Оптическая микроскопия (стр. 3 )

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) заключается в наблюдении под М. зелено-оранжевого
свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или
не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. При этом методе в оптическую схему М.
вводятся два светофильтра. Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает
от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают
люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных
красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная
люминесценция). Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу
наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В
люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху (через
объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный
конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной
микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен возбуждение свечения

препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.

Метод широко применяется. в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Обилие и разнообразие применений связаны с чрезвычайно высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне, а также ценностью информации о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения.

Для слайда?

В зависимости от характера объекта используют различные способы микроскопии: обычная световая микроскопия используется для изучения окрашенных препаратов (амплитудные объекты); для изучения неокрашенных (фазовых) препаратов, (живых клеток и бактерий) применяют фазово-контрастную и интерференционную (ДИК) микроскопию, темнопольную микроскопию применяют для наблюдения сильно рассеивающих свет живых микробов (спирохеты), для наблюдения флюоресцирующих объектов (иммунофлюоресценция, флюорохромирование) - люминесцентную (флюоресцентную) микроскопию. Гораздо реже для изучения биологических объектов используют поляризационную и другие специальные способы микроскопии.

1. Обычная световая микроскопия - окрашенные препараты.

2.  Фазово-контрастная микроскопия - неокрашенные препараты, в том числе живые клетки

3.  Интерференционная микроскопия - дифференциальный интерференционный контраст по
Номарскому (ДИК) - неокрашенные препараты

4.  Темнопольная микроскопия-неокрашенные светорассеивающие мелкие объекты
(лептоспиры, бледная спирохета и т. п.)

Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность М., т. е. понизить его предельное разрешение, которое зависит (см. выше) от длины волны l применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ лучей l = 400—250 нм, тогда как для видимого света l = 700—400 нм). Но главным образом этот метод расширяет возможности микроскопических исследований за счёт того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в УФ области обладает, например, ряд веществ, содержащихся в растительных и животных клетках (пуриновые основания, пиримидиновые основания, большинство витаминов, ароматические аминокислоты, некоторые липиды, тироксин и др.); это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов цитохимического анализа.

Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электронно-оптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Распространён следующий способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (например, синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.

Метод наблюдения в инфракрасных (ИК) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования или с помощью электроннооптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например тёмных стекол, некоторых кристаллов и минералов и пр.

Микрофотографирование и видеосъёмка, т. е. получение с помощью М. изображений на светочувствительных слоях, широко применяется в сочетании со всеми другими методами микроскопического исследования. Оптическая система М. при микрофото - и микрокиносъёмке требует некоторой перестройки - - иной по сравнению с визуальным наблюдением фокусировки окуляра относительно изображения, даваемого объективом. Многие современные М. имеют постоянные (вмонтированные) устройства для микрофотографии, которые позволяют осуществлять такую перестройку и проектировать изображения препаратов на фотопластинку или плёнку (а большинство М. может быть с этой целью оснащено дополнительными принадлежностями). Микрофотография незаменима при документировании исследований, при изучении объектов в невидимых для глаза УФ и ИК лучах (см. выше), а также объектов со слабой интенсивностью свечения. Микрокиносъёмка важна при исследовании процессов, развёртывающихся во времени (жизнедеятельности тканевых клеток и микроорганизмов, роста кристаллов, протекания простейших химических реакций и т. п.).

Основные узлы микроскопа.

В микроскопе различают механическую и оптическую части.

Механическая часть представлена штативом (состоящим из основания и тубусодержателя) и укрепленным на нем тубусом с револьвером для крепления и смены объективов. К механической части относятся также: предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

К механической части относится штатив, состоящий из основания и тубусодержателя

Основание служит опорой микроскопа и несет всю конструкцию штатива. В основании микроскопа находится также гнездо для зеркала или встроенный осветитель. Тубусодержатель служит для крепления тубуса микроскопа;

Тубус микроскопа - узел, служащий для установки объективов и окуляров на определенном расстоянии друг от друга. Он представляет собой трубку, в верхней части которой находится окуляр или окуляры, а в нижней - устройство для крепления и смены объективов. Обычно это револьвер с несколькими гнездами для быстрой смены объективов различного увеличения. В каждом гнезде револьвера объектив закреплен таким образом, что он всегда остается центрированным по отношению к оптической оси микроскопа. В настоящее время конструкция тубуса существенно отличается от прежних микроскопов тем, что части тубуса несущие окуляры и револьвер с объективами, конструктивно не связаны. Роль средней части тубуса может выполнять штатив. Механическая длина тубуса биологических микроскопов обычно составляет 160мм. В тубусе между объективом и окуляром могут располагаться призмы, изменяющие направление хода лучей и промежуточные линзы, изменяющие окулярное увеличение и оптическую длину тубуса.

Существуют различные взаимозаменяемые конструкции участка тубуса, несущего окуляры (прямой и наклонный) и различающиеся по количеству окуляров (окулярные насадки):

·  монокулярные - с одним окуляром, для наблюдения одним: глазом;

·  бинокулярные - с двумя окулярами, для одновременного наблюдения двумя глазами, которые могут различаться по конструкции в зависимости от модели микроскопа;

·  тринокулярные - с двумя окулярами и проекционным выходом, позволяющие одновременно с визуальным наблюдением двумя глазами, проецировать изображение препарата соответствующей оптикой на фото - или кинопленку, мишень телевизионной камеры или другой приемник изображения.

Помимо тубу содержателя с тубусом к механической части микроскопа относятся:

-  кронштейн для крепления предметного столика;

-  предметный столик, служащий для размещения препаратов и горизонтального
перемещения в двух перпендикулярных направлениях относительно оси микроскопа.
Конструкция некоторых столиков позволяет вращать препарат. Вертикальное перемещение
предметного столика осуществляется макро - и микромеханизмом.

- приспособления для крепления и вертикального перемещения конденсора и его центрировки, а также для помещения светофильтров.

В большинстве современных микроскопов фокусировка осуществляется путем вертикального перемещения предметного столика с помощью макро - и микромеханизма при неподвижном тубусодержателе. Это позволяет установить на тубусодержатель различные насадки (микрофото и т. п.). В некоторых конструкциях микроскопов, предназначенных для работы с микроманипулятором, фокусировка осуществляется вертикальным перемещением тубусодержателя при неподвижном предметном столике.

Оптическая часть представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе и встроенного осветителя с низковольтной лампой накаливания и трансформатором. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса.

Тип применяемого конденсора зависит от выбора метода наблюдения. Светлопольные конденсоры и конденсоры для наблюдения по методу фазового или интерференционного контраста представляют собой сильно отличающиеся одна от другой двух - или трёхлинзовые системы. У светлопольных конденсоров числовая апертура может достигать 1,4; в их состав входит апертурная ирисовая диафрагма, которая иногда может смещаться в сторону для получения косого освещения препарата. Фазово-контрастные конденсоры снабжены кольцевыми диафрагмами. Сложными системами из линз и зеркал являются темнопольные