Разработка и совершенствование биотехнологических процессов при промышленном производстве биопрепаратов (стр. 2 )

“Технологический регламент производства трипсина сухого для вирусологических целей”, утвержденный 01.06.1995 г., директором ВГНКИ и директором ГНУ ВНИТИБП.

“Технические условия ТУ 9358.013.00008064-96 “Трипсин сухой для вирусологических целей”, утвержденные 04.03.1996 г., директором ВГНКИ и согласованные 07.03. 1996 г. Департаментом ветеринарии МСХ РФ.

“Наставление по применению трипсина сухого для вирусологических целей”, утвержденное 04. 03. 1996 г. № 13-6-2/540, Департаментом ветеринарии МСХ РФ.

Разработана технологическая схема производства трипсина. Технология изготовления трипсина освоена в ГНУ ВНИТИБП и НПО “Синтез” (г. Курган), на Алма-Атинском и Омском биокомбинатах. Опытно-промышленные серии трипсина использованы для получения первичных и перевиваемых культур клеток при производстве противовирусных вакцин на Курской и Армавирской биофабриках, Омском и Алма-Атинском биокомбинатах.

Определены условия культивирования клеток в биореакторах, разработан Технологический регламент “Культивирование клеток и вирусов с использованием экспериментальных образцов оборудования“, утвержденный директором ГНУ ВНИТИБП 28.12.1985 г. Разработана технологическая схема процесса культивирования клеток и вирусов в аппаратах (реакторах). Технология культивирования клеток и вирусов использована в производстве противовирусных вакцин и диагностических препаратов при ИРТ, ПГ-3, РС, ВД-БС АВИ, бешенстве, болезни Марека (БМ).

- Разработаны и предложены в качестве конструкционного материала полимерные композиции, стойкие к биологическим и химическим средам, температурным факторам. Во ВНИТИБП организован участок по изготовлению полимерных материалов, предложен комплект пресс-форм для изделий биотехнологического назначения.

- Усовершенствована предварительная, тонкая и стерилизующая фильтрация биологических растворов с помощью материалов на безасбестовой основе. Определены условия и возможность использования в биопромышленности экологически безопасных, исключающих фазовые переходы, процессов микрофильтрации и ультрафильтрации; усовершенствован метод очистки альбумина с помощью электродиализа при получении питательной среды для культивирования лептоспир в промышленных условиях.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- технологические процессы изготовления трипсина;

- разработка способа иммобилизации трипсина на полимерном носителе и получения теплостойких композиций; определение токсичности полимерных материалов с помощью пастерелл и культур клеток;

- усовершенствование технологии культивирования перевиваемых клеток животных при получении вирусных препаратов суспензионным и псевдосуспензионным способами (на микроносителях) в биореакторах;

- усовершенствование глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения биологически активного протеина А;

- усовершенствование предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации биологических растворов (питательных сред, раствора трипсина, сыворотки крови и других) с помощью фильтровальных материалов на безасбестовой основе;

- совершенствование процессов микрофильтрации и ультрафильтрации в биопромышленности с использованием современных фильтровальных материалов и оборудования;

- технология обессоливания альбумина с помощью электродиализа в условиях промышленного производства.

Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке целей и задач исследований, решении поставленных задач, планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении результатов и использовании их в практике.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены:

- на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИТИБП (1980-2009 гг.) в виде ежегодных отчетов по заданиям научно-технической программы (НТП) (1980-2009 гг.), фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса (АПК) Российской Федерации (РФ) на 2006-2010 гг.;

- на 23 Всесоюзных, Республиканских, Международных и Всероссийских, совещаниях, семинарах, конференциях, посвященных научным и практическим проблемам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов и биотехнологии, проводившихся в Москве, Владимире, Щелкове, Волжске, Курске, Сергиев-Посаде, Покрове, Краснодаре, (1981-2009 гг.);

- на секции “Ветеринарная биотехнология” (2011 г).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 71 научной работе, в том числе 11 в рецензируемых изданиях, входящих в перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторской диссертации. Получено 6 авторских свидетельства и патентов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 292 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, приложения, содержит 40 таблиц и 52 рисунка. Список литературы включает 457 наименований, из которых 358 отечественных и 99 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность работы, ее научную и практическую значимость.

Автор выражает признательность академику РАСХН за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.

Искреннюю благодарность за руководство НИР и ОКР автор приносит , , а также , , .

