Оптическая микроскопия (стр. 6 )

В устройствах для особо точных измерений (например, геодезических, астрономических и т. д.) отсчёты на линейных шкалах и разделённых кругах угломерных инструментов производят с помощью специальных отсчётных М. - - шкаловых М. и М.-микрометров. В первых имеется вспомогательная стеклянная шкала. Её изображение регулировкой увеличения объектива М. делают равным наблюдаемому интервалу между делениями основной шкалы (или круга), после чего, отсчитывая положение наблюдаемого деления между штрихами вспомогательной шкалы, можно непосредственно определить его с точностью около 0,01 интервала между делениями. Ещё выше точность отсчётов (порядка 0,0001 мм) в М.-микрометрах, в окулярной части которых помещен нитяной или спиральный микрометр. Увеличение объектива регулируют так, чтобы перемещению нити между изображениями штрихов измеряемой шкалы соответствовало целое число оборотов (или полуоборотов) винта микрометра.

Помимо описанных выше, имеется значительное число ещё более узко специализированных типов М., например М. для подсчёта и анализа следов элементарных частиц и осколков деления ядер в ядерных фотографических эмульсиях, высокотемпературные М. для изучения объектов, нагретых до температуры порядка 2000 °С, контактные М. для исследования поверхностей живых органов животных и человека (объектив в них прижимается вплотную к изучаемой поверхности, а фокусировка М. производится специальной встроенной системой).

в качестве важной составной части используются в сложных установках в сочетании с другими приборами. Примерами могут служить предназначенные для определения спектров поглощения препаратов микроспектрофотометрические установки (см. Спектрофотометр), в которых М. объединены со специальными монохроматорами и устройствами, измеряющими световые потоки; ряд приборов, применяемых в офтальмологии; компараторы, микрофотометры и многие др.

Микроскопическая техника в биологии, совокупность методов и приёмов для изучения с помощью оптического и электронного микроскопов строения, жизнедеятельности, развития, химического состава и физических свойств клеток, тканей и органов. М. т. включает: подготовку живых объектов к микроскопическому исследованию и его проведение, изготовление постоянных (неживых) препаратов; микро-, гисто - и цитохимические исследования; особые методы подготовки препаратов для электронной микроскопии.

Прижизненные наблюдения в проходящем свете осуществляются на простейших, мелких яйцах, культивируемых клетках и тканях, прозрачных участках тела многоклеточных (например, на кровеносных сосудах в плавательной перепонке лягушки). В отражённом свете под микроскопом можно изучать поверхностные структуры клетки, ткани, органа. Для цитофизиологических наблюдений пользуются прижизненным окрашиванием, дающим представление о рН клетки и её органоидов, а также о физиологическом состоянии живого объекта. Для прижизненных наблюдений требуются: нагревательный столик (рис. 1) особый термостат, перестраиваемый на заданную температуру в широком температурном диапазоне; стеклянные, пластмассовые, кварцевые, металлические или другие камеры (рис. 2) с постоянной или проточной средой требуемого состава. Наблюдаемые объекты (чаще клетки однослойных культур) могут длительное время оставаться нормальными при достаточном снабжении их питательными веществами и кислородом. Одна из задач М. т. для живых объектов - - повышение контрастности изображения, для чего используется, например, фазово-контрастное устройство. Интерференционная микроскопия дополнительно даёт сведения о толщине объекта, концентрации в нём сухого вещества, содержании воды и показателе преломления. Прижизненные наблюдения проводятся также в тёмном поле (ультрамикроскопия) с использованием специального конденсора; при этом объект освещается сбоку, а фон остаётся тёмным. Темнопольное устройство позволяет увидеть чрезвычайно мелкие (например, коллоидные) частицы. С помощью поляризационного микроскопа можно изучать объекты (или их элементы), обладающие оптической анизотропией. Для исследования как живых, так и неживых биологических объектов применяется люминесцентная микроскопия, особенно для изучения вторичной флуоресценции, возникающей при окраске клеток и тканей слабыми концентрациями флуорохромов (акридиновый оранжевый, эритрозин, родамин и др.). Различия во флуоресценции отдельных химических веществ (нуклеиновых кислот, липидов) позволяют изучать их локализацию, динамику изменений и даже количество изучаемого вещества. Соединение белка с флуорохромом (изоцианат флуоресцеина) и связывание этого вещества с антителами (см. Иммунофлуоресценция) даёт возможность выяснить локализацию антигенов, судьбу антител и др. вопросы иммунологии. Недавно получил распространение метод микроскопии живых и неживых объектов в ультрафиолетовых лучах с использованием специальной кварцевой оптики. Наблюдения над живыми объектами документируются микрокиносъёмкой, особенно замедленной.

Для получения постоянных препаратов объект фиксируют, т. е. убивают так, чтобы он сохранил по возможности неизменной структуру. Наиболее распространённые фиксаторы - формалин, спирт, четырёхокись осмия, а также комбинированные фиксаторы — смеси веществ. Фиксация (особенно для электронной микроскопии) осуществляется также методом лиофилизации, высушиванием мазков (например, крови) или отпечатков. При работе с клеточными культурами используются пластинки из стекла или слюды, на которых клетки располагаются в один слой. В других случаях для микроскопии пользуются срезами, получаемыми на микротоме, объект при этом обезвоживают и заливают в парафин, целлоидин, желатину или замораживают. Для электронной микроскопии материал обычно

фиксируют чётырёхокисью осмия, а заливку производят в акриловые мономеры, которые полимеризуют соответствующим катализатором, или в эпоксидные смолы.

