Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) (стр. 6 )

Недавно была реализована идея использования аптамеров для введения флуоресцентной метки в молекулы РНК, синтезируемые in vivo, для наблюдения за экспрессией соответствующих генов.

Исключительно важные результаты могут быть получены при скрининге in vitro аптамеров среди пула фрагментов природных РНК. В этом случае библиотеки природных последовательностей могут быть использованы для поиска доменов нуклеиновых кислот, специфически взаимодействующих с известными молекулами биогенного происхождения, например белками ретровирусов, для которых неизвестны РНК-мишени клетки-хозяина. Не исключено, что в ходе такого рода исследований у РНК или их фрагментов будут обнаружены новые внутриклеточные функции, связанные с метаболизмом важных биологических кофакторов, включая ATP, GTP, FAD и NAD+.

Ферментативная активность РНК

Молекулы РНК могут распознавать аминокислоты. По крайней мере, у двух природных РНК (как и у обсуждавшихся выше искусственных аптамеров) обнаружены структурные элементы, способные связывать аминокислоты. Кроме того, известно, что редактирующая функция аминоацил-тРНК-синтетаз (разрушение связи между ошибочно соединенными аминокислотой и тРНК) включает опосредованное РНК распознавание аминокислот. Предполагается, что в процессе редактирования имеют место непосредственные контакты РНК с аминокислотами.

Спонтанное аминоацилирование РНК. Процесс аминоацилирования тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами in vivo происходит в два этапа: вначале фермент активирует соответствующую аминокислоту с образованием 5’-аминоациладенилата, который затем атакуется 2’(3’)-концом тРНК, что сопровождается возникновением соответствующей ковалентной связи между аминокислотой и тРНК. Нагруженные таким образом молекулы тРНК далее используются рибосомами в качестве субстратов при образовании пептидных связей.

Перенос ацильных групп, катализируемый РНК. Повсеместное использование аминоациладенилатов и аминоацилированных тРНК при трансляции в природных условиях указывает на возможную роль РНК в ранних системах трансляции. Действительно, способность рибозимов к спонтанному аминоацилированию позволяет предполагать и возможность их участия в следующем этапе биосинтеза белка – переносе аминоацильной группы с донорной молекулы на свою собственную акцепторную, т. е. в осуществлении аминоацилтрансферазных реакций.

Анализ первичной структуры таких рибозимов обнаружил вблизи 3’-концов наличие высококонсервативной внутренней матрицы, которая обладала способностью связывать и приводить в контакт друг с другом 2’(3’)-конец донорной молекулы и акцепторный 5’-конец своей собственной полинуклеотидной цепи. Рибозимы оказались не просто матрицей. Они действительно катализировали перенос ацильных групп, ускоряя этот процесс в 103 раз (kкат = 9,4·10-2 мин-1) по сравнению с системами, в которых была задействована только матрица. Интересно, что два неправильно спаренных основания G–U в месте стыковки дуплексов донор–матрица и акцептор–матрица оказались необходимыми для функционирования рибозимов, стимулируя реакцию переноса ацильной группы в 10 раз.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Принципиальная схема ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Проведение ПЦР

С помощью ПЦР амплифицируются короткие (до 10 kb[1]) участки ДНК с известными концами.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

·  ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

·  Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.

·  Термостабильная ДНК-полимераза.

·  Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T).

·  Буферный раствор.

ПЦР проводят в термоциклёре — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно, с точностью не менее 0,1°С.

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 букв. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг [2]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже).

Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Она определяется, как температура, при которой половина сайтов связывания праймера занята. Tm можно приблизительно определить по формуле, где nX — количество нуклеотидов Х в праймере. Если праймер короткий и Tm мала, то праймер может оказаться частично комплементарен другим участкам матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Сверху температура плавления ограничена оптимумом действия полимеразы, активность которой падает при температуре выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

·  GC-состав ~ 40—60 %;

·  близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);

·  отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек[3] и димеров[4];

·  желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (рис. 2).

1.  Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров.

2.  Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин.

3.  ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°С. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10—15 мин.

Рис. 2: Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94—96°C. (2) Отжиг при 68°C (например). (3) Элонгация при 72°C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается.

Разновидности ПЦР

·  «Вложенная» ПЦР (Nested PCR(англ.)) — применяется для уменьшения доли побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

·  «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR(англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить фланкирующие последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим лигированием. В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

·  ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR(англ.)) — используется для амплификация, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят транскрипцию молекулы РНК с помощью обратной транскриптазы и получют кДНК. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.

·  Ассиметричная ПЦР (англ. Assymetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

·  Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.

·  Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.

·  Touchdown ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) — с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.

·  ПЦР на колониях (англ. Colony PCR) — бактериальные клоны проверяют на наличие продуктов лигирование. Колонии отбирают с чашки с агарозным гелем, добавляют праймеры и выдерживают при 95°С продолжительное время, чтобы разрушить клеточные стенки бактерий.

·  ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR)

·  ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 kb и больше). Используют две полимеразы, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.

·  RAPD PCR (надо написать)

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые буквы. Например, последовательность праймера может быть таким: ...ATH..., где Н - А, Т или С.

Клонирование генов

Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов из одного организма и вставки их в другой. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужерожный ген в другой организм. В качестве векоторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или белка. Это называется экспрессией гена. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельком хозяйстве, медицине и др.