Разработка и совершенствование биотехнологических процессов при промышленном производстве биопрепаратов (стр. 4 )

Таблица 1

Сравнительная оценка влияния методов высушивания на

ферментативную активность трипсина

n=3

Метод высушивания	Температура высушивания, 0С	Время сушки, ч	Характеристика препарата
на входе	на выходе	Массовая доля влаги,%	Активность, ЕД
Распылительный	130-140	60-75	2	1,56+0,37	443+28,6
Сублимационный	-40	30	30	2,30+0,24	455+9,0
Кондуктивный (калориферный)	35-37		24-30	4,25+1,11	232+17,6
Конвективный	35-37		24-30	3,85+0,82	294+25,0
Нативный препарат, контроль	-	-	-	50,00+3,24	492+26,2

Результаты проведенных исследований по выбору метода высушивания конечного продукта показали, что кондуктивный и конвективный методы длительны и требуют дополнительных технологических операций измельчения и просеивания трипсина, кроме того кондуктивный метод повышает вероятность обсеменения фермента. Наиболее эффективным по производительности и экономичности для больших объемов является метод распылительного высушивания, позволяющий получить тонкодисперсный порошок трипсина, содержащий не более 3% массовой доли влаги, с активностью близкой к нативной форме трипсина, альтернативным для небольших партий – сублимационный метод. Преимуществом этих двух способов является получение трипсина с высокой протеолитической активностью, низкой массовой долей влаги, не требующих измельчения и просеивания ферментного препарата. Полученный трипсин соответствовал требованиям ТУ9358-013-00008064-96: протеолитическая активность не ниже 150 ЕД по Шоу-Петиколас; массовая доля влаги не более 3 %, значение буфера - 7,4 при растворении образца фермента; значение мутности не фильтрованного раствора не более 6,5х10-3 1/см или не более 0,05 ЕД оптической плотности (ОП); выход клеток из 1 г ткани КЭ в пределах 150-215 млн клеток при 90-96% жизнеспособности. Серия трипсина для получения культур клеток считают активной и нетоксичной, если изготовленный из него 0,25% раствор обеспечивает дезагрегацию и выход из 1 г ткани не менее 90 млн. клеток с жизнеспособностью не ниже 90%, без признаков дегенерации клеток в культуре.

2.2.1. 2. Разработка технологической линии промышленного

производства трипсина

Нами разработана технологическая линия промышленного производства трипсина, включающая эффективное современное оборудование: реакторы с автоматическим перемешиванием суспензии и регулированием температурного режима, оборудование для разделения суспензии после экстрагирования и высаливания, оборудование для высушивания конечного продукта. За счет применения современной техники обеспечен наиболее высокий уровень механизации, автоматизации процессов, что способствовало получению более активного трипсина, повышению производительности труда. Предполагаемый экономический эффект от организации производства трипсина сухого (ТС) для вирусологических целей на 1000 кг в год равен 118 млн. руб.

Освоение технологии изготовления трипсина проводили в ГНУ ВНИТИБП и НПО “Синтез” (г. Курган), на Алма-Атинском и Омском биокомбинатах. Опытно-промышленные серии трипсина использованы для получения культур клеток при изготовлении вакцин против болезни Марека, чумы плотоядных, болезни Ауески и трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Пригодность опытно-промышленных серий трипсина для получения культур клеток противовирусных препаратов была подтверждена на Омском, Алма-Атинском биокомбинатах и Курской биофабрике.

2.2.1.3. Использование трипсина при культивировании клеток в производстве противовирусных вакцин

Опытно-промышленные образцы фермента проверялись при культивировании на широком спектре культур клеток совместно с сотрудниками ВГНКИ и на биопредприятиях. Установлена эффективность использования трипсина для получения различных видов первичных культур клеток (выход клеток с 1 г. ткани для ФЭК, ПЭК, ТБ, ПКЩ, ПЩ, ПК составил 137,2; 72; 166; 93,5; 57; 121 млн. кл. соответственно) и перевиваемых культур клеток MDBK, MDCK, СПЭВ.

Клеточные культуры, изготовленные с использованием растворов опытно-промышленных серий трипсина, по чувствительности и уровню накопления вирусов: штаммов: - БУК-628 вируса болезни Ауески; МВА 1/77 вируса парагриппа-3 (ПГ-3); МВА 1/80 вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота, штаммы С и Д парвовирусного энтерита собак (ПВЭС), по морфологии и срокам проявления ЦПД были сходны с контрольными культурами клеток (Дифко), что говорит о равноценности и перспективности растворов фермента для практического использования.

