Принципы использования бактериофагов для борьбы с инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи (стр. 1 )

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Национальная ассоциация специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи

Северо-Западный Государственный медицинский университет

им.

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Первый Московский государственный медицинский университет им.

Кемеровская государственная медицинская академия

Принципы использования бактериофагов для борьбы с инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи

Методические рекомендации

Москва

2014

УДК 616-036.22:614.2:576.858.9(07)

ББК 51.9я7

Принципы использования бактериофагов для борьбы с инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи

Москва, 2014 – ХХ с.

Авторский коллектив:

, ,

Разработчики:

ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени » Министерства здравоохранения Российской Федерации,

ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»,

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. » Министерства здравоохранения Российской Федерации,

ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

В методических рекомендациях изложены основные принципы использования бактериофагов для борьбы с инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Предназначены для специалистов бактериологических лабораторий и врачей различных специальностей, работающих в хирургических, урологических, травматологических, гинекологических, ожоговых, терапевтических, педиатрических стационарах и отделениях реанимации и интенсивной терапии для взрослых и детей.

© Коллектив авторов, 2014

Настоящие методические рекомендации содержат

· описание методов определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам (спектра литической активности бактериофагов), методы определения количества (титра) бактериофагов, рекомендуемые для применения в микробиологических лабораториях;

· принципы использования бактериофагов для лечения инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в различных стационарах.

Методические рекомендации предназначены для специалистов бактериологических лабораторий, выполняющих работы с бактериофагами и микроорганизмами 3-4 групп патогенности; для врачей различных специальностей, работающих в хирургических, урологических, травматологических, гинекологических, ожоговых, терапевтических, педиатрических стационарах и отделениях реанимации и интенсивной терапии для взрослых и детей.

Содержание

Введение	5
Актуальность ИСМП	5
Резистентность возбудителей ИСМП к антибактериальным препаратам	6
Бактериофаги в эпоху антибиотикорезистентности	7
Бактериофаги как факторы эволюции бактерий	9
Работа с бактериофагами в лабораторных условиях	12
Принципы применения бактериофагов для лечения ИСМП	23
Приложение	35
Литература	37

Введение

Инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), представляют собой чрезвычайно актуальную проблему современного здравоохранения. Спектр средств лечения и профилактики инфекционных заболеваний, в том числе ИСМП, постепенно суживается в связи с глобальным ростом устойчивости возбудителей ИСМП к антибактериальным препаратам (АБП). В этой связи, одной из первостепенных задач является разработка и применение дополнительных средств лечения и профилактики инфекционных заболеваний, в качестве которых могут выступать бактериофаги.

Необходимо отметить, что система применения бактериофагов, как и любых (АБП), должна строиться на рациональных принципах. Слабовирулентные (умеренные) варианты фагов могут играть существенную роль в эволюции бактерий, способствуя приобретению ими факторов вирулентности. В связи с этим, бактериофаги, применяемые для лечения ИСМП, должны быть исключительно вирулентными.

Для обеспечения такого подхода литическая активность назначаемых для лечения препаратов бактериофагов должна быть обязательно проверена в бактериологической лаборатории.

Актуальность ИСМП

Национальная Концепция профилактики (ИСМП) ставит стратегической задачей здравоохранения обеспечение эпидемиологической безопасности организации лечебно-диагностического процесса, которая является неотъемлемым требованием оказания качественной медицинской помощи [1].

ИСМП являются одной из самых актуальных проблем современного здравоохранения в силу широкого распространения, негативных последствий для здоровья пациентов, персонала и экономики государства. ИСМП поражают 5-10% пациентов, находящихся в стационарах, и занимают десятое место в ряду причин смертности населения.

В Российской Федерации, по данным официальной статистики, ежегодно регистрируется примерно 30 тыс. случаев ИСМП (≈ 0,8 на 1 000 пациентов), однако их истинное число составляет не менее 2-2,5 млн. человек.

