Химико-токсикологическое исследование пароксетина (стр. 1 )

На правах рукописи

АПОЛЛОНСКАЯ ЯНА ЕВГЕНЬЕВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРОКСЕТИНА

14.04.02. – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата фармацевтических наук

Пятигорск-2012

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении

высшего профессионального образования

«Пятигорская государственная фармацевтическая академия»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:	доктор фармацевтических наук, профессор, Лазарян Джон Седракович
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:	, доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России, профессор кафедры фармакогнозии , доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО Пятигорский ГГТУ, заведующий кафедрой охраны окружающей среды и химии
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:	ГБОУ ВПО Алтайский ГМУ Минздравсоцразвития России

Защита состоится «29» мая 2012 года в 900 на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России ( Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России ( Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан «27» апреля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В медицине широко используется психотропное средство из группы антидепрессантов – пароксетин, которое активно применяется в клинической практике для лечения аффективных расстройств.

Наряду с терапевтическим эффектом пароксетин при передозировке, взаимодействии с другими лекарственными средствами, злоупотреблении, может привести к отравлениям, в том числе, со смертельным исходом.

Пароксетин в соответствии с приказом Минздрава России от 01.01.01 г. № 000 «Об утверждении учетной документации токсикологического мониторинга» (Приложение ) включен под торговым наименованием Паксил в «Перечень наименований токсичных веществ, наиболее часто встречающихся при острых отравлениях». В данном списке пароксетину согласно Международной классификации болезней (МКБ-10) присвоен код - Т50.9

В современных литературных источниках не достаточно освещены методики по изолированию и анализу пароксетина в биологических жидкостях, трупном материале. В связи, с этим разработка схем химико-токсикологического исследования биологических объектов на пароксетин является актуальной проблемой.

Химико-токсикологический анализ пароксетина позволяет своевременно диагностировать отравление (острое, смертельное).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методологического подхода к изолированию, обнаружению и количественному определению пароксетина для проведения химико-токсикологического анализа с использованием современных физико-химических методов.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

ü осуществить выбор оптимальных условий изолирования пароксетина из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки);

ü разработать методики обнаружения и количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов с помощью современных физико-химических методов;

ü апробировать разработанные методики на лабораторных животных;

ü предложить схему химико-токсикологического анализа пароксетина;

ü внедрить разработанные методики в работу химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий.

Научная новизна работы. Определены оптимальные условия экстракции пароксетина из водных растворов в зависимости от четырех факторов: природы органического растворителя, значения рН среды, наличия электролитов и продолжительности экстракции. Установлено, что на процесс изолирования пароксетина методом жидкость - жидкостной экстракции влияет значение рН среды, природа органического растворителя и наличие электролита.

Впервые обоснованы и разработаны методики изолирования пароксетина при химико-токсикологическом и судебно-химическом анализах биологических жидкостей (кровь, моча) и внутренних органов трупа (печень, почки).

Разработаны методики идентификации пароксетина в извлечениях из биологических объектов на основе химических методов (хромогенных и микрокристаллоскопических реакций) и современных физико-химических методов (ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ).

Разработаны методики количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) с помощью физико-химических методов: газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Разработанные методики апробированы на биологических объектах (кровь, моча, печень, почки) лабораторных животных (крыс) при введении токсических доз препарата, тем самым было показано определение пароксетина при отравлениях.

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования.

Разработанная схема химико-токсикологического анализа пароксетина позволяет достоверно диагностировать факт отравления и оценить его степень.

По материалам исследования подготовлено и утверждено Ученым советом ФГУ «Российский Центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России (протокол №3 от 01.01.2001 года) Информационное письмо «Химико-токсикологическое исследование пароксетина», которое рекомендовано к использованию в химико-токсикологических лабораториях и Бюро СМЭ Российской Федерации.

Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 64-й, 65-й и 66-й конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них одна в ведущем научном журнале, рекомендованном ВАК России.

Основные положения, выносимые на защиту.

