Правильность и воспроизводимость разработанных методик оценивали с помощью критерия Стьюдента и критерия Фишера, соответственно. Результаты статистической обработки показали, что различие между дисперсиями статистически незначимо (Fрассч<Fтабл=15,98 при Р=99%), причем воспроизводимость метода кулонометрического титрования несколько лучше метода титрования по НД. Сравнивая рассчитанные значения критерия Стьюдента с табличным при Р=99% и f=8 (tрассч < tтабл =3,50), очевидно, что различие между средними статистически незначимо. Метод кулонометрического титрования не содержит систематической ошибки.
Проведена валидационная оценка методики количественного определения верапамила гидрохлорида по показателям: специфичность, линейность и аналитическая область методики, правильность и воспроизводимость в соответствии с требованиями ОФС «Валидация фармакопейных методов».
Специфичность предложенной методики подтверждается методом «введено»−«найдено» (табл. 6). Величины относительного стандартного отклонения (меньше 0,02) свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки. Линейность и аналитическую область методики проверяли путем статистической обработки выборки, полученной в результате количественного определения 7 модельных проб на 7 уровнях концентрации в диапазоне 70-130% от количества верапамила гидрохлорида, принятого за 100% (250 мкг в одной аликвоте). Исследование зависимости между количеством электричества и массой верапамила гидрохлорида показало, что она имеет линейный характер и описывается уравнением: y=a+bx, где a=(0±6)×10-4, b=(39,4±0,2)×10-5. Рассчитанное значение коэффициента линейной корреляции составляет 0,99992. Правильность и воспроизводимость предлагаемой методики оценивалась сравнением с методикой, рекомендуемой НД, по результатам 6 определений при анализе 100% концентрации. Используя критерий Фишера, сравнивали оба метода по воспроизводимости. Поскольку Fрассч = 6,57 < Fтабл= 10,97 при Р=99%, можно заключить, что различие между дисперсиями статистически незначимо. Дисперсии однородны. Методы сравнимы по воспроизводимости. Для оценки правильности предложенной методики рассчитывали критерий Стьюдента tрассч=0,25 < tтабл=3,17 при Р=99% и f=10. Результаты эксперимента не отягощены систематической ошибкой, и метод кулонометрического титрования валиден по показателям специфичность, линейность и аналитическая область методики, правильность и воспроизводимость.
На основании полученных результатов предложены методики количественного определения исследуемых веществ в лекарственных формах. С помощью модельных смесей установлено, что вспомогательные компоненты таблеточной массы, растворов для инъекций и суппозиторной основы не мешают определению действующего вещества. Найденные значения входят в норму допустимых отклонений содержания действующего вещества в различных лекарственных формах: таблетках верапамила гидрохлорида по 0,04 и 0,08 г, таблетках нитроксолина по 0,05 г, суппозиториях «Анестезол», с содержанием анестезина 0,1 г, растворах для инъекций новокаина 0,5% и 2% различных производителей.
Проведена валидационная оценка методики кулонометрического определения нитроксолина в таблетках по показателям специфичность, линейность и аналитическая область методики, правильность и воспроизводимость. Специфичность, оцененная методом «введено»-«найдено», показала отсутствие влияния вспомогательных веществ (табл. 8) на определение нитроксолина. Зависимость между количеством электричества и массой нитроксолина имеет линейный характер, значение коэффициента линейной корреляции составляет 0,9999. Правильность и воспроизводимость оценивали путем сравнения полученных результатов с опорным значением. Статистическая обработка 12 определений (табл. 9) показала, что относительное стандартное отклонение составляет 0,007. Опорное значение содержания нитроксолина (0,05 г) лежит внутри доверительного интервала среднего значения (0,0499±0,0003), следовательно, систематическая ошибка отсутствует. Метод кулонометрического титрования дает правильные результаты. Методика валидна по показателям специфичность, линейность и аналитическая область методики, правильность и воспроизводимость. Относительная ошибка среднего кулонометрических определений нитроксолина в таблетках составляет 0,4%.
Таблица 8
Кулонометрическое определение нитроксолина
в модельной смеси (n=5, Р=95%)
Введено, мкг | Найдено нитроксолина, мкг | Sr | |
Нитроксолина | Вспомогательных веществ | ||
107 | 452,5 | 107±1 | 0,008 |
166 | 490,5 | 166±2 | 0,008 |
210 | 461 | 210±1 | 0,005 |
Таблица 9
Метрологические характеристики методики определения нитроксолина
в таблеточной массе кулонометрическим титрованием (n=12, P=95%)
Среднее значение выборки, Хср | 0,0499 |
Полуширина доверительного интервала, ΔXср | 0,0003 |
Стандартное отклонение, Sx | 0,0003 |
Относительное стандартное отклонение, Sr | 0,007 |
Стандартное отклонение среднего, Sx ср | 0,0001 |
Относительная ошибка среднего, e | 0,4% |
Следует отметить, что недостатком метода гальваностатической кулонометрии является его недостаточная избирательность. Например, это не позволило разработать методику количественного определения сульфацил-натрия в лекарственной форме «Сульфацил-натрий, глазные капли 20%», т. к. при их производстве в качестве вспомогательного вещества используется натрия тиосульфат, который также будет взаимодействовать с электрогенерированным бромом, то результаты будут неверны.