Пациенты с ИСМП находятся в стационаре в 2-3 раза дольше, чем аналогичные пациенты без инфекции. Это повышает стоимость лечения в 3-4 раза и риск летального исхода в 5-7 раз. Эти инфекции значительно снижают качество жизни пациента, приводят к потере репутации учреждения здравоохранения. Экономический ущерб от ИСМП в РФ может достигать как минимум, 10-15 млрд. рублей в год.

Резистентность возбудителей ИСМП к антибактериальным препаратам

В настоящее время во всем мире отмечается глобальная тенденция к росту устойчивости бактерий к АБП. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) заявляет, что многие открытия в области медикаментозного лечения, сделанные в 20 веке, могут потерять свою значимость из-за устойчивости к АБП. В результате этого многие инфекционные болезни могут выйти из-под контроля [2].

В то время как существующие АБП теряют свою эффективность, в разработке новых препаратов наблюдается упадок. При сохранении этой тенденции арсенал средств для борьбы с устойчивыми микроорганизмами может быть скоро исчерпан.

Наряду с ростом устойчивости большинства возбудителей инфекционных заболеваний, угрожающие масштабы приобретает развитие антибиотикорезистентности и у возбудителей ИСМП. Устойчивость к АБП развивается у многих ведущих возбудителей ИСМП, таких как Staphylococcus aureus (MRSA - метициллин-устойчивый S. aureus), Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis, (VRE - ванкомицин-резистентные штаммы ентерококков) Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae, вырабатывающие бета-лактамазы широкого и расширенного спектра, и ряд других микроорганизмов [2].

По мнению экспертов, при сохранении нынешней тенденции, через 20 лет ситуация в борьбе с инфекционными заболеваниями может стать такой же, какой была до открытия антибиотиков. В этой связи ВОЗ и органы здравоохранения во всем мире привлекают внимание к срочной необходимости решения проблемы лекарственной устойчивости, призывая, в том числе, всемерно поддерживать усилия ученых по разработке принципиально новых решений для борьбы с инфекционными заболеваниями в условиях прекращения разработок новых антибиотиков многими фармацевтическими компаниями.

Бактериофаги в эпоху антибиотикорезистентности

В сложившихся условиях одним из эффективных компонентов борьбы с формирующейся антибиотикорезистентностью может явиться разработка альтернативных АБП. В качестве таких препаратов могут выступать бактериофаги.

Бактериофаг (бактерии + греч. phagos - пожирающий; синоним: фаг, бактериальный вирус) - вирус, избирательно поражающий бактерии. Специфичность фагов лежит в основе их наименования по видовым или родовым названиям чувствительных к ним бактерий. Так, например, существует бактериофаг стафилококковый, стрептококковый, сальмонеллезный, коли-протейный, синегнойный и др.

Бактериофаги широко распространены и являются природными ограничителями распространения бактерий. В этой связи, интерес к их применению в профилактике и лечении бактериальных инфекций, в том числе ИСМП, выглядит абсолютно оправданным.

История использования бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний начинается вскоре после их открытия независимо друг от друга Ф. Туортом и Ф. д'Эреллем в 1915г. и 1917г., соответственно, и практически параллельно с началом их глубокого изучения. Начиная с 20-х годов 20 века, в течении более чем 20 лет велись интенсивные исследования в отношении клинического применения бактериофагов для лечения различных инфекционных заболеваний. Имеются различные данные об успешном применении фагов в отношении дизентерии, брюшного тифа, паратифов, холеры.

Наряду с решением проблем борьбы с традиционными бактериальными инфекционными заболеваниями, бактериофаги с успехом применялись и продолжают применяться и для лечения различных ИСМП, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Широкое применение бактериофаги нашли в лечении внутрибольничных инфекций различной локализации. Бактериофаг применялся местно, парентерально и перорально при лечении гнойных процессов мягких тканей, при остеомиелитах, нагноительных заболеваниях легких и плевры, при лечении ожоговых ран [3, 4, 5, 6].

