‚лиЯние метформина на устойчивость миокарда к ишемии при сахарном диабете 2 типа (клинико-экспериментальное исследование) (стр. 2 )

‚ раннем послеоперационном периоде оценивали длительность искусственной вентилЯции легких (€‚‹), необходимость введениЯ вазопрессоров, времЯ нахождениЯ в реанимационном отделении (ђЋ).

„лЯ выполнениЯ ‚естерн блоттинга, во времЯ операции проводили забор образцов скелетной мышцы (межреберной мышцы), сегмент внутренней грудной артерии забирали при подготовке шунта. Ћбразцы сразу замораживались в жидком азоте и хранились при температуре -80º‘.

‚естерн-блоттинг длЯ оценки экспрессии фосфорилированной и нефосфорилированной ЂЊ”Љ. Њетодикой ‚естерн-блоттинга оценивали экспрессию фосфорилированной (активированной) ЂЊ”Љ и нефосфорилированной ЂЊ”Љ в полученном материале миокарда животных, скелетной мышце и стенке внутренней грудной артерии. „лЯ этого из полученных образцов выделЯли белковую фракцию, помещаЯ материал в лизирующий буфер с использованием гомогенизатора (TissueLyser LT, Qiagen, Ќидерланды). Џосле уравниваниЯ концентраций белка в пробах проводили электрофорез с последующим переносом белков на нитроцеллюлозную мембрану. ‡атем проводили блокирование мембраны длЯ предотвращениЯ неспецифического свЯзываниЯ антител (Ђ’) и инкубировали мембрану с раствором Ђ’ к фосфорилированной (фосфо-ЂЊ”Љ) и нефосфорилированной (ЂЊ”Љ) формам ЂЊ”Љ. „лЯ детекции использовали вторичные Ђ’ с пероксидазой хрена, набор ECL Advance (Amersham Biosciences, ‘�Ђ) и систему ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, ‘�Ђ). Џроводили оценку плотности полученных бандов с использованием программы Gel analyzer. Ђктивность ЂЊ”-активируемой протеинкиназы рассчитывали по соотношению фосфо-ЂЊ”Љ / ЂЊ”Љ.

‘татистическаЯ обработка результатов. ‘татистический анализ проводили на компьютере с использованием электронных таблиц Exсel при помощи прикладных программ SPSS (ANOVA). ‚ работе использовали графические представлениЯ данных. „анные в тексте и таблицах представлены в виде M±SE, M-среднее, SE - стандартнаЯ ошибка среднего. “казывали минимальное и максимальное значениЯ. Љритический уровень значимости р при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Ћсновные положениЯ, выносимые на защиту

1. ќкспериментальный сахарный диабет 2 типа ЯвлЯетсЯ состоЯнием, вызывающим метаболическое прекондиционирование миокарда, и сопровождаетсЯ повышением устойчивости миокарда к ишемии-реперфузии.

2. ‘пособ введениЯ метформина (интракоронарный или внутрибрюшинный) имеет определЯющее значение в реализации кардиопротективного эффекта препарата.

3. Џорог реализации инфаркт-лимитирующего эффекта метформина при системном введении как в эксперименте, так и в клинической практике выше, чем активациЯ аденозинмонофосфатРактивируемой протеинкиназы как одного из молекулЯрных механизмов кардиопротекции.

‘тепень достоверности и апробациЯ работы

  Њатериалы диссертации доложены на международных конференциЯх: Advanced Technologies and Treatments of Diabetes (‹ондон, ‚еликобританиЯ, 16-19 февралЯ 2011год), Frontiers in CardioVascular Biology 2012 (‹ондон, ‚еликобританиЯ, 30 мартаР01 апрелЯ 2012 год), 15th International Congress of Endocrinology and 14th European Congress of Endocrinology (”лоренциЯ, €талиЯ, 5-9 маЯ 2012 год), а также на международной встрече 3rd Almazov and DIfE Gerussfit Project Workshop (Џотсдам, ѓерманиЯ, 25-26 февралЯ 2013 год).

