,77%
6,0	3,97; 4,94; 3,78	66,12; 82,34; 63,01
9,0	6,63; 6,03; 7,48	73,65; 66,98; 83,12

Разработанная методика позволяет количественно определить пароксетин в извлечениях из биологических объектов. Выход пароксетина из крови составил в среднем около 80%, из мочи – 87%, из печени – 73%, из почек– 72%. Относительное стандартное отклонение не превышает 10,77%.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности использования метода ВЭЖХ для количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических жидкостей (кровь, моча) и внутренних органов трупа (печень, почки).

Метод газовой хроматографии

Были рассчитаны пределы количественного определения пароксетина методом ГХ в биологических объектах: кровь – 8,91 мкг/мл, моча – 8,11мкг/мл, печень – 9,86 мкг/мл, почки – 10,0 мкг/мл.

Для установления прецизионности методики анализировали модельные пробы биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) методом ГХ. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 – Результаты количественного определения пароксетина в модельных пробах крови, мочи, печени, почках методом ГХ

Объект	Внесено, мг в пробе	Найдено,	Метрологические характеристики
мг в пробе	%
Кровь	3,0	2,50; 2,09; 2,22	83,32; 69,50; 73,84	=76,21% SD=7,13 RSD=7,41%
6,0	4,94; 4,19; 4,44	82,32; 69,85; 74,04
9,0	6,49; 7,51; 6,97	72,06; 83,48; 77,48
Моча	3,0	2,65; 2,25; 2,58	88,34; 75,01; 86,09	=83,67% SD=6,91 RSD=7,19%
6,0	5,34; 4,55; 5,15	89,04; 75,87; 85,78
9,0	8,13; 6,93; 7,71	90,32; 77,00; 85,61
Печень	3,0	2,35; 2,02; 1,92	78,20; 67,31; 63,86	=69,59% SD=9,46 RSD=9,78%
6,0	4,70; 3,80; 4,31	78,30; 63,29; 71,75
9,0	6,84; 5,39; 6,10	75,98; 59,87; 67,79
Почки	3,0	2,32; 1,75; 1,99	77,15; 58,45; 66,21	=68,26% SD=10,22 RSD=10,61%
6,0	4,64; 3,99; 3,74	77,25; 66,51; 62,28
9,0	6,97; 5,99; 5,63	77,43; 66,61; 62,44

Разработанная методика позволяет количественно определить пароксетин в извлечениях из биологических объектов. Выход пароксетина из модельных проб крови, мочи, печени и почек методом ГХ в среднем составил 76%, 84%, 70% и 68% соответственно. Относительное стандартное отклонение не превышает 10,61%.