Разработка и совершенствование биотехнологических процессов при промышленном производстве биопрепаратов (стр. 1 )

На правах рукописи

ПОПОВА

Вера Михайловна

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

ПРИ ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ

БИОПРЕПАРАТОВ

03.01.06-биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Щелково – 2011

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный консультант: доктор биологических наук

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ

доктор ветеринарных наук, профессор Владимир Викторович Субботин

доктор биологических наук Владимир Егорович Козлов

Ведущая организация - ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. »

Защита состоится 9 декабря 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП;

тел/; e-mail: *****@***ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП).

Автореферат разослан “….” …………2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие биотехнологии обусловлено общим прогрессом науки и техники. Совершенствование промышленной технологии производства биопрепаратов наиболее успешно осуществляется при совместном решении биотехнологических и технических вопросов. Разработка биотехнологических процессов при культивировании клеток, вирусов и бактерий, выделении энзимов является актуальной проблемой при получении эффективных биопрепаратов (, 1985; и Гриффитс Дж., 1989; , 1995; , 2000; , 2003; , 2004; , 2004; , 2004; , , 2005; , 2005; , 2005; , 2007; , 2009).

Разработка современных технологий в производстве биопрепаратов требует переоснащения оборудования, использования высокоэффективных методов и перспективных материалов, что обеспечит выпуск конкурентоспособной продукции.

Одной из важнейших задач производства биопрепаратов является совершенствование методов культивирования (клеток, вирусов и бактерий) с использованием отечественного оборудования и учетом качественных характеристик препарата. Способ управляемого глубинного культивирования нашел широкое применение в производстве бактерийных препаратов, который за короткое время позволяет получить максимальное количество бактериальной массы. Одной из проблем при культивировании клеток животных и вирусов является поддержание жизнеспособности клеток. Наряду с распространенными стационарным и динамичным (роллерным) способами культивирования клеток и вирусов суспензионное культивирование привлекает внимание исследователей при изготовлении вакцин и диагностических препаратов для максимального накопления клеток и получения вируссодержащего материала (, 1979; , , 1981; , , Я, 2005). Суспензионный и псевдосуспензионный (на микроносителях) методы культивирования микроорганизмов создают равноценные условия по всему объему сосуда, позволяют контролировать и регулировать необходимые параметры (рН, рО2, еН, t), осуществлять контроль роста клеток, исключать возможность контаминации, способствовать экономии питательной среды (, 1976; , , 1976; , 1976; , 1979; , 1990; , , 1981; , 1994; , Ситьков, 2000; Ю. Х., 2003; , , Я, 2005; , 2009). Осуществление крупномасштабного культивирования клеток в суспензии и на микроносителях в реакторах специального назначения отечественного производства связано со сложностью обеспечения стерильности процесса. Исключение контаминации культуральной жидкости посторонней микрофлорой и попадания продуктов биосинтеза в окружающую среду, поддержание, контроль и регулирование процессом являются важнейшими факторами.

В производстве вирусных вакцин при дезинтеграции клеток используют в основном импортный протеолитический ферментный препарат трипсин. Совершенствование технологии с целью получения фермента высокой активности сопряжено с использованием методов очистки и сушки препарата, что позволит создать конкурентоспособную продукцию с заданными свойствами и провести импортзамещение.

Важными этапами при приготовлении питательных и защитных сред, сывороток, ферментов в производстве вирусных вакцин и бактерийных препаратов являются их очистка, разделение и концентрирование, стерилизация. Выбор методов их осуществления представляет сложную задачу, и зависит от качественной характеристики жидкости (, 2005). Применение мембранных способов очистки, разделения и концентрирования позволяет создать экологически безопасные, энергосберегающие технологические процессы (, 1976; ; 1986, , 1999; , 2000; , 2001; , , 2005; , 2007; , 2007; , 2009).

Таким образом, совершенствование технологии культивирования в биореакторах вирусных и бактерийных препаратов, получение отечественного препарата трипсина, разработка различных способов очистки, разделения, концентрирования биологических жидкостей с учетом современных достижений биотехнологии (в настоящее время) являются актуальными.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка и совершенствование биотехнологических процессов в производстве ферментов и биопрепаратов, при получении трипсина и культивировании клеток, при очистке и фильтровании биологических жидкостей с использованием современного оборудования и материалов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- усовершенствовать технологию промышленного производства трипсина;

- разработать способ иммобилизации трипсина на полимерном носителе и получения теплостойких композиций; определить токсичность полимерных материалов с помощью пастерелл и культур клеток;

- усовершенствовать способы культивирования клеток животных при получении противовирусных препаратов с применением современного оборудования и материалов;

- усовершенствовать способ глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения биологически активного протеина А;

- усовершенствовать технологию различных методов очистки биологических растворов при микрофильтрации, ультрафильтрации и электродиализе:

определить область применения безасбестовых материалов и мембранных фильтров для предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации, при разделении и концентрировании жидкостей с использованием отечественного оборудования;

разработать технологию получения очищенного альбумина, применяемого в качестве компонента питательной среды при культивировании лептоспир с помощью ультрафильтрации и электродиализа.

Научная новизна. - Усовершенствована технология производства трипсина с применением способов центрифугирования при разделении суспензии после экстрагирования и высаливания фермента и последующего распылительного или сублимационного высушивания, обеспечивающих высокое качество препарата, не требующих его дополнительного измельчения и просеивания препарата.

- Разработана промышленная технологическая линия производства трипсина с использованием современного оборудования. Технология испытана в опытно-промышленных условиях, получен патент РФ “Способ получения трипсина” (оп. 10.11. 2010 бюл. № 31. – С. 743).

Усовершенствован способ очистки и концентрирования трипсина методом ультрафильтрации через разделительные модули на полых волокнах с обеспечением подачи жидкости центробежным насосом.

- Разработан способ иммобилизации протеолитического фермента трипсина, сохраняющего свойства при длительном хранении и обладающего активностью на уровне контроля, обеспечивающего получение жизнеспособных клеток, более высокий выход при культивировании в сравнении с нативной формой.

- Определены технологические параметры культивирования перевиваемых линий клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 в суспензии и псевдосуспензии на микроносителях в биореакторах с магнитным приводом и аэрацией культуры.

- Разработан модуль технологической обвязки для биореакторов (0,005; 0,025; 0,1; 0,25м3). Отработана технология культивирования перевиваемых клеток в биореакторах с использованием специализированного отечественного оборудования, оснащенного фильтрами тонкой очистки воздуха и пара с фильтрующими элементами из пористого титана; запорной малогабаритной и регулирующей арматурой, обеспечивающей осуществление технологических операций в автоматическом режиме.

- Разработаны полимерные композиции, которые применены в биологическом оборудовании в качестве конструкционного материала, стойкие к биологическим и химическим средам, температурным факторам (авторские свидетельства: № 000 бюл. - 1973. - № 43. - С.167; № 000 бюл. – 1979. - № 44. – С.193; № 000 бюл. - 1980. - № 37. – С.308; № 000бюл. - 1980. - № 44. – С.110).

- Впервые в отечественной ветеринарной практике разработана технология и использован метод обессоливания альбумина с помощью электродиализа для повышения эффективности процесса очистки растворов от солей.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований по разработке и усовершенствованию технологических процессов получения ферментов и биопрепаратов разработана нормативная и технологическая документация.