Вскоре после открытия АБП, которые на тот момент показались более эффективным и простым средством в лечении бактериальных инфекций, фаготерапия отступила на второй план. Однако в настоящее время, учитывая глобальную тенденцию к росту антибиотикорезистентности, использование бактериофагов для борьбы с инфекционными заболеваниями вновь начинает набирать значительный интерес во всем мире. Помимо России, имеющей самый богатый опыт применения лечебных и терапевтических бактериофагов, изучением возможностей фаготерапии в лечении инфекционных болезней занимаются исследователи в Грузии, США, Англии, Польше и других странах [7, 8, 9, 10].

В настоящее время российская медицинская промышленность производит препараты бактериофагов для борьбы с инфекционными заболеваниями, вызванными патогенными и условно-патогенными возбудителями [11]. Производство препаратов фагов должно базироваться на ряде критериев [12]:

· препараты должны включать строго вирулентные бактериофаги;

· препараты не должны взаимодействовать с представителями нормальной флоры человека;

· фаги должны воспроизводиться в клетке-хозяине с высоким выходом активных частиц;

· фаги должны сохранять литическую активность при длительном хранении.

Успех фаготерапии напрямую зависит от эффективности применяемых препаратов. Одним из важнейших ключевых критериев успешной фаготерапии является использование исключительно высоковирулентных бактериофагов, обладающих полным лизисом бактерии – возбудителя инфекционного заболевания.

В этой связи необходимо отметить, что бактериофаги по характеру взаимодействия с бактериальной клеткой бывают вирулентными и умеренными. Взаимодействие вирулентного фага с бактериальной клеткой протекает в несколько этапов и обычно заканчивается лизисом (гибелью) последней и выходом из лизированной клетки новых зрелых фагов в окружающую среду.

Умеренные фаги, в отличие от вирулентных, не вызывают быстрой гибели бактериальных клеток и при взаимодействии с ней переходят в особую форму, называемую профагом. В отличие от генома вирулентного фага, функция которого определяет активную репродукцию, профаг воспроизводится как часть бактериальной ДНК и синхронно с ней реплицируется. Бактериальные клетки, содержащие в своем геноме профаг, называются лизогенными. Одной из особенностей лизогенных бактерий является приобретенная ими устойчивость к последующему инфицированию аналогичным фагом. Лизогенизация бактерий лежит в основе фаговой или лизогенной конверсии, наблюдаемой у бактерий.

Благодаря данному феномену, бактериофаги играют чрезвычайно важную роль в эволюции бактерий и приобретении ими принципиально новых свойств, например, способности продуцировать токсины, изменять морфологические или антигенные свойства и др.

Бактериофаги как факторы эволюции бактерий

Исследования генетической структуры микробов и бактериофагов показали древние взаимосвязи между ними. Фаги способствуют формированию генетического разнообразия бактерий [13,14]. Бактериофаги могут осуществлять горизонтальный генетический обмен между штаммами микробов путём лизогенной конверсии либо трансдукции.

Феномен фаговой трансдукции (когда бактериофаги переносят бактериальную ДНК между микробами) описан у многих бактерий [14, 16].

Известно множество случаев передачи бактериофагами генов устойчивости к антибиотикам между микробами. Например, бактериофаги Proteus mirabilis способны к передаче микробу свойств устойчивости к канамицину и амициллину [17]. Бактериофаги метициллинорезистентных штаммов Staphylococcus aureus способны к передаче генов устойчивости к пенициллину и тетрациклину [18]. У энтерококков бактериофаги способны переносить гены устойчивости к тетрациклину и гентамицину [15].