2.2. Взаимодействие на основе реакции окисления
Количественное определение индапамида, арбидола, каптоприла и парацетамола НД рекомендует определять, в основном, титриметрическими методами с визуальной индикацией к. т.т.: неводное титрование, йодатометрия, йодиметрия, нитритометрия и цериметрия, а для индапамида Европейская фармакопея рекомендует метод ВЭЖХ. О недостатках титриметрических методов говорилось выше, метод ВЭЖХ является одним из перспективных методов, который позволяет одновременно проводить качественный анализ, доброкачественность и количественное определение фармацевтических субстанций. Недостатком метода является его длительность, т. к. перед проведением измерений необходимо провести проверку пригодности хроматографической системы при пятикратном хроматографировании стандартного раствора, при этом относительное стандартное отклонение для площади пика должно быть не более 2,0%. Только после этого можно хроматографировать анализируемый раствор. К тому же необходимость использования стандартных образцов существенно повышает стоимость анализа.
Количественно арбидол, индапамид, каптоприл и парацетамол можно определить методом гальваностатической кулонометрии, используя окислительные свойства электрогенерированного брома. Что касается парацетамола, то он в своей структуре содержит фенольный гидроксил, который будет направлять бром региоселективно в орто-положения. Действительно, парацетамол взаимодействует с электрогенерированным бромом в соотношении 1:2, но реакция протекает длительно, время взаимодействия должно быть не менее пяти минут и наблюдается большой разброс полученных значений. Поэтому решено было провести определение парацетамола электрогенерированным бромом после предварительного гидролиза, который проводится путем кипячения с обратным холодильником в течение одного часа. Установлено, что арбидол, индапамид, каптоприл и парацетамол после гидролиза взаимодействуют с электрогенерированным бромом быстро и количественно в стехиометрическом соотношении 2:9, 1:4, 1:3 и 1:1, соответственно.
Каптоприл при окислении теряет 6 электронов. Учитывая, что в молекуле каптоприла присутствует меркапто-группа, которая легко окисляется, вероятно, реакция с электрогенерированным бромом протекает по схеме 3:
Схема 3
При гидролизе парацетамола образуется п-аминофенол, который может окисляться бромом с образованием хинонимина. Предположение об образовании хинонимина проверили с помощью реакции образования индофенола, имеющего фиолетовое окрашивание. Для этого в электрохимическую ячейку ввели заведомо большой избыток парацетамола после гидролиза и включили генерацию брома. По мере образования хинонимина, который вступал в реакцию с избытком п-аминофенола, увеличивалась интенсивность фиолетового окрашивания образующегося индофенола.
Ввиду большого количества молекул брома, участвующих в реакции окисления арбидола, можно предположить, что окисление арбидола идет с разрывом 5-членного индольного кольца. Из кривых титрования, представленных на рис. 2, видно, что индапамид титруется по одной ступени, а арбидол по двум ступеням. Однозначно химизм описать затруднительно. Следует отметить, что продукты окисления арбидола окрашены в бледно-розовый цвет, что, по-видимому, связано с окислением фенольного гидроксила и образованием соединений хиноидной структуры. Предложить химизм окисления индапамида также затруднительно.
I, мкА
t, сек | I, мкА
t, сек |
Рис. 2. Кривые титрования арбидола (I) и индапамида (II) электрогенерированным бромом: АВ − предэлектролиз; В − ввод пробы
Результаты титрования фармацевтических субстанций арбидола и индапамида оценены по способу «введено-найдено». Титрование проводили на трёх уровнях концентрации в диапазоне 70−130% от уровня, принятого за 100%. Полученные результаты представлены в таблице 10. Относительное стандартное отклонение не превышает 0,02. Количественное определение субстанций арбидола, индапамида, каптоприла и парацетамола провели методами, рекомендуемыми НД, и по разработанной методике (табл. 11). Как видно из таблицы 11, относительная ошибка кулонометрического титрования составляет 0,1−0,2%, что значительно меньше относительной ошибки методов, рекомендуемых НД.
С помощью критерия Стьюдента и критерия Фишера оценивали правильность и воспроизводимость разработанных методик. Результаты статистической обработки показали, что различие между дисперсиями статистически незначимо (Fрассч<Fтабл=15,98 при Р=99%).
Таблица 10
Кулонометрическое определение субстанций
электрогенерированным бромом (n=5, Р=95%)
Субстанция | Введено, мкг | Найдено, мкг | Sr |
Арбидол | 76,8 125 188 | 76,4±0,9 125±1 188±2 | 0,010 0,008 0,008 |
Индапамид | 100 155 213 | 100±1 155±2 213±1 | 0,010 0,008 0,006 |
Каптоприл | 54 102 129 | 54±1 101±2 129±1 | 0,011 0,012 0,008 |
Парацетамол | 101 159,0 220 | 101±2 158,9±0,8 220±1 | 0,017 0,004 0,004 |
Таблица 11
Определение субстанций кулонометрически и методами НД (n=5, P=95%)
Субстанция | Найдено кулонометрически, % | Найдено по НД, % |
Арбидол | 100,0±0,1 Sr= 0,001; eср= 0,1% | 99,8±0,411 Sr= 0,003; eср= 0,4% |
Fрассч = 15,28 tрассч = 0,41 | ||
Индапамид | 99,7±0,1 Sr= 0,001; eср= 0,1% | 99,9±0,32 Sr= 0,003; eср= 0,4% |
Fрассч = 12,41 tрассч = 0,43 | ||
Каптоприл | Xср= 99,3±0,2 Sr= 0,001; eср= 0,2% | 99,0±0,63 Sr= 0,005; eср= 0,6% |
Fрассч = 10,73 tрассч = 1,01 | ||
Парацетамол | 99,7±0,2 Sr= 0,002; eср= 0,2% | 99,7±0,54 Sr= 0,004; eср= 0,5% |
Fрассч = 4,58 tрассч = 0,05 |
1 Неводное титрование; 2 ВЭЖХ; 3 Йодатометрия; 4 Нитритометрия.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