· выбор условий экстракции пароксетина из водных растворов с учетом влияния следующих факторов: значения рН среды, природы органического растворителя, присутствия электролита и продолжительности экстракции;

· разработка методик изолирования пароксетина из биологических жидкостей (кровь, моча) и биологического материала (печень, почки);

· способы идентификации и количественного определения пароксетина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки);

· схема химико-токсикологического исследования пароксетина в биологических объектах (кровь, моча, печень, почки);

· апробация разработанных методик на лабораторных животных (крысах).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 110 страницах печатного текста, и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка литературы. В диссертации приводится 25 рисунков и 27 таблиц. Библиографический указатель включает 130 источников, из них 39 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Схема анализа пароксетина включает предварительное исследование с помощью метода ТСХ и подтверждающее исследование – хромогенными и микрокристаллоскопическими реакциями, методами ГХ/МС ВЭЖХ. Количественное определение пароксетина проводили методами ВЭЖХ и ГХ. Разработка методик изолирования, анализа и их валидация проводились на модельных пробах биологических объектов (кровь, моча, печень, почки).

1 Разработка методик идентификации пароксетина

Метод хроматографии в тонком слое сорбента

Обнаружение пароксетина методом хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) проводили по следующей методике: на линию старта хроматографической пластины с помощью микрошприца для тонкослойной хроматографии наносили по 2 мкл 1% раствора пароксетина. После удаления органического растворителя пластины хроматографировали в исследуемых системах растворителей.

Специфичность полученных результатов подтверждали при хроматографировании феназепама и амитриптилина (препаратов совместно применяемых в лечебной практике с пароксетином) в разработанных для пароксетина хроматографических системах.

Хроматографирование проводили в следующих системах растворителей:

- S1: бензол-диоксан-25% раствор аммиака (60:35:5);

- S2: этанол-25% раствор аммиака (100:1,5)

- S3: диоксан:бутанол: 25% раствор аммиака

Значения Rf исследуемых лекарственных веществ в предложенных системах растворителей представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Величины Rf исследуемых веществ

Исследуемое вещество	Система растворителей / значение Rf
S1	S2	S3
Пароксетин	0,50±0,01	0,36±0,02	0,49±0,01
Феназепам	0,65±0,03	0,80±0,02	0,65±0,02
Амитриптилин	0,82±0,01	0,64±0,03	0,32±0,01

Детекцию зон адсорбции осуществляли путем просмотра хроматографических пластин в УФ свете при длине волны 254 нм и с последующей обработкой хроматограммы реактивом Драгендорфа. Пределы обнаружения исследуемых лекарственных веществ представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Пределы обнаружения исследуемых веществ

Проявители	Предел обнаружения, мкг в пробе
пароксетин	феназепам	амитриптилин
УФ свет	3,0	3,0	3,0
Реактив Драгендорфа	3,0	2,0	2,0

Предложенные системы растворителей позволяют достаточно четко разделить пароксетин с каждым из исследуемых веществ, а также разделить анализируемые вещества от соэкстрактивных компонентов крови, мочи, печени и почек.

Таким образом, методика разделения и обнаружения изучаемых веществ методом ТСХ может быть использована в химико-токсикологическом исследовании при направленном анализе, а также для их идентификации при комбинированных отравлениях.

Хромогенные реакции

Несмотря на широкое использование в практике работы судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий физико-химических методов анализа для обнаружения и идентификации лекарственных веществ при отравлениях в извлечениях из биологических объектов, использование хромогенных реакций не утратило своего значения.

Исследование проводили при температуре окружающей среды 25±2ºС. Наблюдали окрашивание с азотной кислотой концентрированной, серной кислотой концентрированной, реактивом Эрдмана и Манделина, чувствительность составила 1,2; 0,6; 1,2 и 0,6 мкг в пробе соответственно. В результаты хромогенных реакций проявляется специфическая окраска, поэтому они могут быть использованы в его химико-токсикологическом анализе. Эти реакции были использованы для обнаружения пароксетина в извлечениях из мочи.