В ходе лизогенной конверсии происходит изменение свойств бактериальной клетки непосредственно вследствие заражения ее умеренным бактериофагом. Некоторые профаги передают бактериям гены, повышающие способность микробов к адаптации к условиям окружающей среды, играя, тем самым, важную роль в их эволюции. Лизогенизируя бактерию, умеренные фаги встраивают свой геном как профаг в бактериальную хромосому. У многих бактерий профаги представляют значительную часть их ДНК, приобретенную в ходе горизонтального генетического обмена [14].

Известна роль бактериофагов в формировании патогенных свойств у штаммов возбудителей инфекционных заболеваний у человека. В настоящее время известно, что множество факторов патогенности у бактерий закодировано профаговыми генами. У некоторых бактерий (V. cholerae, C. diphtheriae и C. botulinum) токсины, играющие ведущую роль в патогенезе и вызывающие характерные симптомы инфекционного заболевания, обусловлены профагами [19].

Другие микробы (S. aureus, S. pyogenes, S. enterica serovar Typhimurium, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris и Proteus mirabilis) содержат множество профагов. Каждый из закодированных профагами факторов патогенности вносит вклад в способность к паразитизму лизогенизированной бактерии в организме человека [13, 14].

Помимо переноса генов вирулентности фаги способны также индуцировать точечные мутации в геномах бактерий [13, 14].

Актуальность проблемы изучения генетической структуры микробов диктует необходимость углубленного изучения свойств различных профагов у бактерий – возбудителей ИСМП. В исследованиях авторов данных методических рекомендаций был проведен поиск фагоопосредованных генов вирулентности у штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, выделенных от пациентов различных стационаров [21-23].

Так, были изучены клинические изоляты Pseudomonas spp., выделенные в различных стационарах, на присутствие следующих фагоопосредованных факторов вирулентности: гена ctx (кодирует продукцию цитотоксина), генов PLES06181 (отвечает за формирование оболочки хвоста и продукцию пиоцина R2), PLES08021 (отвечает за синтез белка, участвующего в репликации ДНК DnaC) и PLES25621 (является гомологом профага D3, вероятно кодирует продукцию литического фермента), а также гена EXOU (кодирует синтез цитотоксина, инъекция которого в клетку хозяина осуществляется через систему секреции III типа).

Среди исследованных штаммов Pseudomonas spp., ген ctx был выявлен у 43,3% псевдомонад. Ген PLES06181 был выявлен у 89,1%, ген EXOU был выявлен у 81% штаммов, что характеризует высокую распространённость данных гена в популяции паразитов, циркулирующих в стационарах.

Выделенные от пациентов урологических отделений изоляты E. coli были исследованы на присутствие генов фагоопосредованных факторов вирулентности, в частности, профагового гена c2418 (ген ассоциированной с островом патогенности профаговой интегразы), экспрессирующегося преимущественно у уропатогенных кишечных палочек. Данный ген был обнаружен у 78,3% кишечных палочек. Ген cdt1 (кодирует цитолетальный токсин набухания) был обнаружен у 23,5% штаммов кишечных палочек.

Таким образом, было показано, что профаговые гены широко распространены среди циркулирующих в различных стационарах возбудителей инфекционных заболеваний.

Для некоторых профаговых генов была показана взаимосвязь между наличием гена и проявлением патогенных свойств возбудителей инфекции. Например, была выявлена сильная степень ассоциации между наличием у штаммов E.coli гена c2418 и проявлением полиантибиотикорезистентности.

Кроме того, было установлено, что среди штаммов E.coli возбудителей внутрибольничных инфекций мочевыводящих путей (ИМП) распространение штаммов с фагоопосредованным фактором c2418 значительно выше, по сравнению со штаммами без фагоопосредованного фактора.

Также была показана сильная корреляционная взаимосвязь между кумулятивной инцидентностью ИМП, обусловленных E. coli, и частотой выделения штаммов E. coli с наличием гена c2418 в динамике, что может свидетельствовать о влиянии наличия гена c2418 у штаммов E. coli на активизацию эпидемического процесса ИМП, обусловленного данным микробом.