  Њатериалы диссертации были доложены на заседаниЯх проблемных комиссий €нститута эндокринологии и €нститута экспериментальной медицины ”ѓЃ“ З”едеральный центра сердца, крови и эндокринологии им. ‚.Ђ. ЂлмазоваИ Њинздрава ђ”.

‹ичный вклад автора

Ђвтором был проведен анализ литературных данных, лично выполнена экспериментальнаЯ часть исследованиЯ, проведено клиническое обследование и наблюдение пациентов, госпитализированных с отделение сердечно-сосудистой хирургии, выполнена оценка активности ЂЊ”Љ, статистическаЯ обработка, анализ и обобщение полученных клинических и лабораторных данных, сделаны соответствующие выводы.

Џубликации

Џо теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в журналах из перечнЯ рецензируемых научных журналов, рекомендованных ‚ЂЉ, С 3.

‚недрение результатов работы

ђезультаты и выводы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре патофизиологии с курсом клинической патофизиологии и кафедре факультетской терапии ѓЃЋ“ ‚ЏЋ ЗЏервый ‘анкт-Џетербургский государственный медицинский университет имени €.Џ. ЏавловаИ Њинистерства здравоохранениЯ ђоссийской ”едерации.

Ћбъем и структура диссертации

„иссертациЯ изложена на 114 страницах, состоит из введениЯ, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержит 16 рисунков и 16 таблиц. ‘писок литературы включает 165 источников, в том числе 146 зарубежных.

‘Ћ„…ђ†ЂЌ€… ђЂЃЋ’›

ђезультаты собственных исследований

ќкспериментальнаЯ часть исследованиЯ

•арактеристика групп животных. ђезультаты глюкозотолерантного теста, проведенного на 8-9 неделе жизни животных, представлены на рисунке 2. ‚ ходе теста отмечалось достоверное увеличение уровнЯ гликемии в группе животных с ‘„2 (p<0,0001).

  ђисунок 2 - “ровень гликемии в ходе глюкозотолерантного теста в группе здоровых животных и группе с ‘„2 (‘„2)

  Џримечание: р < 0,0001 между группами интактных животных и животных с ‘„2

  „алее в каждой группе (интактных животных и животных с ‘„2) были выделены 3 подгруппы в зависимости от путей введениЯ метформина. ’аким образом, длЯ выполнениЯ исследованиЯ животные были разделены на следующие группы:

  1. ЉонтрольнаЯ группа (Љ) (n=13) - интактные крысы, не получавшие метформин перед проведением эксперимента перфузии изолированного сердца.

  2. ЉЊ(в/б) (n=12) - интактные крысы, получавшие терапию метформином (ѓлюкофаж, Nycomed) в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно в течение 3 дней перед проведением эксперимента перфузии изолированного сердца.

  3. ЉЊ(и/к) (n=7) Р группа интактных животных, в которой в ходе выполнениЯ эксперимента по перфузии изолированного сердца по ‹ангендорфу вводили метформин интракоронарно в концентрации 50 микроЊ в первые 15 мин реперфузии.

  4. ‘„2 (n=12) - крысы с развившимсЯ ‘„2, не получавшие метформин перед проведением эксперимента перфузии изолированного сердца.

  5. ‘„2Њ(в/б) (n=7) - крысы с развившимсЯ ‘„2, получавшие терапию метформином в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно в течение 3 дней перед проведением эксперимента перфузии изолированного сердца.

  6. ‘„2Њ(и/к) (n=8) - группа крыс с развившимсЯ ‘„2,в которой в ходе выполнениЯ эксперимента по перфузии изолированного сердца по ‹ангендорфу вводили метформин интракоронарно в концентрации 50 микроЊ в первые 15 мин реперфузии.

Ќи у здоровых животных, ни у крыс с ‘„2 на фоне введениЯ метформина внутрибрюшинно в течение трех дней не произошло значимого снижениЯ уровнЯ гликемии, что, вероЯтно, свЯзано с малой продолжительностью терапии. Ћбращает на себЯ внимание достоверно более высокий уровень гликемии у животных с ‘„2 по сравнению со здоровыми животными (P<0,05) (’аблица 1).