Микро-, гисто - и цитохимические исследования. Для повышения контрастности препаратов, наблюдаемых в оптический микроскоп, применяют красители, избирательно окрашивающие разные клеточные структуры. Особенно широко используются красители в гистохимии. Гистохимические реакции основаны на образовании некоторыми веществами нерастворимых и иногда окрашенных осадков, обнаруживаемых микроскопически. Ферменты обнаруживаются в клетках по активности при их воздействии на определённые субстраты, находящиеся в ткани или добавленные извне. Интенсивность гистохимических реакций часто изучают и оценивают визуально. Более совершенны количественные методы оценки, например подсчёт числа клеток с определённой интенсивностью окраски, числа зёрен осадка, а также авторадиография, цитофотометрия.

При электронной микроскопии вирусов, микроорганизмов, ультратонких срезов более крупных объектов их контрастность усиливают напылением частиц металла. Для негативного контраста объект помещают в раствор более плотного вещества (например, фосфорно-вольфрамовой кислоты), заполняющего промежутки между изучаемыми частицами, которые выглядят светлыми на тёмном фоне. Контраст усиливают также, применяя «электронные красители» (четырёхокись осмия, уранил и др.), избирательно связывающиеся с некоторыми участками объекта. При использовании ферритина зёрна его, содержащие молекулы железа, обнаруживаются в составе клеточных структур.

Прижизненное окрашивание, витальное окрашивание, метод окрашивания живых клеток специальными красителями, применяемыми в нетоксических концентрациях. Такими красителями могут быть основные, например нейтральный красный и метиленовый синий (хромофорная группа связана с катионом), и кислотные, например феноловый красный и цианол (хромофорная группа связана с анионом). Проникая в клетки животных, одни красители диффузно окрашивают цитоплазму, другие красители откладываются в виде гранул в области Гольджи комплекса, оставляя ядро и цитоплазму неокрашенными. При повреждении клеток окрашивание диффузными красителями усиливается, гранулярные же теряют способность образовывать гранулы и окрашивают цитоплазму и ядро диффузно. В живых клетках растений красители конденсируются в вакуолях, в мёртвых — прокрашиваю весь протопласт. Эти особенности дают возможность отличать мёртвые и поврежденные клетки от живых (см. Паранекроз}. Количественный учёт связанного клетками красителя позволяет судить о более тонких сдвигах в их функциональном состоянии. Прижизненная цитофотометрия используется для определения количества красителя, связанного отдельной клеткой и даже разными её участками. Кислотные гранулярные красители применяются для выявления элементов ретикулоэндотелиальнои системы и изучения их состояния; метиленовый синий — для избирательной окраски отдельных нейронов; некоторые служат индикаторами концентрации водородных ионов и окислительно-восстановительного потенциала. Распределение в клетках красителей из группы флуорохромов исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа; они служат для оценю жизнеспособности клеток и для некоторых цитохимических исследований.

И. П. Суздальская

Рис. 2. Камера для культивирования клеток и прижизненных наблюдений за их ростом и развитием: 1 — камера в собранном виде; 2 — камера в разобранном виде: а — верхняя стальная пластина; б — резиновая прокладка; в — покровное стекло; г — средняя секция; д - нижняя стальная пластина; 3 — часть средней секции снизу: е — каналы; ж -резервуары.

Цитофотометрия (от цито,.., фото.., и ...метрия), один из методов количественной цитохимии, позволяющий определять химический состав клеток в гистологическом препарате по поглощению света клетками. Через препарат пропускают монохроматическое излучение (свет) в виде пучка, диаметр которого соизмерим с диаметром клетки или внутриклеточной структуры. Концентрацию (С) исследуемого вещества в клетке находят по Бугера —Ламберта — Бера чакону: Ф = Фое-ксh, где Ф — интенсивность света после его прохождения через клетку; Фо — интенсивность падающего на клетку света; к — удельный монохроматического поглощения, показатель исследуемого вещества (рассчитанный на единицу его концентрации) при данной длине волны света; h — длина пути, проходимого светом в клетке (практически — толщина гистологического препарата). Найдя концентрацию вещества внутри клетки и измерив её объём, можно рассчитать общее количество этого вещества в клетке. Ц. разработана шведским гистологом Т. Касперсоном в 1936. Чувствительность метода порядка 10-12 г. снижается из-за ошибки измерения вследствие неравномерности распределения вещества внутри клетки; для предотвращения этой ошибки используют т. н. сканирующую, или Ц. при двух разных длинах волн излучения. Ультрафиолетовая (УФ) Ц. позволяет определять в неокрашенных препаратах количество нуклеотидов, нуклеиновых кислот, белков по естественному поглощению ими УФ-лучей. Шире распространена Ц. в видимой области спектра; при этом используют естественную окраску отдельных веществ или чаще искусственное окрашивани< препаратов специфическими гистохимическими красителями, связывающимися с химическими компонентами клетки в определённых количествах. С помощью большинства красителей выявляют в клетке нуклеиновые кислоты, белки и их отдельные реактивные группы, а также определяют активность ряда ферментов.