Результаты собственных исследований и данные из мировой литературы констатировать, что профаговые гены вирулентности широко распространены в популяциях бактерий – возбудителей инфекционных болезней человека. Зачастую прослеживается выраженная связь между наличием у штамма профагового гена и патогенностью микроба, его склонностью к эпидемическому распространению.

Таким образом, взаимодействие между умеренным бактериофагом и микробом может привести к появлению у бактерии генов вирулентности, что способствует повышению способностей микроба к паразитизму в организме человека. При приобретении штаммом повышенной вирулентности и устойчивости к условиям госпитальной среды микроб обретает способность к формированию клональных линий, склонных к широкому эпидемическому распространению.

Следует отметить, что в случаях взаимодействия микроба и бактериофага, не являющегося высоковирулентным по отношению к данной бактерии, возможна реализация описанных выше явлений, ведущих к формированию высоковирулентного штамма.

В этой связи становится понятным, что применение невирулентных (умеренных) бактериофагов для лечения и профилактики инфекций, в том числе ИСМП, абсолютно недопустимо. Следовательно, основным критерием эффективной фаготерапии является применение исключительно высоковирулентных бактериофагов.

Поэтому при использовании бактериофагов в лечебных целях необходим микробиологический контроль, показывающий эффективность бактериофага в каждом конкретном случае.

РАБОТА С БАКТЕРИОФАГАМИ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

Перед назначением препарата бактериофага, для решения вопроса о чувствительности к нему возбудителя, необходимо проводить оценку литических свойств фага в лабораторных условиях.

В бактериологических лабораториях проводятся исследования по определению спектра литической активности вирулентных бактериофагов, количества бактериофагов в объектах окружающей среды как санитарно-показательных микроорганизмов, и реже – определение активности (титра) бактериофагов, используемых в качестве лекарственных препаратов, в отношении чувствительных к нему микроорганизмов.

В ходе научных исследований в лабораторных условиях могут быть использованы методы искусственной трансдукции и лизогенизации для подтверждения гипотез о влиянии умеренных бактериофагов на приобретение новых свойств штаммами, в том числе возбудителями ИСМП.

Определение чувствительности микроорганизмов к бактериофагам проводят при необходимости их использования в комплексном лечении или в профилактических целях. Определение чувствительности неизвестной культуры к известному бактериофагу кроме этого может быть использовано в практике работы лаборатории клинической микробиологии для:

· фагодифференцировки – идентификации бактерий по их чувствительности к известному фагу;

· фаготипирования – внутривидового типирования бактерий по их чувствительности к типовым бактериофагам;

· идентификации рода микроорганизма;

По результатам исследования чувствительности микроорганизмов к бактериофагам выдают ответ о наличии или отсутствии чувствительности конкретного микроорганизма, выделенного из биоматериала конкретного пациента, к испытуемому бактериофагу с указанием его производителя, даты выпуска и номера серии.

Изучение спектра литического действия бактериофагов и их активности проводят в лабораторных условиях, соблюдая правила биологической безопасности и требования к организации и проведению данных работ для предотвращения контаминации бактериофагами помещений и оборудования лабораторий.

Литическая инертность вирулентных бактериофагов может быть связана с узким спектром литической активности самого бактериофага или с атипичными свойствами типируемой бактериальной культуры.

Требования к организации работы

Противоэпидемический режим работы лаборатории должен быть обеспечен в соответствии с:

· Санитарно-эпидемиологическими правилами «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» СП 1.3.2322-08;

· Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2518-09 – «Дополнения и изменения N 1 к санитарно-эпидемиологическим правилам «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» СП 1.3.2322-08;

· Санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» СанПиН 2.1.7.2790-10;

· Руководством Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях».

Требования к проведению работ

· Не допускается проведение работ, связанных с бактериофагами, в помещениях, где осуществляются культуральные работы по накоплению биомассы биологических агентов 3-4 групп патогенности и генно-инженерные работы, в том числе получение и выделение рекомбинантных генетических конструкций.