Трипсин был испытан на Омском биокомбинате для диспергирования ткани перепелиных эмбрионов (ПЭ) при получении культуры клеток ФЭП и вакцины против болезни Марека из штамма ФС-126 герпеса индеек. Фермент обладал равной с контролем диспергирующей активностью в отношении ткани ПЭ и обеспечивал выход 45,8-68,9 млн. кл/г, равноценный контролю, с жизнеспособностью клеток 95-97%. Опытные и контрольные культуры клеток ФЭП характеризовались равноценной чувствительностью и были пригодными для получения штамма “ЭПМ” вируса чумы плотоядных в производственных условиях.

Таким образом, отечественный фермент трипсин, полученный по усовершенствованной технологии, пригоден для культивирования клеток и вирусов и не уступает по эффективности импортному препарату.

2.2.2. Разработка и применение полимерных композиций в

технологии производства биопрепаратов

2.2.2. 1. Разработка способа иммобилизации трипсина

на полимерном носителе

Для консервации трипсина, с целью сохранения его диспергирующих свойств и протеолитической активности, нами разработан способ иммобилизации на фторсодержащем полимерном носителе (СКФ-26 и СКФ-260 ВРТ) с высокой химической, биологической стойкостью и инертностью (табл. 2).

Таблица 2

Влияние иммобилизованного трипсина на получение клеточных культур n=5

N	Наименование фермента	Наименование носителя	Протеолитическая активность, ЕД	ПЭ	КЭ
Выход клеток с 1 г. ткани млн.	Жизнеспособность клеток, %	Выход клеток с 1 г. ткани млн.	Жизнеспособно сть клеток, %
I	Нативный трипсин		235	85	96	120	97
II	Иммобилизованный трипсин	СКФ-26	235	125	97	150	97
СКФ-260ВРТ	235	145	96	160	97

Испытания иммобилизованного фермента на полимерном носителе в качестве диспергирующего агента показали возможность использования его при дезагрегации тканей перепелиных и куриных эмбрионов (ПЭ и КЭ), выход клеток с единицы ткани превышал уровень контроля. Полученные клетки были жизнеспособны при монослойном культивировании. При соблюдении стерильности рост клеток КЭ был выше уровня контроля на 25-33%, а рост клеток ПЭ на 47-70%.

Таким образом, разработан способ иммобилизации трипсина на полимерном носителе, обеспечивающий сохранение свойств фермента, его протеолитическую и диспергирующую активность. Жизнеспособность клеток, полученных с использованием иммобилизованного фермента, была на уровне контроля, а выход клеток с единицы ткани превышал его.

2.2.2. 2. Разработка полимерных материалов для

биотехнологического оборудования

Полимеры с повышенной термической стабильностью, химической стойкостью и биологической инертностью, такие как фторкаучуки, использовали не только как носители при иммобилизации протеолитического фермента трипсина, но и как конструкционные материалы для биологического оборудования (авторские свидетельства: № 000, “Резиновая смесь на основе фторуглеродных каучуков”, бюл. – 1979. - № 44. – С.193.; № 000, “Резиновая смесь на основе фторкаучука”, бюл. - 1980. - № 37. – С.308; № 000, “Резиновая композиция на основе сополимера винилиденфторида”, бюл. - 1980. - № 44. – С.110).

Испытание деформационных свойств полимеров при длительном старении в течение 502 сут. при комнатной температуре показало, что накопление остаточной деформации у фторуглеродной резины составляло – 16 %, у силиконовой резины – 23 - 25 % (в зависимости от наполнения). Высокая сопротивляемость полимеров при 20% сжатии позволила рекомендовать их для уплотнительных и герметизирующих изделий.

В результате проведенных исследований были разработаны новые полимерные материалы, обладающие теплостойкостью, агрессивостойкостью, инертностью на основе фторкаучука СКФ-26 и СКФ-260 Д. Технологичность фтористых резиновых смесей улучшали при использовании совмещенных композиций с фторсиликоновыми смесями и олигомерными фторсодержащими соединениями, обладающими повышенной теплостойкостью при 200оС. Потеря массы при вуланизации у этих композиций составляли 4-2%. Усадка изделий была 2-1,5 %, в то время как у контрольной смеси с дибутилсебацинатом потери массы и усадка составили соответственно 12% и 10%. Применение совмещенных композиций на основе фторкаучуков и фтосиликоновых смесей, фторсодержащего пластификатора обеспечивало вулканизацию под давлением в прессе, в котле и в воздушной среде термостата или в трубе агрегата непрерывной вулканизации, с последующим термостатированием. В качестве совулканизата бифургина или его замены были предложены новые вулканизующие агенты: производные дитиомочевины и соединение 1,4 бис (2-меркаптобензтиазолилметилен) – пиперазина, позволяющие получать теплостойкие материалы. Для уплотнительных прокладок нами были разработаны пресс-формы, изготовленные на Ставропольском ОЗТО и испытанные во ВНИТИБП и Щелковском биокомбинате.