’аблица 1 -  “ровень гликемии перед выполнением перфузии изолированного сердца

Џоказатель	Љ	ЉЊ(в/б)	‘„2	‘„2Њ(в/б)
“ровень гликемии перед выполнением перфузии изолированного сердца, ммоль/л	6,0 ± 0,6	6,4 ± 0,6	9,5 ± 3,3*	8,2 ± 1,6*

Џримечание: * Р р < 0,05 между группами ‘„2, ‘„2Њ(в/б) и группой контролЯ

  ѓемодинамические показатели и размер зоны инфаркта в ходе эксперимента по перфузии изолированного сердца у животных с ‘„2 и при его отсутствии. Џри оценке таких гемодинамических показателей, как —‘†, „‹†„, Џ‹†„ и ЉЏ, достоверных отличий в исходном состоЯнии и в течение всего эксперимента достоверных отличий между группами выЯвлено не было.

  ‚ контрольной группе (Љ) размер инфаркта составил 45 ± 10,4 %. ‚ведение здоровым животным метформина внутрибрюшинно не приводило к уменьшению размера инфаркта (56 ± 15,8 %). Џри этом у животных с ‘„2 размер инфаркта был достоверно меньше, чем в контроле (24 ± 7,6 %, P=0,00017). ’ерапиЯ метформином как при системном введении, так и интракоронарно не приводила к заметному увеличению или уменьшению размера инфаркта у животных с ‘„2 (38 ± 8,3 % и 25 ± 12,8 %, соответственно). Ћбращало на себЯ внимание значимое уменьшение зоны инфаркта при интракоронарном введении метформина здоровым животным, а именно, размер некроза в этой группе (ЉЊ(и/к)) составил 29 ± 15,1 % (p=0,008, в сравнении с контрольной группой). ђезультаты представлены на рисунке 3.

  ђисунок 3 - ђазмер зоны инфаркта

  Ђктивность ЂЊ”Љ в миокарде у животных с ‘„2 и при его отсутствии. “ровень экспрессии ЂЊ”Љ не отличалсЯ во всех исследуемых группах. “ровень экспрессии фосфо-ЂЊ”Љ во всех группах с ‘„2 (на фоне введениЯ метформина и без него) был достоверно выше, чем в группе Љ, что свидетельствовало об активации ЂЊ”Љ в миокарде при ‘„2. Џри этом отмечалось нарастание активности ЂЊ”Љ при ‘„2 на фоне введениЯ метформина, как интракоронарно, так и внутрибрюшинно по сравнению с группой ‘„2 (ђисунок 4).

  ‚ группах здоровых животных также отмечалось достоверное повышение экспрессии фосфо-ЂЊ”Љ на фоне введениЯ метформина, соответственно и повышение активности ЂЊ”Љ. Ќаибольший уровень активации ЂЊ”Љ отмечалсЯ при введении метформина интракоронарно (ђисунок 4). ќти данные свидетельствуют об активации ЂЊ”Љ как при наличии ‘„2, так при терапии метформином при любом пути введениЯ.

  ђисунок 4 - ќкспрессиЯ ЂЊ”Љ и фосфо-ЂЊ”Љ. „енситометрическаЯ оценка экспрессии фосфо-ЂЊ”Љ по отношению к ЂЊ”Љ

  Џримечание: * - p<0,05 между группами ЉЊ(в/б), ЉЊ(и/к), ‘„2, ‘„2Њ(в/б), ‘„2Њ(и/к) и группой контролЯ, $ - p < 0,05 между группами ЉЊ(и/к) и ЉЊ(в/б), & - p < 0,05 между группами ‘„2Њ(и/к) и ‘„2Њ(в/б)

  ‘оотношение фосфо-ЂЊ”Љ/ЂЊ”Љ, отражающее активность ЂЊ”Љ, обратно коррелировало с размером зоны некроза миокарда (ђисунок 5), что может объЯснЯтьсЯ как большей степенью сохранениЯ жизнеспособного миокарда, в котором происходила активациЯ ЂЊ”Љ при гипоксии, так и более выраженной степенью активации ЂЊ”Љ в клетках миокарда независимо от предыдущего фактора.

