Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) (стр. 5 )

Исследование экспрессии генов с использованием микроматриц ДНК. Технология микрочипов ДНК позволяет осуществлять одновременный мониторинг за экспрессией большого числа генов (expression profiling). С этой целью для генов с известными последовательностями нуклеотидов создается микроматрица сегментов кДНК длиной 0,5–1,0 т. п.о. Из анализируемых образцов (например опухоли и здоровой ткани) выделяют суммарную мРНК, которую с помощью обратной транскрипции превращают в кДНК, метят флуоресцентными красителями и используют для последующей конкурентной гибридизации с зондами, нанесенными на микроматрицу. Интенсивность флуоресценции отдельных элементов микроматрицы после образования гибридов позволяют качественно характеризовать различия в уровнях экспрессии конкретных генов в анализируемых образцах. Например, отсутствие конкуренции за образование гибридов со стороны кДНК нормальной ткани может говорить о транскрипции в опухоли новых генов, не экспрессирующихся в нормальных клетках.

Такой подход успешно использовали для характеристики ответа клеток в культуре или in vivo по изменению уровней экспрессии генов на различные внешние стимулы, включая тепловой шок, воспалительные реакции и канцерогенные воздействия. Помимо известных генов в мониторинг иногда включают и случайные клоны кДНК, что позволяет идентифицировать новые гены, экспрессия которых ассоциирована с патологическими состояниями органов и тканей. С использованием микроматриц кДНК в современный анализ могут быть одновременно включены до 10000 экспрессирующихся генов.

Микроматрицы олигонуклеотидов также применяют для определения профилей экспрессии генов. В этом случае для повышения эффективности мониторинга одновременно в разных элементах матрицы используют несколько олигонуклеотидов, комплементарных различным частям анализируемых кДНК. С помощью этого подхода недавно был определен профиль экспрессии 6800 генов в культивируемых клетках фибросаркомы в присутствии g-интерферона.

Футпринтинг

Принцип защиты последовательности нуклеотидов рестрикционных фрагментов ДНК белками от действия агентов, расщепляющих ДНК, лежит в основе футпринтинга – метода, позволяющего определять места специфических контактов белков с ДНК. Этот метод оказался особенно полезным для точной локализации последовательностей нуклеотидов генов, взаимодействующих с регуляторными белками, активаторами и репрессорами, а также с самими РНК-полимеразами, и своему появлению целиком обязан генной инженерии. Рестрикционные фрагменты ДНК, последовательности нуклеотидов которых известны, метят по одному из концов 32P и инкубируют с исследуемыми белками. Образовавшиеся комплексы белок–ДНК подвергают действию агентов, гидролизующих ДНК, например ДНКазы I, в условиях неполного расщепления ДНК, и полученные продукты гидролиза разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей авторадиографией. В отсутствие белка на авторадиограммах наблюдают появление полного набора фрагментов ДНК в том виде, как это имеет место при обычном секвенировании ДНК. Участки ДНК, защищенные белком от действия ДНКазы, идентифицируются по исчезновению полос, соответствующих продуктам статистического расщепления ДНК, концы которых попадают в область связывания с белком. При этом на электрофоретических дорожках появляются характерные пропуски (или "следы" – footprints), что и дало название всему методу.

Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды

Главный механизм, лежащий в основе функционирования системы антисмысловых РНК, прост и опирается на известный феномен взаимодействия двух комплементарных друг другу молекул нуклеиновых кислот с образованием двухцепочечных РНК–РНК - или ДНК–РНК-гибридов. Оказалось, что взаимодействие с мРНК комплементарного ей полинуклеотида или олигонуклеотида (которые могут быть транскриптами незначащей цепи ДНК, т. е. противоположной той, с которой произошла транскрипция этой мРНК) может блокировать ее трансляцию рибосомами и нарушать экспрессию всего гена на уровне трансляции.

Механизм действия антисмысловых РНК

Многочисленные исследования антисмысловых РНК показали, что конечным результатом их действия, как правило, является высокоспецифическое ослабление экспрессии генов, мРНК которых является мишенью действия антисмысловых РНК. При использовании олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных различным частям мРНК подавление трансляции мРНК достигалось главным образом за счет ее расщепления РНКазой H в месте образования РНК–ДНК-гибрида.

Взаимодействие антисмысловых РНК с 5’-концевыми нетранслируемыми последовательностями мРНК может изменять пространственную структуру мРНК таким образом, что инициирующий AUG-кодон становится недоступным рибосомам. Не исключено, что в ряде случаев антисмысловые РНК могут блокировать экспорт мРНК из ядра в цитоплазму, особенно когда они присутствуют в молярном избытке. Это также может быть одной из причин подавления синтеза соответствующих белков.