Практическую и консультативную помощь в выполнении некоторых разделов диссертации оказывали сотрудники института , , , , А. Б Абрамов, , а также сотрудники ВГНКИ , , Ставропольской биофабрики - , НПО порошковой металлургии - , ВНИИ ЦБП - .

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 1980-2010 гг. согласно планам НИР и ОКР ГНУ ВНИТИБП в соответствии с отраслевыми научными программами, в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации.

Экспериментальные исследования осуществляли в лабораториях и отделах института, во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ВГНКИ). Практическую реализацию научно-исследовательских разработок осуществляли на Щелковском, Омском и Алма-Атинском биокомбинатах, Ставропольской, Курской, Краснодарской биофабриках, НПО “Синтез” (г. Курган).

2.1. 1. Материалы

Питательные среды и растворы. В работе использовали культуральные среды Игла, 199, гидролизат лактальбумина; растворы Хенкса и Эрла; трипсин импортного (“Difko”, “Ferak“, “Merk“) и отечественного производства ТУ 9358013.00008064–96; сыворотки крупного рогатого скота (КРС), овец; защитные среды: сахарозо-альбуминовую (СФГА) и сахарозо-желатозную (СФГЖ); разбавитель вируса и раствор концентрата разбавителя для противовирусных вакцин (ТУ 9384-001-93840700-00).

Для изготовления вакцины против лептоспироза животных применяли питательную среду ГНКИ, в которой использовали альбуминовую фракцию сыворотки крови овец; для культивирования Staphylococсus aureus - бульон Хоттингера и мясопептонный бульон (МПБ).

Культуры клеток. В экспериментах использовали первичные культуры клеток (ПКК) различного происхождения – почек крольчат (ПК), щенков (ПЩ), кошек (ПКШ), эмбрионов коров (ПЭК), фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) и перепелов (ФЭП); а также перевиваемые линии клеток: почки сирийского хомячка (ВНК-21), почки теленка (ПТ-80), почки крупного рогатого скота (MDBK), почки собаки (MDCK), почки свиньи (СПЭВ) (, , 1996-1999).

В качестве доноров были взяты: 1-4 - недельные крольчата, 1-2 - месячные щенки и котята, 3-9 - месячные эмбрионы коров, 6-10 - дневные перепелиные и 6-14 - дневные куриные эмбрионы.

Вирусы. Оценивали чувствительность тест-культур клеток к вирусам болезни Ауески (ВБА) штамма БУК-682, парагриппа -3 (ПГ-3) - штамма МВА 1/44, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота – штамма МВА 1/80, энтерита собак (ПВЭС) – штамма С и Д, болезни Марека, вируса герпеса индеек (ВГИ) – штамма ФС-126, инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц – штамма “Био-92”, чумы плотоядных - штамма (ЭЛМ). Работы проводилась совместно с ВГНКИ.

Staphylococсus aureus (St. aureus). Штамм золотистого стафилококка А-676 использовали для выделения протеина А (Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. ).

Микрофильтрационные мембраны “Владипор”, изготовленные из ацетатацеллюлозы и регенерированной целлюлозы - МФА-А с размером пор 0,2-0,5 мкм, МФА-МА (0,2-0,5 мкм) и МФЦ (0,15; 0,2; 0,45 мкм), а также капроновые мембраны “Мифил” производства АН Белорусской ССР (г. Минск) и г. Таллин (5,0; 3,0 и 0,2 мкм), мембраны фирм “Millipor” и “Pall” (0,45 и 0,22 мкм и микропористые ядерные фильтры (от 0,03 до 8 мкм) использовали для очистки биологических жидкостей и растворов.

Ультрафильтрационные мембраны УАМ-50, 100, 150, 200, 300, 500 с диаметром пор - 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,03; 0,05 мкм (ацетат целлюлозы) и полупроницаемые мембраны в виде полых волокон типа ВПУ-5ПА, ВПУ-15ПА, ВПУ-50ПА, ВПУ-100ПА из полиамида с пределом задержания по белку 5, 15, 50, 100 кДа применяли для очистки и концентрирования биологически активных веществ.

Глубинные фильтры. При фильтровании биологических жидкостей применяли материалы на безасбестовой основе в виде пластин и картона: - фильтр-пластины - ФП (предварительной очистки), ФТ (тонкой очистки), ФC (стерилизующие), ФД (для удаления пирогенов) и картон КФМП и КФБЖ, разработанные по нашим техническим требованиям Марийским филиалом Волжского научно-исследовательского института целлюлозно-бумажной промышленности для медико-биологических целей (, 2000).