Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) (стр. 4 )

Для клонирования к концам кДНК присоединяют с помощью ДНК-лигазы олигонуклеотидные адаптеры, содержащие сайты рестрикции, необходимые для соединения с линеаризованным вектором. После этого кДНК фракционируют по размерам, очищают от оставшихся молекул адаптера и клонируют по липким концам стандартными методами. Поскольку длина кДНК редко превышает несколько т. п.о., в качестве вектора обычно используют плазмиды или инсерционные векторы на основе фага λ.

Методы отбора требуемых последовательностей из клонотек ДНК.

Способы получения требуемых последовательностей нуклеотидов из клонотек генов можно разделить на три группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на присутствие в них искомых последовательностей нуклеотидов путем последовательного перебора случайных клонов. При таком подходе, получившем название скрининга, творческие усилия исследователя направлены только на облегчение самого процесса анализа клонов, например, на его автоматизацию. Во втором случае, присутствие нужных последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах бляшек продуктов экспрессии искомых генов – РНК, белков или ферментативной активности, т. е. определенного фенотипа, который отличает такие клоны от соседних, не содержащих соответствующих последовательностей. В этом случае исследователь среди большого количества суммарных клонов осуществляет выбор тех, которые резко отличаются от соседних по своему фенотипу, например цвету колоний. При таком подходе производится выбор требуемого фенотипа среди большого числа других фенотипов. Реализация третьего подхода требует создания селективных условий, при которых преимущество в размножении получают те клоны, которые отвечают требованиям отбора, например, приобрели способность к росту на селективных питательных средах в присутствии антибиотика или в отсутствие аминокислоты в случае исходно ауксотрофного штамма. Последний подход, кроме своего необыкновенного изящества в замысле, демонстрирует и самую высокую эффективность, так как позволяет «в одно касание» освободиться от всех нежелательных примесей в виде ненужных клонов.

Гибридизация с зондами.

Гомологичные зонды. Использование гомологичных зондов, т. е. зондов, последовательность которых полностью соответствует исследуемому гену, становится возможным в том случае, если известна (например, из литературы или базы данных) первичная структура последовательности, которую пытаются обнаружить в клонотеке. Такая задача часто возникает, когда определенный ген или кДНК хотят использовать в прикладных целях, например, в биотехнологических разработках или для генотерапии наследственных заболеваний. Та же самая задача может возникнуть и при необходимости получения последовательности целого гена, если предварительно клонирована его часть. Подход с использованием гомологичных зондов может быть применен и при исследовании популяционного полиморфизма исследуемых последовательностей. Сложнее обстоит дело в том случае, если на момент клонирования последовательность нуклеотидов исследуемого участка хромосомы совершенно неизвестна. Такие задачи иногда могут быть решены с использованием гетерологичных зондов.

Гетерологичные зонды. Гетерологичные олигонуклеотидные зонды получают на основании предположения о наличии гомологии в последовательностях у генов организмов разных биологических видов, которые выполняют аналогичные функции. При гибридизации гетерологичных зондов с ДНК исследуемой клонотеки используют более низкие температуры их отжига для того, чтобы даже при наличии нескольких неправильно спаренных оснований в гибриде, он оказался достаточно стабильным для обнаружения. Понижение температуры отжига зонда значительно ниже его температуры плавления будет почти неизбежно сопровождаться получением ложноположительных результатов, то есть гибридизацией зондов с неродственными последовательностями, которые обладают определенной гомологией с искомой. Во многих случаях этот результат не опасен, поскольку после такого предварительного отбора, круг поиска нужной последовательности существенно сужается. Проведение повторной гибридизации в других условиях среди предварительно отобранных клонов может привести к положительному результату. Ситуация становится угрожающей в том случае, если число ложноположительных клонов, выявленных на первом этапе отбора, становится слишком большим. В этом случае цена повторного скрининга может оказаться слишком высокой.

Использование ПЦР.

Обратная трансляция. Разработать последовательность зонда или праймера для ПЦР к неизвестному гену иногда оказывается возможным путем очистки небольшого количества белка, кодируемого клонируемым геном, и определения последовательности его нескольких N-концевых или C-концевых аминокислотных остатков. На основании этих данных с учетом вырожденности генетического кода и частоты встречаемости аминокислотных остатков у исследуемого организма синтезируют олигонуклеотидные зонды, которые используют для гибридизации in situ, аналогично тому как было описано выше. Такой поход к определению последовательности нуклеотидов гена на основании последовательности аминокислот белка, кодируемого этим геном, получил название обратной трансляции.

Повторный скрининг.