Наилучшие результаты по блокированию экспрессии генов были получены в том случае, когда гены антисмысловых РНК находились в клетках в виде множественных экспрессируемых копий, встроенных в геном, или под контролем сильных промоторов. Дуплексы антисмысловых РНК и мРНК, образующиеся в клетках, которые экспрессируют антисмысловые РНК, являются субстратом для расплетающего фермента (unwindase), который присутствует в клетках всех типов тканей животных. Расплетающий фермент производит дезаминирование 25–40% остатков аденина в обеих цепях дуплекса с образованием инозина. Остатки инозина образуют комплементарные пары с остатками гуанина, поэтому в процессе такой модификации происходит изменение кодирующих свойств мРНК и ее трансляция может приводить к образованию нефункциональных белков. Таким образом, и в данном случае антисмысловые РНК опосредуют инактивацию комплементарных им мРНК, что является еще одним механизмом их ингибирующего действия на экспрессию генов.

Рибозимы

Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК характеризуется высокой специфичностью. Это обусловлено большой точностью процесса РНК-РНК-гибридизации, основанной на комплементарном взаимодействии друг с другом протяженных последовательностей нуклеотидов. Однако сами по себе антисмысловые РНК не инактивируют необратимо мРНК-мишени, и для подавления экспрессии соответствующих генов требуются высокие (по крайней мере, эквимолярные по отношению к мРНК) внутриклеточные концентрации антисмысловых РНК. Эффективность действия антисмысловых РНК резко повысилась после того, как в их состав были введены молекулы рибозимов – коротких последовательностей РНК, обладающих эндонуклеазной активностью. Рибозимами в широком смысле называют молекулы РНК, обладающие любой ферментативной активностью.

Нестабильность РНК является одним из основных ограничений, препятствующих эффективному их использованию in vivo в качестве лекарственных средств. Поскольку рибозимы представляют собой короткие молекулы, которые можно получать в результате химического синтеза, химические модификации этих олигонуклеотидов рассматриваются как одна из перспективных возможностей повышения их устойчивости к нуклеазам.

Репарация мутантных РНК с помощью рибозимов

Аутосплайсинг транскриптов, содержащих интроны группы I, начинается с расщепления фосфодиэфирной связи между 5’-концевым экзоном и прилегающим к нему интроном, сопровождаемого полным удалением интрона и лигированием фланкирующих его экзонов, приводящим к восстановлению непрерывной структуры РНК. Идея, лежащая в основе использования рибозимов для репарации РНК, проста. Достаточно лишь с помощью генно-инженерных методов к 3’-концу рибозима присоединить вместо 3’-концевого экзона любую другую последовательность, чтобы она соединялась с последовательностью 5’-концевого экзона в строго определенной точке с образованием гибридной молекулы РНК. Поскольку сайт взаимодействия рибозима с РНК во время транс-сплайсинга и положение точки разрыва РНК целиком определяются внутренней направляющей последовательностью рибозима (internal guide sequence – IGS), присоединение новой 3’-концевой последовательности можно осуществлять практически в любом месте РНК-мишени (рис. II.28). Таким образом, для репарации мутационного повреждения в экзоне 2 на уровне РНК IGS делают комплементарной участку РНК-мишени, локализованному выше точки повреждения (в рассматриваемом примере – А) на стыке экзонов 1 и 2. Экзон 2 дикого типа соединяют с рибозимом, который после взаимодействия с РНК-мишенью вырезает из нее мутантную последовательность экзона 2 и заменяет на эквивалентную последовательность дикого типа. В результате комплекс рибозима и репарированной РНК распадается и обновленная РНК вовлекается в трансляцию.

Дезоксирибозимы

Несмотря на прогноз о большой каталитической инертности ДНК, в течение последних пяти лет ферментативная активность была обнаружена и у ее молекул, правда пока только в искусственных условиях. Молекулы ДНК, обладающие ферментативной активностью, получили название дезоксирибозимов. К настоящему времени описана способность дезоксирибозимов расщеплять, лигировать и фосфорилировать молекулы ДНК, метилировать порфирины или осуществлять гидролиз РНК. Получены дезоксирибозимы с активностями РНКазы, которые используют в качестве кофакторов аминокислоты, ионы металлов, а также не требуют кофакторов вообще. При этом Mg2+-зависимые дезоксирибозимы расщепляют РНК со скоростью, сопоставимой с таковой природных рибозимов (kкат= 10 мин-1).

Аптамеры

Аптамерами называют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений. Олигонуклеотидные аптамеры с требуемыми свойствами выделяют из библиотек случайных последовательностей методами селекции in vitro, используя их способность специфически взаимодействовать с соответствующими иммобилизованными лигандами. Такие соединения находят применение в фундаментальных исследованиях молекулярных механизмов взаимодействия нуклеиновых кислот с лигандами, и их начинают использовать для обнаружения повреждений в ДНК, для воздействия на экспрессию генов, а также в качестве модулей при конструировании рибозимов, обладающих аллостерическими свойствами. В настоящее время получены аптамеры как рибо-, так и дезоксирибонуклеотидной природы, которые образуют специфические комплексы с разнообразными химическими соединениями, включая большинство аминокислот, нуклеотиды и их производные, антибиотики, биологически активные пептиды, органические красители, дофамин, теофиллин, и многие другие органические соединения, имеющие биологическое значение.