· Допуск персонала к работе с бактериофагами в лаборатории осуществляется в порядке, регламентированном действующими санитарными правилами проведения работ с микроорганизмами 3-4 групп патогенности.

· По окончанию работы с бактериофагами и микроорганизмами 3-4 групп патогенности все объекты (рабочее место и другие рабочие поверхности) подвергают дезинфекции.

· Лаборатория, проводящая работу с бактериофагами, должна иметь контрольные (эталонные) штаммы микроорганизмов, на которых проверяют активность бактериофагов.

Методические приемы, используемые в микробиологических лабораториях при работе с бактериофагами

Методика определения чувствительности бактерий к бактериофагам (определение спектра литической активности бактериофагов)

Основные этапы проведения тестирования

Оценка чувствительности микроорганизмов к бактериофагам включает последовательное выполнение нескольких этапов лабораторной работы:

· Приготовление питательных сред;

· Приготовление суспензий исследуемых микроорганизмов;

· Посев микроорганизма на питательные среды и последующее нанесение бактериофагов;

· Инкубация;

· Учет и интерпретация результатов, формулировка заключения по чувствительности конкретного микроорганизма к действию конкретного бактериофага.

Питательные среды

Используются стандартные питательные среды. В зависимости от вида типируемого микроорганизма, выбирают питательные среды, на которых исследуемый микроорганизм через минимальное для данного вида время инкубации при оптимальной температуре дает хороший, видимый глазом рост. Питательная среда готовится из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду разливают в стерильные чашки Петри любого диаметра (60 –мм и др.), в зависимости от объема исследования. Среда разливается в чашки слоем не более 4 мм. Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания и подсушивания для того, чтобы хорошо впитывался фаголизат и испарился конденсат. Неиспользованные чашки с агаром хранят в условиях холодильника при +4 – +80С. Допускается использование чашек с готовой питательной средой, расфасованных в чашки производителем.

Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов

Необходимым условием для любых методов тестирования микроорганизмов является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма. Для определения чувствительности бактерий к бактериофагам, желательно, чтобы концентрация микроорганизмов в инокуляте составляла 1,5´108 КОЕ/мл, как и при определении чувствительности к АБП. Приготовление инокулята осуществляется в соответствии с МУК 4.12.1890-04. Бактериальную суспензию можно готовить как из бульонной, так и из агаровой культуры.

Посев бактериальной культуры на агаризованную питательную среду

На сухую поверхность питательной среды наносят бактериологической петлей или пипеткой бактериальную культуру. Культура может быть засеяна газоном на всю чашку или на сектор или в виде капли. В зависимости от объема исследования, на одну чашку Петри секторально могут быть засеяны несколько (но не более четырех) бактериальных культур.

Через несколько минут после подсыхания культуры на поверхность каждого сектора с засеянными бактериальными культурами наносят капли исследуемого бактериофага (при нанесении фага не следует касаться поверхности агара).

При необходимости определения чувствительности к нескольким фагам капли фагов должны располагаться на расстоянии, исключающем слияние капель.

Для нанесения фагов удобно использовать пастеровские пипетки, шприцы с иголками, капельницы. Не следует закрывать и переворачивать чашки, пока капли фага не впитаются в агар.

При определении чувствительности энтеробактерий одновременно к нескольким фагам, во избежание слияния зон лизиса, рекомендуется осуществлять посев тестируемой культуры в виде отдельных, не смыкающихся между собой штрихов по числу тестируемых фагов. Капля каждого фага наносится в середину отдельного штриха.

При необходимости определения чувствительности стафилококков к одному бактериофагу, допускается нанесение капли фага на чашку, используемую для определения чувствительности к антибактериальным препаратам в соответствии с МУК 4.12.1890-04, уменьшив число накладываемых дисков до 5.