Часто при первичном отборе клоны на чашках Петри вырастают настолько плотно, что после гибридизации с зондом бывает трудно выделить с первого раза бактерии, относящиеся к одному клону или фаговые частицы одной бляшки, которые дали положительный сигнал во время проведения первого раунда отбора. В этом случае бактериальные клетки или фаговые частицы, выделенные из зоны сигнала, рассевают до отдельных колоний или бляшек и используют во втором раунде отбора. Как правило с помощью такого простого подхода удается «расчистить» нужные клоны и выделить их в гомогенном состоянии.

Субклонирование рекомбинантных ДНК.

При субклонировании вставку рекомбинантной ДНК, выделенную из вектора изолированного клона, переносят в новый вектор, который дает возможность её исследования в более простых условиях и с затратой меньших усилий. Если вставка была получена в фаговом, космидном векторе или с использованием искусственной хромосомы, что предполагает ее большой исходный размер, то она может быть переклонирована по частям в плазмидном векторе, и это может значительно облегчить ее дальнейшее исследование, например с помощью секвенирования.

Микроматрицы и микрочипы ДНК

Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии нуклеиновых кислот в последнее время становится использование микроматриц ДНК для анализа нуклеотидных последовательностей. В этой группе методов на небольшой по размеру поверхности стекла или другого твердого носителя иммобилизуют в виде правильно расположенных микропятен небольшие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов (чаще всего синтетические олигонуклеотиды или кДНК), которые далее используют для гибридизации с анализируемыми образцами нуклеиновых кислот. При совпадении первичной структуры ДНК микропятна и анализируемого образца на поверхности стекла образуются правильные ДНК–ДНК-гибриды, которые обнаруживаются по появлению в данных участках микроматрицы сигналов, например в виде микроскопической флуоресцирующей точки или по тушению флуоресценции исходно меченых последовательностей. Такие кусочки твердого носителя с нанесенными на них микроматрицами ДНК получили название микрочипов ДНК.

Методы создания микроматриц ДНК

Для нанесения нуклеиновых кислот на поверхность подложки в основном используют три подхода: короткие олигонуклеотиды синтезируют прямо на ее поверхности, а также прикрепляют к ней предварительно полученные фрагменты ДНК ковалентными или нековалентными связями.

При альтернативном подходе микроматрицы олигонуклеотидов синтезируют на подложке с использованием технологии струйных принтеров. В этом случае головка принтера движется вдоль подложки и, в соответствии с заложенной программой, наносит на необходимые участки небольшие количества раствора с фосфорамидитными производными нуклеотидов из индивидуальных резервуаров. Этапы снятия защитных групп и промывания производятся так же, как и при обычном твердофазном синтезе олигонуклеотидов. Эффективность каждого этапа синтеза в этом случае может превышать 99%, что позволяет синтезировать олигонуклеотиды длиной до 40 оснований с суммарным выходом ~67% (40 этапов с выходом 99% на этап).

Еще одной разновидностью методов создания микроматриц является синтез индивидуальных олигонуклеотидов, их очистка и нанесение с помощью микроробота на поверхность подложки с адгезивным покрытием. Однако создание этим способом микроматриц, содержащих тысячи индивидуальных элементов, – очень трудоемкий процесс.

Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и прикладных исследованиях

Определение первичной структуры и картирование ДНК являются основными направлениями использования микроматриц олигонуклеотидов в настоящее время. Прямое секвенирование генов с помощью олигонуклеотидных микрочипов сдерживается необходимостью применения мягких условий гибридизации, при которых происходит внутреннее спаривание нуклеотидов как в зондах, так и в анализируемых частях генов, что часто является причиной неправильной интерпретации получаемых данных. Тем не менее, на основании результатов гибридизации продуктов ПЦР-амплификации частей клонов геномных библиотек с микроматрицами олигонуклеотидов удается осуществлять достаточно эффективное упорядочивание клонов друг относительно друга. Продемонстрирована возможность осуществления биохимических манипуляций с ДНК, иммобилизованных на микрочипах, с использованием ДНК-полимераз и эндонуклеаз рестрикции. Такие воздействия применяют параллельно с гибридизацией для получения дополнительной информации об анализируемых ДНК.

Исследование генетического полиморфизма ДНК. Более информативными оказываются результаты использования микроматриц ДНК для оценки генетического полиморфизма родственных геномов. Способность зондов гибридизоваться с ДНК микроматриц сильно изменяется при наличии даже единственного неспаренного нуклеотида в гибридах зонд–мишень. Это позволяет с высокой эффективностью осуществлять поиск полиморфизмов в сравниваемых геномах даже на уровне различий в отдельных нуклеотидах.