  ђисунок 5 - „иаграмма разброса значений соотношениЯ фосфо-ЂЊ”Љ/ЂЊ”Љ и размера инфаркта миокарда

  ЉлиническаЯ часть исследованиЯ

‚озраст включенных в исследование пациентов варьировал от 55 до 77 лет, составлЯЯ в среднем 64,3±5,6 лет, среди них было 16 женщин и 29 мужчин. „лительность ‘„2 в группах ‘„2 и ‘„2Њ от момента постановки диагноза колебалась от 8 мес. до 12 лет. „лительность €Ѓ‘ во всех группах составила от 1 года до 12 лет.

Ћсновные клинико-анамнестические характеристики групп пациентов представлены в таблице 2.

’аблица 2 - ЉлиническаЯ характеристика включенных в исследование пациентов

Џоказатель	‘„2	‘„2Њ	Љ
Љол-во больных	15	15	15
Џоловой состав, муж./жен.	9(60 %)/6(40 %)	9(60 %)/6(40 %)	11(73 %)/4(27 %)
‚озраст, годы	63,7 ± 6,3	65,4 ± 5,3	63,6 ± 5,4
€Њ’, кг/м2	28,6 ± 4,5	28,6 ± 3,4	29,0 ± 3,6
‘реднЯЯ длительность ‘„2, годы	4,4 ± 3,3	5,0 ± 3,1	-

Џродолжение ’аблицы 2

‘реднЯЯ длительность €Ѓ‘, годы	6,1 ± 4,2	5,1 ± 3,0	5,3 ± 3,2
Ќаличие €Њ в анамнезе, кол-во больных	7	9	11
Ќаличие ЋЌЊЉ/’€Ђ в анамнезе, кол-во больных	1	0	2
”ункциональный класс стенокардии, кол-во больных с II ф. кл./ кол-во больных с III ф. кл.	5/10	5/10	4/11
•‘Ќ, кол-во больных II ф. кл./ кол-во больных III ф. кл	13/2	12/3	12/3
Љурение, кол-во больных	5	4	5

Џримечание: €Њ Р инфаркт миокарда; ЋЌЊЉ Р острое нарушение мозгового кровообращениЯ; ’€Ђ Р транзиторнаЯ ишемическаЯ атака; •‘Ќ Р хроническаЯ сердечнаЯ недостаточность

’аким образом, группы пациентов были сравнимы по спектру и выраженности сердечно-сосудистой патологии. Џри оценке лабораторных данных группы пациентов были сравнимы по основным показателЯм, результаты представлены в таблице 2. Џо результатам измерениЯ гликированного гемоглобина его уровень достигал 7,09 ± 0,87% в группе ‘„2 и 6,88 ± 0,93% в группе ‘„2Њ, в группе контролЯ уровень HbAc был достоверно ниже - 5,07 ± 0,4% (p<0,05). Ћбщий холестерин на фоне приема липидоснижающей терапии (статины) составил 4,9 ± 1,0 ммоль/л и не отличалсЯ достоверно во всех группах. ‘редние показатели общих биохимических показателей (Ђ‘’, Ђ‹’, креатинин) были в пределах нормальных показателей и сопоставимы во всех группах. 3 пациента в группах ‘„2 и ‘„2Њ имели уровень креатинина выше нормы, но не превышавший 115 мкмоль/л и ‘Љ” составила не менее 60 мл/мин.

’аблица 3 -  ‹абораторные показатели в группах пациентов

Џоказатель	‘„2	‘„2Њ	Љ
HbA1c, %	7,09 ± 0,87	6,88 ± 0,93	5,07 ± 0,4*
Ћбщий холестерин, ммоль/л	5,2 ± 1,1	4,6 ± 1,1	4,8 ± 0,9
Љреатинин, мкмоль/л	76,9 ± 17,0	81,4 ± 17,1	71,3 ± 12,0
Ђ‘’, …/л	28,0 ± 17,0	22,1 ± 4,5	23,2 ± 6,4
Ђ‹’, …/л	33,3 ± 10,0	24,3 ± 7,3	27,7 ± 10,5

Џримечание: * p<0,05 между группой Љ и группами ‘„2 и ‘„2Њ, HbA1c Р гликированный гемоглобин, Ђ‘’ Р аспартатаминотрансфераза, Ђ‹’ Р аланинаминотрансфераза