На основании вышеописанного можно предложить использовать хромогенные реакции при анализе как биологической жидкости (мочи) при остром отравлении пароксетином, так и вещественного доказательства (в виде лекарственного препарата).

Микрокристаллоскопические реакции

Микрокристаллоскопический метод широко используется в химико-токсикологическом анализе ввиду простоты выполнения, высокой чувствительности и возможности в большинстве случаев исключить громоздкие операции.

Исследование проводили при температуре окружающей среды 25±2ºС. Образовались характерные для пароксетина кристаллы с 0,2% раствором метилового оранжевого в 0,01 М растворе натрия гидроксида (0,8 мкг в пробе); а также в присутствии 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты с реактивами: 0,2% водным раствором метилового оранжевого (0,8 мкг в пробе), калия (III) феррацианидом (0,5 мкг в пробе), 15% раствором кадмия йодида (0,5 мкг в пробе).

На основании проведенных исследований можно предложить использовать микрокристаллоскопические реакции при анализе как биологической жидкости (мочи) при отравлении пароксетином, так и вещественного доказательства (в виде лекарственного препарата).

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Анализ пароксетина методом ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» производства г. Новосибирск. Исследование пробы осуществляли на хроматографической колонке размером 2х75 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом “Силасорб С18”. В качестве элюента А применяли 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент Б – ацетонитрил. Хроматографирование проводили в градиентном режиме от 10% элюента Б до 70% за 24 минуты. Скорость подачи подвижной фазы составляло 100 мкл/мин, время измерения – 0,18 сек, температура термостата колонки - 35°С, объем вводимой пробы 10мкл.

Идентификация пароксетина осуществляли по времени удерживания 16,56± 0,05 мин (таблица 6) при длине волны 294 нм, соответствующей максимуму поглощения раствора пароксетина в элюенте.

Методика идентификации пароксетина методом ВЭЖХ была подвергнута валидационной оценке по следующим характеристикам: прецизионность, специфичность, предел обнаружения.

Для определения прецизионности методики идентификации пароксетина проводилась оценка метрологических характеристик его времени удерживания (таблица 3).

Таблица 3 - Результаты хроматографирования пароксетина методом ВЭЖХ

Время удерживания (мин)	Метрологические характеристики
16,63; 16,52; 16,55; 16,53; 16,50; 16,62	=16,56; SD= 0,05; RSD=0,3%

Время удерживания составляет 16,56 ± 0,05 мин, что соответствует времени удерживания стандартного образца пароксетина.

Относительное стандартное отклонение определения времени удерживания пароксетина при данных условиях хроматографирования составляет 0,3%, что свидетельствует о высокой воспроизводимости данной методики.

Поскольку пароксетин назначается совместно с феназепамом и амитриптилином, нами была проверена специфичность методики по отношению к этим лекарственным препаратам. Время выхода феназепама и амитриптилина при хроматографировании составляет 13,07 и 18,15 минут соответственно. Коэффициент разделения для пиков пароксетина и феназепама составил 5,94, а для пиков пароксетина и амитриптилина – 4,61, что подтверждает разделение исследуемых лекарственных веществ.

Предел обнаружения определяли по методу «трех сигма», он составил 4,19мкг/мл.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности использования метода ВЭЖХ для обнаружения пароксетина в извлечениях из биологических объектов при отравлениях пароксетином как индивидуально, так и при сочетанном применении с феназепамом и амитриптилином.

Метод хромато-масс-спектрометрии

Методика обнаружения пароксетина методом ГХ/МС состояла в следующем: хроматографировали на газовом хроматографе №5860/5973, фирмы «Agilent Technologi», оснащенном ПИД и капиллярной колонкой НР-1 размерами 30 м - 0,32мм (внутренний диаметр) - 0,25 мкм (толщина неподвижной фазы). Температуру колонки программировали от 01.01.01С, температура детектора составляет 2700С. Ввод автоматический. Объем пробы - 1мкл, режим Splitless.